負(fù)壓吸引裝置抽取大鼠腦脊液方法的改良

王 偉，李東斌，羅秀梅，劉競麗

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)科，南寧 530021)

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、損傷及其相關(guān)藥理學(xué)研究中，常常需要對腦脊液的性狀及成分進(jìn)行分析[1]。在動物實驗中，大鼠是常用的實驗動物，然而大鼠腦室及蛛網(wǎng)膜下腔狹小，血管豐富，采集腦脊液時易損傷血管，造成血液污染，往往影響后續(xù)實驗結(jié)果[2]；并且腦脊液抽取過程復(fù)雜，容易傷及延髓致大鼠死亡。目前常用的腦脊液抽取方法包括經(jīng)皮延髓池穿刺法、經(jīng)皮經(jīng)側(cè)腦室穿刺法、直視下劃破硬脊膜抽取腦脊液法、直視下微量進(jìn)樣器經(jīng)硬脊膜穿刺抽取腦脊液法等等。經(jīng)皮延髓池穿刺法對大鼠的創(chuàng)傷性小，能在短時間內(nèi)完成腦脊液的收集，但技術(shù)難度高，成功率低。Li等[3]提出的腦脊液收集裝置通過負(fù)壓吸引可明顯提高經(jīng)皮延髓池穿刺法的成功率；本研究通過對該裝置進(jìn)行改良，旨在進(jìn)一步提高大鼠腦脊液收集的成功率。

注：A：改良負(fù)壓吸引裝置的構(gòu)造；B：由1 mL注射器針帽制作成的限位器；C：流量調(diào)節(jié)器；D：大鼠腦脊液抽取示意圖；E：穿刺針頭打磨成45°角，尖端鈍化；F：打磨前的穿刺針頭。圖1 改良負(fù)壓吸引裝置的制作Note. A: Structure of the modified suction device. B: The limitator made out of the protective sheath of a 1-mL syringe. C: A flow regulator for adjustment of the intensity of negative pressure. D: Schematic diagram of rat CSF collection. E: The needle tip is rubbed to be about 45° and less sharp for puncture. F: Shape of the needle tip before modification.Fig.1 Construction of the modified suction device with negative pressure

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD大鼠36只，雄性，體重250～280 g，清潔級，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供 [SCXK (桂) 2014-0002]。腦脊液抽取在廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心實驗室內(nèi)進(jìn)行 [SYXK (桂) 2014-0003]，動物飼養(yǎng)按照實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。大鼠按腦脊液抽取方法不同隨機分成3組，每組12只。

1.2 主要試劑與儀器

水合氯醛(中國成都市科龍化工試劑廠，分析純)。1 mL一次性注射器(中國北侖河廣西巨龍醫(yī)療器械有限公司)；26 G一次性靜脈輸液針(中國恩康湖南岳陽民康醫(yī)用材料有限公司)；流量調(diào)節(jié)器取自一次性使用連接管(中國潔瑞山東威高集團醫(yī)用高分子制品股份有限公司)；STT-1大鼠手術(shù)臺(廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf 5417R)。

1.3 實驗方法

1.3.1 改良負(fù)壓吸引裝置的制作

用鋼絲鉗將26 G靜脈輸液針(0.45 × 15 mm，褐色柄)在距針柄4 mm處剪斷，用砂輪打磨斷端，使傾角呈45°，減少其鋒利程度(圖1E、1F)，使穿刺時有更強的突破感并且不易對腦組織及血管造成損傷[4]。在輸液管上距棕色針柄末端5 cm及6 cm處用記號筆預(yù)先做好標(biāo)記(圖1A)，將流量調(diào)節(jié)器(圖1C)套入輸液管末端，卡緊，接入1 mL一次性注射器；用注射器的針帽按圖1B制作成一個限位器，注射器抽成負(fù)壓時將限位器套入活塞尾部，使針管內(nèi)維持恒定的負(fù)壓。

1.3.2 腦脊液的收集

(1)經(jīng)皮穿刺延髓池抽取腦脊液法：用10%的水合氯醛(35 mg/kg，腹腔注射)麻醉大鼠，然后參照富宏等[2]的研究方法進(jìn)行操作。用左手握住大鼠頭部，并將大鼠的頭部向胸部屈曲，右手探及枕骨隆凸與第1頸椎之間的凹陷(枕骨大孔)，沿平行大鼠頭部方向從凹陷處將1 mL注射器針頭小心地刺入小腦延髓池，緩慢抽取腦脊液，后轉(zhuǎn)移至離心管。

注：A：經(jīng)皮穿刺延髓池抽取腦脊液法；B：負(fù)壓吸引裝置穿刺抽取腦脊液法；C：改良負(fù)壓吸引裝置穿刺抽取腦脊液法。圖2 不同腦脊液收集方法示意圖Note. A: Drawing from the cerebellomedullary cistern via percutaneous puncture. B: Using a suction device with negative pressure. C: Using a modified suction device with negative pressure.Fig.2 Diagram of three different methods of cerebrospinal fluid collection in rats

(2)負(fù)壓吸引裝置穿刺抽取腦脊液法：用10%的水合氯醛(35 mg/kg，腹腔注射)麻醉大鼠，用左手握住大鼠頭部，并將大鼠的頭部向胸部屈曲，探及凹陷處，按Li等[3]的方法操作，右手持腦脊液收集裝置的針頭沿大鼠鼻側(cè)方向從第1頸椎上緣緩慢進(jìn)針，當(dāng)有明顯的突破感時停止進(jìn)針，助手打開夾子，腦脊液會被快速地吸引至輸液管內(nèi)，當(dāng)管內(nèi)腦脊液停止流動時再次夾閉輸液管，拔針，取下限位器，將管內(nèi)的腦脊液轉(zhuǎn)移至離心管。

(3)改良負(fù)壓吸引裝置穿刺抽取腦脊液法：按改良前的方法進(jìn)行操作，進(jìn)針后有明顯的突破感時停止進(jìn)針，助手打開流量調(diào)節(jié)器，只給一個較小的負(fù)壓，并根據(jù)腦脊液進(jìn)入管腔的速度調(diào)整調(diào)節(jié)器，使腦脊液緩慢進(jìn)入輸液管，當(dāng)液面達(dá)到標(biāo)志處時，立即關(guān)閉調(diào)節(jié)器，拔針，取下限位器，將管內(nèi)的腦脊液轉(zhuǎn)移至離心管。

1.3.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

對腦脊液進(jìn)行分析時要求有一定的純凈度及采集量，當(dāng)樣本中混有血液將直接影響后續(xù)實驗結(jié)果，故本研究根據(jù)是否有血污染來判斷樣本是否合格，根據(jù)實際情況分為4種情況：①未能成功抽取腦脊液；②抽取的腦脊液混有血液，肉眼觀呈紅色；③抽取的腦脊液肉眼觀透明，離心(4℃，800 r/min，10 min)[5]后管底有紅細(xì)胞沉淀；④抽取的腦脊液肉眼觀透明，離心后未見沉淀。第4種情況視為成功抽取合格腦脊液。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，腦脊液質(zhì)量的比較用完全隨機設(shè)計多樣本秩和檢驗(Kruskal-Wallis法)，兩兩比較用擴展t檢驗。P< 0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

經(jīng)皮穿刺延髓池抽取腦脊液法：12只大鼠4只未能抽取到腦脊液，6只抽取出血性腦脊液，僅有2只抽出少量清亮腦脊液，在離心后仍可見紅細(xì)胞沉淀。未能成功抽取合格腦脊液。

負(fù)壓吸引裝置穿刺抽取腦脊液法：12只大鼠除1只未能抽出腦脊液外，11只均能抽取，其中4只在中后期因速度過快混有較多血液，7只抽取至肉眼觀清亮腦脊液，在離心后仍有3只可見紅細(xì)胞沉淀。成功率33.3%。

改良負(fù)壓吸引裝置穿刺抽取腦脊液法：12只大鼠1只因操作原因未能很好地控制速度抽取到血性腦脊液，其它11只均可獲得清亮腦脊液，離心后2只可見紅細(xì)胞沉淀。成功率75%。

以上3種方法抽取腦脊液結(jié)果見表1。經(jīng)完全隨機設(shè)計多樣本秩和檢驗，3種方法差異有顯著性(P< 0.01)。3種方法之間的兩兩比較用擴展t檢驗，均為P< 0.05，差異有顯著性，見表2。

表1 3種方法收集大鼠腦脊液結(jié)果

表2 不同腦脊液收集方法的兩兩比較

3 討論

腦脊液由腦室的脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞產(chǎn)生分泌，經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔循環(huán)，由蛛網(wǎng)膜粒重吸收入血。腦脊液提供腦組織一定的營養(yǎng)，運走腦組織的代謝產(chǎn)物。腦脊液的改變往往直接反應(yīng)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變化，因此對腦脊液進(jìn)行分析是動物實驗研究的常用技術(shù)[6]。據(jù)文獻(xiàn)報道，體重300 g大鼠腦脊液總體積大約580 μL[7]，而一次能從延髓池中抽取的腦脊液更少，在100～120 μL[8]。相對于直視下劃破硬脊膜抽取腦脊液法及直視下微量進(jìn)樣器經(jīng)硬脊膜穿刺抽取腦脊液法，直接從皮膚穿刺進(jìn)入延髓池抽取腦脊液操作簡單，對腦立體定位儀依賴程度低，免去了繁瑣的手術(shù)過程，創(chuàng)口小，減少了感染機會。但是經(jīng)皮穿刺延髓池抽取腦脊液技術(shù)難度較高，要求術(shù)者不僅要熟悉大鼠項部的解剖結(jié)構(gòu)，還要掌握進(jìn)針的部位、深度與穿刺方向[9]。此法抽取腦脊液失敗的常見原因有：①定位不準(zhǔn)確；②進(jìn)針方向不合適；③穿刺過淺或過深；④抽取過程用力過度，腦室內(nèi)負(fù)壓過大使腦內(nèi)血管破裂出血。

Li等[3]提出的腦脊液負(fù)壓吸引收集裝置根據(jù)大鼠體重保留了不同的針尖長度，將傾角打磨成45°，減少了鋒利程度，增強了進(jìn)針時的突破感，很好地控制了進(jìn)針深度；恒定的負(fù)壓避免了手動抽吸用力不均的情況；且創(chuàng)口微小，有較好的重復(fù)性。效果優(yōu)于經(jīng)皮延髓池穿刺法(表2)，但較強的負(fù)壓與較快的抽取速度難免會使腦內(nèi)壓力迅速降低，使腦內(nèi)血管破裂，增加了抽取過程中后期出血的風(fēng)險。

改良后的負(fù)壓吸引收集裝置由于增加了流量調(diào)節(jié)器，抽取過程隨時可以調(diào)整負(fù)壓大小，可將抽取速度精確地控制在50 μL/min左右[5]。預(yù)先在輸液管上5 cm、6 cm處做好標(biāo)記，分別等同于腦脊液的量達(dá)到100 μL、120 μL。當(dāng)液面到達(dá)標(biāo)記處時，即關(guān)閉調(diào)節(jié)器，停止抽液，有效防止了腦內(nèi)壓力過快過多地降低導(dǎo)致的出血，效果優(yōu)于改良前的負(fù)壓吸引收集裝置及傳統(tǒng)經(jīng)皮延髓池穿刺法，差異有顯著性(表2)。另外，即便后期有少許出血，也能及時處理，此時可考慮用止血鉗從有血液污染處夾閉輸液管，將污染端剪下。值得注意的是，在打開調(diào)節(jié)器之后，如果未見腦脊液吸出，不必繼續(xù)增大負(fù)壓，這可能是因為針孔接觸到了延髓，只需稍微將針尖后退或稍微旋轉(zhuǎn)即可。

綜上所述，改良后的負(fù)壓吸引收集裝置由于控制了負(fù)壓的強度而有效降低了出血的風(fēng)險，能夠便捷、高效地收集到合格的大鼠腦脊液；裝置的材料簡單容易獲得，短時間內(nèi)即可完成制作；替換針頭方便；對于操作者技術(shù)要求不高，只需熟悉裝置的操作稍加練習(xí)即可順利完成腦脊液的收集，從而保證實驗順利進(jìn)行。

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