環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)家兔卵巢早衰動(dòng)物模型的建立和評(píng)價(jià)

張 娟，周月希,3，刁 波，王 剛，岳釗平，解 迪，王 晶，王立群,3

(1.中國人民解放軍武漢總醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430070； 2.中國人民解放軍武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，武漢 430070； 3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，武漢 430065)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指發(fā)生在40歲以前女性卵巢功能衰竭，主要表現(xiàn)為無排卵、雌激素缺乏和原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng)、不孕不育、性類固醇的缺乏和促性腺激素升高。目前常見的卵巢早衰模型有化療藥物模型、自身免疫性疾病模型、半乳糖血癥模型和基因模型。其中半乳糖血癥模型和基因模型較為局限，不能很好的解釋卵巢早衰的發(fā)病機(jī)制，且基因缺失和半乳糖血癥在臨床上發(fā)病率較低，不具有代表性[1]?；熕幬锬Ｐ褪茄芯柯殉苍缢サ慕?jīng)典模型。隨著腫瘤在青年人中發(fā)病率升高[2-3]，化療在臨床上應(yīng)用廣泛，化療引發(fā)青年女性卵巢早衰的問題日益突出[4]。研究化療引起的卵巢早衰對(duì)臨床腫瘤治療的副反應(yīng)研究具有重要意義。環(huán)磷酰胺是臨床常用的化療藥物，價(jià)格低廉，有研究顯示[5]，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)具有明顯的生殖毒性，可以損傷卵泡內(nèi)的顆粒細(xì)胞，引起卵巢早衰。本研究選取臨床上常用的化療藥物環(huán)磷酰胺，建立并評(píng)價(jià)不同注藥方式下的環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)家兔卵巢早衰模型，探索制備家兔卵巢早衰的最佳劑量，為進(jìn)一步研究卵巢早衰的治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)雌性未交配日本大耳兔21只，5月齡，體重2.5～3 kg，由武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供 [SCXK (鄂) 2016-0011]。飼養(yǎng)于中國人民解放軍武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 [SYXK (鄂) 2014-0082]，溫度控制在(22±2) ℃，相對(duì)濕度50%～60%，自由飲食，每天光照時(shí)間12 h。所有實(shí)驗(yàn)操作均在該院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)中心的規(guī)范要求，并得到動(dòng)物倫理委員會(huì)的許可(編號(hào)：2016020)。

1.2 主要試劑與儀器

注射用環(huán)磷酰胺(CTX，德國Baxter Oncology GmbH生產(chǎn))，注冊(cè)證號(hào)H20110407，規(guī)格200 mg/瓶；TUNEL凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物公司，產(chǎn)品編號(hào)：MK1020)；兔雌二醇酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(天津安諾瑞康生物公司，產(chǎn)品編號(hào)：TAE-267r)。多聚甲醛、戊巴比妥鈉等試劑均購自武漢拜意爾生物有限公司；采血管、采血針、離心管等購自武漢華聯(lián)科生物有限公司。

PL303型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，L600型離心機(jī)(湘儀儀器廠)，RM2016型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)，BX51型奧林巴斯熒光顯微鏡，YD-6L生物組織包埋機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組與造模

臨床上使用CTX分為大劑量沖擊治療和持續(xù)治療，本實(shí)驗(yàn)仿照臨床用藥制定用藥劑量和用藥方式，采用隨機(jī)數(shù)表法將家兔分為四組。正常對(duì)照組不作任何處理(A組)，模型一組50 mg/kg CTX腹腔注射1 d(B組)，模型二組50 mg/kg注射2 d(C組)，模型三組首日注射50 mg/kg，以后按照8 mg/kg連續(xù)注射14 d(D組)。如表1所示。

1.3.2 一般情況觀察

觀察家兔活動(dòng)情況、采食多少、二便及兔毛脫落情況。

1.3.3 體重變化與卵巢指數(shù)

表1 分組及造模方案

自注射CTX開始，對(duì)每組家兔連續(xù)稱重14 d并記錄分析體重變化。觀察周期結(jié)束后，3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉，取家兔雙側(cè)卵巢。生理鹽水清洗血跡，剝離多余脂肪組織后，用電子天平稱取卵巢濕重并記錄。

卵巢指數(shù)=卵巢濕重(g)/體重(kg)× 100%

1.3.4 卵巢組織形態(tài)觀察與卵泡計(jì)數(shù)

4%多聚甲醛溶液固定卵巢組織24 h，經(jīng)脫水、透明后石蠟包埋，5 μm切片，每隔20 μm取一張，每個(gè)組織取3張切片，常規(guī)HE染色后，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，觀察卵巢的組織學(xué)變化及各級(jí)卵泡個(gè)數(shù)，卵泡計(jì)數(shù)方法參照Myers[6]卵泡計(jì)數(shù)法。分別記錄各級(jí)卵泡個(gè)數(shù)，異常情況。將形態(tài)不規(guī)則，顆粒細(xì)胞排列紊亂，核深染、固縮的卵泡計(jì)為異常卵泡。

1.3.5 細(xì)胞凋亡檢測

TUNEL法觀察卵巢各類細(xì)胞凋亡情況。各組卵巢組織石蠟切片經(jīng)脫蠟，5 μm切片，每隔20 μm取一張，每個(gè)組織取3張切片，蛋白酶K消化，加標(biāo)記緩沖液、TBS洗后加封閉液，加入稀釋后的生物素化地高辛抗體、SABC，經(jīng)DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染后封片觀察，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算各組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 血清雌二醇檢測

自注射開始前一天記為第0天，注射當(dāng)天記為第1天，以此類推。分別于第0、7、14、21、28、35天在家兔耳緣靜脈采血2 mL，靜置10 min待血完全凝固，于離心機(jī)3000 r/min離心10 min后取上清，-80℃冰箱內(nèi)保存待測血清。血清收集完整后，酶聯(lián)免疫吸附法檢測家兔血清雌二醇(estradiol，E2)的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組家兔一般情況比較

B組注射CTX后第4～5天后出現(xiàn)少量脫毛，進(jìn)食活動(dòng)等無明顯變化，1只于注射第14天死亡；C組注射CTX第2天開始明顯脫毛，進(jìn)食減少，2只于第11、13天死亡；D組家兔自注射第3天，出現(xiàn)不同程度脫毛、進(jìn)食減少，活動(dòng)反應(yīng)降低，其中5只家兔分別于注射CTX后第6、7、9、13、16天死亡。由于D組死亡率太高，部分結(jié)果不納入統(tǒng)計(jì)。

2.2 各組體重和卵巢指數(shù)比較

注射第0～8天各組家兔體重差異無顯著性(P> 0.05)。注射第9天開始D組體重明顯下降，差異有顯著性(P< 0.05)。B、C組與A組相比，體重?zé)o明顯變化(P> 0.05)。卵巢指數(shù)：B組與A組相比，卵巢指數(shù)明顯小于A組，差異有顯著性(P< 0.05)；C組與A組相比，差異無顯著性(P> 0.05)。見圖1、表2。

注：與A組相比，* P< 0.05。圖1 注射CTX 14 d之內(nèi)體重變化比較Note. Compared with group A,* P < 0.05.Fig.1 Comparison of body weight changes during 14 days in each group

組別Groups家兔數(shù)量Numberofrabbits卵巢指數(shù)OvaryindexA組GroupA301164±0．01547B組GroupB501099±0．03142C組GroupC4008165±0．02518?

注：與A組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the group A,*P< 0.05.

2.3 卵巢組織形態(tài)觀察

A組卵泡數(shù)量多，可見大量原始、初級(jí)卵泡，閉鎖卵泡較少，各級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞層排列規(guī)則。B組原始卵泡數(shù)量少，閉鎖卵泡多，各級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞層見不同程度紊亂、核固縮。卵巢間質(zhì)纖維化。C組原始卵泡數(shù)量極少，形態(tài)模糊，初級(jí)及次級(jí)卵泡顆粒層排列紊亂，部分卵泡及卵細(xì)胞核形態(tài)異常，見大量閉鎖卵泡，竇狀卵泡形狀不規(guī)則，卵巢間質(zhì)疏松、纖維化較重。見圖2。

表3 各組家兔卵泡數(shù)量比較

注：與A組比較，*P< 0.017；與C組比較，▲P< 0.017。

Note. Compared with the group A,*P< 0.017. Compared with the group C,▲P< 0.017.

2.4 卵泡計(jì)數(shù)

B組、C組原始卵泡、初級(jí)卵泡異常數(shù)量與A組比較均明顯增多，差異有顯著性(P< 0.017)；B組與C組比較，C組原始卵泡異常數(shù)增多明顯，差異有顯著性(P< 0.017)，而兩組初級(jí)卵泡異常數(shù)量差異無顯著性(P> 0.017)；三組相比，次級(jí)、竇狀卵泡異常數(shù)比較差異無顯著性(P> 0.05)。各組家兔卵泡數(shù)量比較見表3。

2.5 細(xì)胞凋亡檢測

通過觀察卵巢中細(xì)胞的凋亡情況判斷環(huán)磷酰胺對(duì)卵巢的破壞情況。凋亡細(xì)胞內(nèi)有清晰的褐色或棕黃色，主要表現(xiàn)在卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核上。B組、C組組織切片染色均見明顯的褐色或棕黃色顆粒；A組組織切片與背景色一致，未見或極少見棕黃色顆粒沉著。

模型組中的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而且大部分都是成熟卵泡周邊及內(nèi)部的顆粒細(xì)胞。凋亡率統(tǒng)計(jì)：B組與C組中成熟卵泡內(nèi)及卵泡周圍見凋亡顆粒細(xì)胞。B組、C組與A組比較，差異有顯著性(P< 0.05)；C組與B組比較，C組凋亡率高于B組，差異有顯著性(P< 0.05)。見圖3、表4。

2.6 血清E2檢測

各組血清E2變化如圖4所示。A組血清E2值呈周期變化趨勢。B組第7天E2分泌達(dá)高峰，第7天后逐漸下降，E2分泌量第7天與第35天比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，t=4.634，P< 0.05；C組E2值持續(xù)下降，第0天與第35天比較，t=5.337，P< 0.05。

3 討論

卵巢早衰是女性不孕的原因之一，患者表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)、卵泡發(fā)育不良、雌激素水平低下、不孕等。近年來，因腫瘤和自身免疫疾病的發(fā)病率升高，化療藥物在臨床上應(yīng)用廣泛，有研究表明，化療藥物是導(dǎo)致卵巢早衰的重要原因[4]。環(huán)磷酰胺是臨床常用的烷化劑類化療藥物，卵巢對(duì)其非常敏感，大量研究結(jié)果顯示環(huán)磷酰胺能夠引起卵巢形態(tài)學(xué)改變，降低卵泡數(shù)量，損傷顆粒細(xì)胞，降低雌激素水平，進(jìn)而引起卵巢早衰[7-9]。卵巢早衰患者常伴有月經(jīng)紊亂或閉經(jīng)，生育力低下，甚者抑郁、焦慮、失眠，嚴(yán)重影響患者的身心健康，不利于家庭穩(wěn)定，影響社會(huì)和諧。本實(shí)驗(yàn)中使用環(huán)磷酰胺注射后的家兔，卵泡發(fā)育受限甚至畸形，雌激素低下，這與臨床上卵巢早衰的表現(xiàn)相似，但未驗(yàn)證其生育力是否下降。

注：白色箭頭示原始卵泡，紅色箭頭示初級(jí)卵泡，黃色箭頭示次級(jí)卵泡，黑色箭頭示閉鎖卵泡。(a)：A組原始卵泡、初級(jí)卵泡；(b)：B組原始、初級(jí)、次級(jí)卵泡；(c)：C組原始、初級(jí)、次級(jí)卵泡；(d)：A組竇狀卵泡；(e)：B組竇狀卵泡；(f)：C組竇狀卵泡；(g)：B組閉鎖卵泡；(h)：C組閉鎖卵泡。圖2 各組卵巢情況(HE染色，× 400)Note. White arrows indicate primordial follicles. Red arrows indicate primary follicles. Yellow arrows indicate secondary follicles. Black arrows indicate atretic follicles. Bar=50 μm. (a): Primordial and primary follicles in group A. (b): Primordial, primary and secondary follicles in group B. (c): Primordial, primary and secondary follicles in group C. (d): Antral follicles in group A. (e): Antral follicles in group B. (f): Antral follicles in group C. (g): Atretic follicles in group B. (h): Atretic follicles in group C.Fig.2 Histology of the rabbit ovaries in groups A, B and C. HE staining

注：A：A組部分顆粒細(xì)胞；B：B組部分顆粒細(xì)胞；C：C組部分顆粒細(xì)胞。圖3 各組顆粒細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果(TUNEL，× 400)Note. A: Some of the granular cells in group A. B: Some of the granular cells in group B. C: Some of the granular cells in group C. Bar=50 μm.Fig.3 Apoptosis in granular cells in groups A, B and C. TUNEL staining

分組Groups家兔數(shù)量Numberofrabbits凋亡率ApoptosisrateA3418±09B51130±231?C42476±152?▲

注：與A組比較，*P< 0.05；與B組比較，▲P< 0.05。

Note. Compared with the group A,*P< 0.05. Compared with the group B,▲P< 0.05.

注：與第35天相比，* P< 0.05。圖4 各組血清E2值變化圖Note. Compared with the 35th day,* P < 0.05.Fig.4 Changes in serum levels of estradiol in groups A, B and C during 35 days

B組注射CTX后進(jìn)食活動(dòng)等無明顯變化，死亡率16.7%；C組進(jìn)食活動(dòng)減少，死亡率33.3%。D組進(jìn)食活動(dòng)明顯降低，死亡率83.3%。D組家兔體重明顯下降，而B、C組體重?zé)o明顯變化。結(jié)合藥物致死率和體重變化來看，長時(shí)間注射CTX可能造成家兔多器官衰竭，限制家兔生長發(fā)育，死亡率高，表明D組注藥方式不適合造模。通過對(duì)各組卵巢切片的觀察，CTX對(duì)各級(jí)卵泡均有破壞，其中原始卵泡破壞最明顯，這與Plowchalk等[9]和Meirow等[10]的研究結(jié)果一致。B、C組卵巢均見不同程度的損傷，但C組卵巢損傷更重，表現(xiàn)為大量原始卵泡被破壞且排列不規(guī)則，異常卵泡數(shù)量多，伴大量閉鎖卵泡；卵母細(xì)胞核固縮，顆粒細(xì)胞層排列紊亂，卵巢間質(zhì)疏松；見大量凋亡細(xì)胞。C組卵巢指數(shù)明顯小于A組，而B組卵巢指數(shù)差異無顯著性，說明B組注藥方式對(duì)卵巢破壞較輕。B組在注射CTX 7天后血清E2達(dá)高峰，第7天后整體呈現(xiàn)下降趨勢，但在第21天出現(xiàn)小幅度增高，可能由于B組劑量所致卵巢損傷是可逆的，不能徹底破壞卵巢功能；C組E2值持續(xù)下降，在注射CTX后第35天降至最低，比較接近臨床上卵巢早衰患者低雌激素表現(xiàn)；綜合評(píng)估，B、C組注藥方式均對(duì)卵巢造成損傷，但C組在形態(tài)學(xué)和生化指標(biāo)上更符合臨床上卵巢早衰指征，即50 mg/kg CTX × 2 d是建立家兔卵巢早衰模型的最佳劑量。

大多研究選用鼠類作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立卵巢早衰模型，本課題選用家兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其原始卵泡卵母細(xì)胞的大小與人類接近，卵巢組織中卵泡數(shù)量豐富，更便于觀察CTX對(duì)卵巢的作用。與鼠類相比，家兔重復(fù)采血比較方便，可以盡量避免殺害動(dòng)物，符合動(dòng)物倫理學(xué)的要求。有研究顯示，GnRH類似物、雌激素等有治療卵巢早衰的作用[11-12]，本實(shí)驗(yàn)在注射CTX前不對(duì)家兔進(jìn)行任何藥物處理，觀察在自然狀態(tài)下，家兔接受CTX注射后的病理變化，這一處理與臨床更加接近。

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