苦參堿和氧化苦參堿體內(nèi)外模型的肝毒性比較研究

郭秋平，陳貴英，周 泉，金若敏

(1.廣州醫(yī)藥研究總院有限公司藥物非臨床評(píng)價(jià)研究中心，廣州 510240； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，上海 201203)

苦參堿(matrine，MT)和氧化苦參堿(oxymatrine，OMT)是中藥苦參和山豆根主要成分和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]。苦參堿和氧化苦參堿具有抗腫瘤、抗炎、抗乙肝病毒和抗肝纖維化作用以及鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用[2-6]，氧化苦參堿還表現(xiàn)出對(duì)心肌的保護(hù)作用[7-8]，臨床用于治療癌癥、慢性肝炎、肝纖維化和心肌病?？鄥A和氧化苦參堿藥效比較已有報(bào)道[9-10]，苦參堿的鎮(zhèn)痛作用優(yōu)于氧化苦參堿；苦參堿的抗炎作用小于氧化苦參堿。然而，關(guān)注苦參堿和氧化苦參堿毒性的研究很少，只有少數(shù)報(bào)道表明苦參堿和氧化苦參堿具有毒性[11-12]，但其毒性的比較、毒性特征和機(jī)制仍不清楚。

本研究首次使用體內(nèi)斑馬魚(yú)模型比較苦參堿和氧化苦參堿的肝臟毒性，并通過(guò)體外肝細(xì)胞模型進(jìn)行驗(yàn)證。本研究的目的是探索這些化合物的肝毒性嚴(yán)重程度、特征和初步毒性機(jī)制，為臨床使用和安全使用含苦參堿和氧化苦參堿的中藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

L-02肝細(xì)胞：香港大學(xué)饋贈(zèng)；AB-line斑馬魚(yú)：南方醫(yī)科大學(xué)提供。

1.2 主要試劑與儀器

苦參堿(純度99.1%，批號(hào)130622)和氧化苦參堿(純度99.3%，批號(hào)130610)，上海榮和制藥有限公司提供；對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)，廣州白云山藥業(yè)有限公司提供；MTT：美國(guó)Amersco；丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒：南京建成生物工程公司；威廉姆斯培養(yǎng)基(WME)：美國(guó)Sigma。

酶標(biāo)儀(ELX800，Biotek，美國(guó))，生化分析儀(7100，Hitachi，日本)，熒光顯微鏡(BX51，Olympus，日本)，ABI7900HT序列檢測(cè)系統(tǒng)(AB公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 體外肝細(xì)胞模型毒性比較研究

(1)細(xì)胞培養(yǎng)與處理：將肝細(xì)胞以每平方厘米1 × 105個(gè)細(xì)胞接種在24孔板上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液為威廉姆斯培養(yǎng)基，含10%胎牛血清(FBS)，10 U/L胰島素鐵硒傳遞蛋白(ITS)，10 U/L地塞米松，4 × 107U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48 h。IC50檢測(cè)中，48 h后除對(duì)照孔外，加入對(duì)乙酰氨基酚32 mmol/L，苦參堿1、3、8、20 mmol/L，氧化苦參堿3、8、19 mmol/L，設(shè)5個(gè)復(fù)孔。其余試驗(yàn)中，加入對(duì)乙酰氨基酚32 mmol/L，苦參堿3、8、20 mmol/L，氧化苦參堿3、8、19 mmol/L，設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

(2)IC50檢測(cè)：24 h后，加入100 μL MTT孵育4 h后加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩孵育10 min，630 nm和490 nm檢測(cè)吸光度。計(jì)算抑制百分比：(D490-D630)/(D490-D630) × 100%，并計(jì)算IC50值。

(3)肝細(xì)胞酶檢測(cè)：24 h后，收集培養(yǎng)基，檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)。

(4)肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查：采用細(xì)胞爬片技術(shù)制片。HE染色檢查肝細(xì)胞形態(tài)。肝細(xì)胞病理分級(jí)如下：①正常肝細(xì)胞具有完整的結(jié)構(gòu)：“-”，0級(jí)；②肝細(xì)胞輕度腫脹：“+”，1級(jí)；③肝細(xì)胞中度腫脹：“++”，2級(jí)；④肝細(xì)胞嚴(yán)重腫脹和破裂：“+++”，3級(jí)；⑤肝細(xì)胞壞死：“++++”，4級(jí)。

(5)丙二醛和谷胱甘肽含量測(cè)定：24 h后，用1.8 g/L胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞并懸浮于低滲Tris緩沖液中，4000 r/min離心10 min。收集上清液，檢測(cè)丙二醛和谷胱甘肽含量。

(6)肝細(xì)胞凋亡檢測(cè)：細(xì)胞爬片后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌5 min，然后用DAPI染色20 min，檢測(cè)細(xì)胞凋亡。每個(gè)樣本隨機(jī)選5個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡百分比：凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞數(shù)× 100%。

1.3.2 體內(nèi)斑馬魚(yú)模型毒性比較研究

(1)斑馬魚(yú)飼養(yǎng)與處理：水溫為(23±1) ℃，pH為(7.8±1)，硬度250 mg/L，光照時(shí)間為12 h。實(shí)驗(yàn)方案符合廣州醫(yī)藥研究總院有限公司動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)(EX-EL2012005-01)的要求。LC50試驗(yàn)中，對(duì)乙酰氨基酚8 mmol/L，苦參堿0.26、0.32、0.40、0.50、0.63 mmol/L，氧化苦參堿3.8 mmol/L；其余試驗(yàn)中，對(duì)乙酰氨基酚8 mmol/L，苦參堿0.26、0.40、0.63 mmol/L，氧化苦參堿3.8 mmol/L。

(2)LC50檢測(cè)：藥物處理后觀察動(dòng)物的日常外觀、行為和采食情況。96 h后，快速冷凍將動(dòng)物進(jìn)行安樂(lè)死，計(jì)算LC50值。

(3)肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查：96 h后動(dòng)物安樂(lè)死。取肝臟，石蠟切片，HE染色。檢查肝細(xì)胞形態(tài)。肝細(xì)胞病理分級(jí)如下：①正常肝細(xì)胞具有完整的結(jié)構(gòu)：“-”，0級(jí)；②肝細(xì)胞輕度空泡化：“+”，1級(jí)；③肝細(xì)胞中度空泡化：“++”，2級(jí)；④肝細(xì)胞嚴(yán)重空泡化：“+++”，3級(jí)；⑤肝細(xì)胞壞死：“++++”，4級(jí)。

(4)丙二醛和谷胱甘肽含量測(cè)定：取斑馬魚(yú)肝臟勻漿，3000 r/min離心10 min。收集上清液檢測(cè)丙二醛和谷胱甘肽含量。

(5)肝細(xì)胞凋亡檢測(cè)：取肝臟石蠟切片，將切片脫蠟后，PBS中洗滌5 min，DAPI染色20 min，檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡。檢測(cè)方法同體外肝細(xì)胞。

(6)氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)基因檢測(cè)：取對(duì)照組和苦參堿(0.40 mmol/L)組斑馬魚(yú)肝臟。檢測(cè)基因zgc: 136383，zgc: 123120和EIF4EBP3的表達(dá)。PCR條件如下：95℃，5 min；95℃，10 s；60℃，30 s；使用2× QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。引物設(shè)計(jì)如下(5’→3’)：GAPDH-F：GTGACCCCTTTGCTGTTTCTTT，GAPDH-R：GGCAC GTGGTGCAAACATT；zgc136383-F：GTTCCCATCAA TCCAGACGGT，zgc136383-R：TGACAGTTCTGCATC AACACATC；EIF4EBP3-F：AAGAAAGCACATCAGAA CATAAA，EIF4EBP3-R：GAAATCCAGGCAAACGAA A；zgc123120-F：CCAGACACCTCCCCTCATT，zgc123120-R：CTCTCCAGCACAACTTCCC。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體外肝細(xì)胞模型毒性比較研究

2.1.1 IC50檢測(cè)

結(jié)果顯示，對(duì)乙酰氨基酚(32 mmol/L)對(duì)肝細(xì)胞具有明顯的抑制作用，苦參堿和氧化苦參堿也具有明顯的抑制作用；苦參堿和氧化苦參堿的IC50值分別為5.3 mmol/L和> 19 mmol/L。因此，苦參堿對(duì)肝細(xì)胞的抑制作用明顯大于氧化苦參堿。

2.1.2 肝細(xì)胞酶檢測(cè)

結(jié)果顯示(表1)，對(duì)乙酰氨基酚(32 mmol/L)組細(xì)胞的ALT、AST、ALP和LDH含量增加(P< 0.01)；苦參堿(20 mmol/L)組細(xì)胞ALT、AST、ALP和LDH含量均升高(P< 0.01)，而苦參堿(8 mmol/L)組細(xì)胞僅ALP、LDH含量增加(P< 0.01)；氧化苦參堿(19 mmol/L)組細(xì)胞的AST、ALP和LDH含量增加(P< 0.01)。與氧化苦參堿(19 mmol/L)相比，苦參堿(20 mmol/L)組細(xì)胞ALT、AST、ALP和LDH含量升高(P< 0.05或P< 0.01)。

表1 苦參堿和氧化苦參堿對(duì)肝細(xì)胞酶的影響

注：與對(duì)照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01；與氧化苦參堿組相比，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the OMT group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

2.1.3 肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查

結(jié)果顯示(圖1)，對(duì)乙酰氨基酚(32 mmol/L)組肝細(xì)胞數(shù)減少，肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重腫脹，有些細(xì)胞核消失(P< 0.05)；苦參堿(20 mmol/L)組肝細(xì)胞數(shù)減少，肝細(xì)胞呈輕度至中度腫脹(P< 0.05)；苦參堿(8 mmol/L)和氧化苦參堿(19 mmol/L)組的肝細(xì)胞輕度腫脹(P> 0.05)。與氧化苦參堿(19 mmol/L)相比，苦參堿(20 mmol/L)組肝細(xì)胞形態(tài)變化更嚴(yán)重(P< 0.05)。

注：A：對(duì)照組(-)；B：對(duì)乙酰氨基酚組(32 mmol/L)(+++)；C：苦參堿組(20 mmol/L)(-)；D：苦參堿組(8 mmol/L)(+++)；E：苦參堿組(3 mmol/L)(+)；F：氧化苦參堿組(19 mmol/L)(+)；G：氧化苦參堿組(8 mmol/L)(-)；H：氧化苦參堿組(3 mmol/L)(-)。圖1 苦參堿和氧化苦參堿對(duì)肝細(xì)胞形態(tài)的影響(HE染色，× 400)Note. A: Control group (-); B: APAP group (32 mmol/L) (+++); C: MT group (20 mmol/L) (-); D: MT group (8 mmol/L) (+++); E: MT group (3 mmol/L) (+); F: OMT group (19 mmol/L) (+); G: OMT group (8 mmol/L) (-); H: OMT group (3 mmol/L) (-).Fig.1 Effects of matrine and oxymatrine on morphology of the cultured liver cells. HE staining

2.1.4 肝細(xì)胞丙二醛和谷胱甘肽含量測(cè)定

結(jié)果顯示，對(duì)乙酰氨基酚(32 mmol/L)組肝細(xì)胞丙二醛含量增加，谷胱甘肽含量降低(P< 0.05)；苦參堿(20 mmol/L)組肝細(xì)胞丙二醛含量增加(P< 0.05)，谷胱甘肽含量降低(P< 0.01)；苦參堿(8 mmol/L)(P< 0.05)和氧化苦參堿(19 mmol/L)(P< 0.01)組肝細(xì)胞谷胱甘肽含量也降低。與氧化苦參堿(19 mmol/L)相比，苦參堿(20 mmol/L)組肝細(xì)胞的谷胱甘肽含量顯著降低(P< 0.01)。

2.1.5 肝細(xì)胞凋亡檢測(cè)

結(jié)果顯示(圖2)，對(duì)乙酰氨基酚(32 mmol/L)組肝細(xì)胞核的熒光密度增加，肝細(xì)胞凋亡百分比顯著增加(P< 0.05)；苦參堿(20、8 mmol/L)和氧化苦參堿(19 mmol/L)組部分肝細(xì)胞凋亡，凋亡百分比增加(P< 0.05)。與氧化苦參堿(19 mmol/L)相比，苦參堿(20 mmol/L)組肝細(xì)胞凋亡率明顯升高(P< 0.05)。

注：A：對(duì)照組(-)；B：對(duì)乙酰氨基酚組(32 mmol/L)(+++)；C：苦參堿組(20 mmol/L)(-)；D：苦參堿組(8 mmol/L)(+++)；E：苦參堿組(3 mmol/L)(+)；F：氧化苦參堿組(19 mmol/L)(+)；G：氧化苦參堿組(8 mmol/L)(-)；H：氧化苦參堿組(3 mmol/L)(-)。圖2 苦參堿和氧化苦參堿對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響(DAPI染色，× 400)Note. A: Control group (-); B: APAP group (32 mmol/L) (+++); C: MT group (20 mmol/L) (-); D: MT group (8 mmol/L) (+++); E: MT group (3 mmol/L) (+); F: OMT group (19 mmol/L) (+); G: OMT group (8 mmol/L) (-); H: OMT group (3 mmol/L) (-).Fig.2 Effects of matrine and oxymatrine on apoptosis in the cultured liver cells. DAPI staining

2.2 體內(nèi)斑馬魚(yú)模型的毒性比較研究

2.2.1 LC50檢測(cè)

結(jié)果顯示，對(duì)乙酰氨基酚(8 mmol/L)對(duì)斑馬魚(yú)具有明顯的毒性。苦參堿(0.26～0.63 mmol/L)處理3 h后，斑馬魚(yú)出現(xiàn)游泳失衡和活動(dòng)減少；濃度> 0.32 mmol/L引起死亡，LC50為0.41 mmol/L。氧化苦參堿(3.8 mmol/L)處理斑馬魚(yú)6 h后，斑馬魚(yú)出現(xiàn)游泳失衡和活動(dòng)減少，但大多數(shù)在24 h后恢復(fù)；氧化苦參堿的LC50為> 3.8 mmol/L。

2.2.2 肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查

結(jié)果顯示(圖3)，對(duì)乙酰氨基酚(8 mmol/L)引起斑馬魚(yú)肝細(xì)胞輕度至嚴(yán)重空泡化(P< 0.05)；苦參堿(0.63 mmol/L)引起斑馬魚(yú)肝細(xì)胞輕度至嚴(yán)重空泡化(P< 0.05)。與氧化苦參堿(3.8 mmol/L)組相比，苦參堿(0.63 mmol/L)組肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化更為嚴(yán)重(P< 0.05)。

注：A：對(duì)照組；B：對(duì)乙酰氨基酚組(8 mmol/L)(+++)；C：氧化苦參堿組(3.8 mmol/L)(+)；D：苦參堿組(0.63 mmol/L)(++)；E：苦參堿組(0.40 mmol/L)(+)；F：苦參堿組(0.26 mmol/L)(-)。圖3 苦參堿和氧化苦參堿對(duì)斑馬魚(yú)肝細(xì)胞形態(tài)的影響(HE染色，× 400)Note. A: Control group (-); B: APAP group (8 mmol/L) (+++); C: OMT group (3.8 mmol/L) (+); D: MT group (0.63 mmol/L) (++); E: MT group (0.40 mmol/L) (+); F: MT group (0.26 mmol/L) (-).Fig.3 Effects of matrine and oxymatrine on morphology of the liver cells in zebrafish. HE staining

注：A：對(duì)照組；B：對(duì)乙酰氨基酚組(8 mmol/L)；C：氧化苦參堿組(3.8 mmol/L)；D：苦參堿組(0.63 mmol/L)；E：苦參堿組(0.40 mmol/L)；F：苦參堿組(0.26 mmol/L)。圖4 苦參堿和氧化苦參堿對(duì)斑馬魚(yú)肝細(xì)胞凋亡的影響(DAPI染色，× 400)Note. A: Control group; B: APAP group (8 mmol/L); C: OMT group (3.8 mmol/L); D: MT group (0.63 mmol/L); E: MT group (0.40 mmol/L); F: MT group (0.26 mmol/L).Fig.4 Effects of matrine and oxymatrine on apoptosis in the liver cells of zebrafish. DAPI staining

2.2.3 丙二醛和谷胱甘肽含量測(cè)定

結(jié)果顯示，對(duì)乙酰氨基酚(8 mmol/L)組肝細(xì)胞丙二醛含量明顯升高(P< 0.05)；苦參堿(0.63、0.40 mmol/L)組的丙二醛含量增加，而谷胱甘肽含量降低(P< 0.01或P< 0.05)。與氧化苦參堿(3.8 mmol/L)相比，苦參堿(0.63 mmol/L)組肝細(xì)胞丙二醛含量明顯升高(P< 0.01)，谷胱甘肽含量明顯降低(P< 0.05)。

2.2.4 肝細(xì)胞凋亡檢測(cè)

表2 苦參堿對(duì)斑馬魚(yú)氧化應(yīng)激和凋亡基因表達(dá)的影響

注：以對(duì)照組表達(dá)水平為1，分別對(duì)苦參堿組各目標(biāo)基因的表達(dá)倍數(shù)進(jìn)行校正。具體計(jì)算公式為：表達(dá)差(△△Ct)=苦參堿組Ct差-對(duì)照組Ct差，其中，Ct差(△Ct)=目標(biāo)基因Ct值-內(nèi)參(GAPDH)Ct值，Ct值為實(shí)驗(yàn)測(cè)得qPCR的循環(huán)數(shù)；表達(dá)倍數(shù)=2-△△Ct。與對(duì)照組相比，*P< 0.05。

Note. The expression level of each target gene in the control group was set as 1, and the expression fold in the MT group was normalized respectively. The specific formulas are as follows:△△Ct=△Ct of the MT group-△Ct of the control group;△Ct=Ct value of the target gene - Ct value ofGAPDH(as the internal control); Ct value refers to the qPCR cycles detected in this experiment. Relative folds to the control group=2-△△Ct. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

結(jié)果顯示(圖4)，對(duì)乙酰氨基酚(8 mmol/L)組斑馬魚(yú)肝細(xì)胞凋亡率明顯升高(P< 0.05)；苦參堿(0.63、0.40 mmol/L)組斑馬魚(yú)肝細(xì)胞凋亡率升高(P< 0.01)。與氧化苦參堿(3.8 mmol/L)組相比，苦參堿(0.63、0.40 mmol/L)組斑馬魚(yú)肝細(xì)胞凋亡率明顯升高(P< 0.05)。

2.2.5 氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)基因檢測(cè)

結(jié)果顯示(表2)，苦參堿(0.40 mmol/L)組基因zgc: 136383下調(diào)至0.001(P< 0.05)，表明苦參堿誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與zgc: 136383的下調(diào)相關(guān)。基因zgc: 123120上調(diào)至1.22(P< 0.05)，EIF4EBP3基因下調(diào)至0.02(P< 0.05)，說(shuō)明苦參堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與EIF4EBP3的下調(diào)和zgc: 123120的上調(diào)有關(guān)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用人肝細(xì)胞作為體外模型保留人類的特征，保持肝細(xì)胞的生理和代謝特征，可以直接反映藥物的肝毒性。IC50值是衡量肝毒性的重要參數(shù)。與體外模型相比，斑馬魚(yú)模型可更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)藥物毒性；此外，與哺乳動(dòng)物模型相比，斑馬魚(yú)模型測(cè)試周期短，成本低和用藥量少，更符合動(dòng)物福利倫理。因此，斑馬魚(yú)模型對(duì)于預(yù)測(cè)肝臟毒性是準(zhǔn)確可靠的[13-14]。LC50是衡量化學(xué)物質(zhì)在水中的毒性的重要參數(shù)。本研究預(yù)測(cè)試結(jié)果顯示，氧化苦參堿(3.8 mmol/L)處理并未引起斑馬魚(yú)死亡。根據(jù)ISO734561-3“物質(zhì)對(duì)淡水魚(yú)的急性毒性的水質(zhì)測(cè)定”，氧化苦參堿的毒性非常小；因此，正式試驗(yàn)中氧化苦參堿的濃度為3.8 mmol/L。

本研究中，陽(yáng)性對(duì)照藥對(duì)乙酰氨基酚對(duì)肝細(xì)胞和斑馬魚(yú)具有明顯的毒性作用。體外模型結(jié)果與體內(nèi)模型結(jié)果一致，表明本研究使用的系統(tǒng)穩(wěn)定可靠，可用于藥物評(píng)價(jià)。

本研究中，體外肝細(xì)胞模型表明苦參堿的毒性明顯大于氧化苦參堿?？鄥A和氧化苦參堿導(dǎo)致斑馬魚(yú)游泳不平衡，這可能與神經(jīng)毒性有關(guān)[15]，苦參堿對(duì)斑馬魚(yú)的毒性明顯大于氧化苦參堿。體內(nèi)外模型結(jié)果一致。

苦參堿(C15H24N2O)與氧化苦參堿(C15H24N2O2)結(jié)構(gòu)相似?？鄥A是氧化苦參堿體內(nèi)的代謝產(chǎn)物之一?？鄥A注射后轉(zhuǎn)化率約為30%，氧化苦參堿僅為6%[16]?？鄥A在肝臟中的分布明顯高于氧化苦參堿[17]。這可能是苦參堿毒性明顯大于氧化苦參堿的原因。

本研究進(jìn)一步探討了苦參堿和氧化苦參堿的初步肝毒性機(jī)制。大量研究表明肝毒性的主要機(jī)制是氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[18-20]。因此，本研究中檢測(cè)到氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)指標(biāo)。丙二醛含量可反映身體脂質(zhì)過(guò)氧化程度，間接反映細(xì)胞損傷程度[21-22]。谷胱甘肽含量映身體抗氧化能力的重要因素[23]。本研究表明其肝臟毒性機(jī)制與氧化應(yīng)激相關(guān)?；騴gc: 136383的功能是參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控，苦參堿使該基因表達(dá)下調(diào)，使脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能受損，增加了細(xì)胞脂質(zhì)積累，激活了氧化應(yīng)激。

凋亡是一種細(xì)胞死亡形式[24]。DAPI可以通過(guò)細(xì)胞膜，與雙鏈DNA結(jié)合標(biāo)記細(xì)胞核。凋亡發(fā)生時(shí)，染色質(zhì)收縮聚集或進(jìn)一步收縮形成顆粒，或細(xì)胞核分解形成碎片[25]。本研究表明肝毒性機(jī)制與細(xì)胞凋亡相關(guān)。基因zgc: 123120編碼一種Bcl-2家族/腺病毒相互作用蛋白，其與促凋亡基因結(jié)合以促進(jìn)凋亡?；駿IF4EBP3編碼的蛋白是EIF4EBP家族的成員，作為蛋白激酶B的mTOR，激活蛋白激酶B并對(duì)線粒體凋亡途徑具有抗凋亡作用?？鄥A使基因EIF4EBP3表達(dá)下調(diào)，zgc: 123120表達(dá)上調(diào)，抗凋亡能力減弱，促凋亡能力增強(qiáng)，使肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。

苦參堿是中藥山豆根和苦參的藥效和毒性物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究表明高劑量的苦參堿對(duì)肝臟有毒性，臨床使用大劑量的中藥苦參和山豆根時(shí)應(yīng)考慮藥物的安全性。

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