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    Tempol對心肌肥厚大鼠NF-κB信號通路的影響

    2018-01-31 06:29:54劉撿娣朱金海謝東明
    中國比較醫(yī)學雜志 2018年1期
    關(guān)鍵詞:貨號心肌細胞試劑盒

    劉撿娣,謝 龍,肖 坤,朱金海,謝東明*

    (1.贛南醫(yī)學院2015級碩士研究生,江西 贛州 341000; 2.贛南醫(yī)學院2016級碩士研究生,江西 贛州 341000; 3.贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,江西 贛州 341000)

    心肌肥厚(myocardial hypertrophy,MH)是心肌組織壓力超負荷的一種代償性反應,以心肌細胞蛋白質(zhì)合成增加、心肌細胞體積增大及間質(zhì)成分改變?yōu)橹饕卣?,是引起多種心血管疾病發(fā)病率和病死率升高的獨立危險因素之一[1-2]。近年來有研究表明,心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過程與氧化應激有著密切的聯(lián)系[3-4],其中氧化應激產(chǎn)生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)對心肌肥厚的氧化作用的致病機制較受認可。ROS介導的NF-κB信號通路激活,通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB進入核內(nèi)調(diào)控基因表達,參與心肌肥厚的病理過程[5]。氮氧自由基(nitroxide radicals,NRs)是含有C、N、O和自旋單電子的有機化合物,早期被用作闡明細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的自旋示蹤劑[6]。NRs可以通過清除體內(nèi)的ROS來減輕氧化應激反應所致的損傷,改善心肌肥大癥狀[7-8]。氮氧自由基化合物2, 2, 6, 6-四甲基-4-哌啶醇(tempol)為傳統(tǒng)的氧自由基清除劑,可清除過多ROS[9]。NRs具有廣闊的臨床應用前景,但目前實驗室與臨床上對NRs對抗氧化作用的研究甚少,而對肥厚型心肌病NF-κB信號通路的影響研究尚無。本研究采用異丙腎上腺素(isoprenaline,ISO)建立大鼠心肌肥厚模型,旨在研究氮氧自由基tempol對心肌肥厚、相關(guān)炎癥因子及NF-κB信號通路的作用。

    1 材料和方法

    1.1 實驗動物

    SPF級SD雄性大鼠,180~220 g,購自贛南醫(yī)學院實驗動物中心 [SCXK (贛) 2014-0001],飼養(yǎng)于贛南醫(yī)學院實驗動物中心,大鼠的組織取材于贛南醫(yī)學院實驗動物中心動物實驗設施內(nèi)進行 [SYXK (贛) 2014-0001]。

    1.2 主要試劑與儀器

    主要試劑:2,2,6,6-四甲基-4-哌啶醇(tempol)(貨號:176141-5G)、異丙腎上腺素(貨號:I5627-5G)購于美國Sigma公司,蘇木素伊紅染色液(貨號:DH0006-100)、TRIzol(貨號:NR0002)購于北京雷根生物技術(shù)有限公司,cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:KR106)、SuperReal熒光定量預混試劑增強版試劑盒(貨號:FP205)購于北京天根生化科技有限公司,RIPA裂解液I、BCA蛋白定量測定試劑盒、p65一抗(貨號:10745-1-AP)、IκBα一抗(貨號:10268-1-AP)購于Proteintech公司,p-p65一抗(貨號:D155097)、β-actin一抗(貨號:D110001)購于上海生工生物股份有限公司,辣根酶標記山羊抗兔IgG (H + L)(貨號:ZB-2301)購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,ECL Plus超敏發(fā)光液(貨號:PE0010)購于北京索萊寶科技有限公司。

    主要儀器:小型高速離心機(Eppendorf,德國);冷凍冷藏兩用冰箱(Siemens,德國);-80℃超低溫冰箱(Thermo Fisher,美國);MK3型酶標儀(Thermo Fisher,美國);Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad,美國);ABI 7500實時熒光定量PCR儀(ABI,美國);轉(zhuǎn)膜儀(百晶生物,北京);電泳儀(百晶生物,北京)。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 實驗動物分組及造模

    將42只SD雄性大鼠隨機分為3組,每組14只,分別為正常對照組,心肌肥厚模型組,tempol干預組。各組(除正常組)大鼠腹腔注射異丙腎上腺素5 mg/kg,每日2次,連續(xù)2周;正常組大鼠腹腔注射等劑量生理鹽水,自由進食、給水。于造模完成24 h后,tempol干預組開始給予腹腔注射tempol 100 mg/(kg·d);心肌肥厚模型組與正常對照組予以腹腔注射等劑量生理鹽水,連續(xù)8周。本試驗由贛南醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準,批準號為:IACUC-2014-018。

    1.3.2 各項指標檢測

    (1)心臟重量指數(shù)的測定:大鼠末次給藥后禁食12 h,稱重(body weight,BW),采用腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉,腹主動脈取血完畢后,取心臟,剪去心臟周圍的組織和血管,生理鹽水清洗殘血,濾紙吸干后稱量全心重(heart weight,HW),沿冠狀溝將左、右心房剪下,沿室間溝將右心室游離去除稱量左心室重量(left ventricular weight(LVW),計算全心重量指數(shù)(heart weight index,HWI):HWI=HW/BW和左心室重量指數(shù)(left ventricular weight index,LVWI):LVWI=LVW/BW。

    (2)心肌細胞形態(tài)學及纖維化程度檢測:取大鼠左心室心肌組織置于4%多聚甲醛中固定24 h以上,經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后用切片機按4 μm厚度切片,按HE染色試劑盒說明書行HE染色,按Masson染色試劑盒說明書行Masson染色,200倍光學顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)并拍照。

    (3)qRT-PCR檢測心肌組織中TNF-α、IL-6 mRNA的表達:按照TRIzol產(chǎn)品說明書流程,提取各組樣本2 μg RNA后,測RNA濃度及純度。設計目的基因上下游引物(表1),根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明,首先合成單鏈cDNA(20 μL體系),按照SuperReal熒光定量預混試劑增強版試劑盒說明,向?qū)磻准尤?× SuperReal PreMix Plus (with SYBR Green I) 10 μL、正向引物(10 μmol/L)0.6 μL、反向引物(10 μmol/L)0.6 μL、cDNA模板2 μL、50× ROX Reference Dye 0.4 μL,加RNase-free ddH2O至20 μL。反應條件:第一步預變性:95℃,15 min,1個循環(huán);第二步PCR反應:95℃變性10 s,60℃退火/延伸60 s,共40個循環(huán)。TNF-α、IL-6、β-actin引物由上海生工生物股份有限公司設計(參見表1)。每次擴增設置β-actin基因為內(nèi)參照,用ABI 7500實時熒光定量PCR儀自帶軟件進行結(jié)果分析。

    (4)Western blot檢測心肌組織IκBα、p-p65、p65蛋白的表達水平:冰上剪碎心肌組織,按說明加入RIPA裂解液I(每100 g組織加入RIPA液1 mL、蛋白酶抑制劑1 μL、磷酸酶抑制劑5 μL)并勻漿,4℃放置10 min,期間劇烈震蕩3~4次,12 000 r/min,4℃離心5 min,取上清。BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度,并分裝50 μg心肌組織蛋白樣本。行10% SDS-PAGE分離膠電泳,之后濕法轉(zhuǎn)到PVDF膜上(Millipore,美國)。Western blot BSA封閉液體(1× PBS)于水平搖床室溫封閉1 h,分別孵以IκBα一抗(1∶2500稀釋)、p-p65一抗(1∶1000稀釋)、p65一抗(1∶2500稀釋)、β-actin一抗(1∶2500稀釋),4℃搖床過夜。次晨1× TBST洗膜10 min,重復3次后加入二抗(1∶20 000稀釋),37℃孵育1 h。1× TBST洗膜10 min,重復3次,ECL顯影,保存圖像,用Image Lab 5.1軟件計算蛋白條帶面積,結(jié)果以目的蛋白/內(nèi)參吸光度的比值表示。β-actin作為內(nèi)參使用。各組實驗重復3次。

    1.4 統(tǒng)計學方法

    表1 qRT-PCR引物序列

    2 結(jié)果

    2.1 心臟重量指數(shù)結(jié)果

    與正常對照組比較,模型組的HWI、LVWI增加(P< 0.05);與模型組比較,tempol組HWI、LVWI減小(P< 0.05)。結(jié)果參見表2。

    2.2 心肌組織HE染色結(jié)果

    鏡下觀察結(jié)果顯示,與正常對照組比較,模型組大鼠心肌組織肌纖維增粗、心肌結(jié)構(gòu)紊亂、心肌細胞橫截面積增大,胞核深染;與模型組比較,tempol組心肌結(jié)構(gòu)紊亂、心肌細胞肥大程度降低。見圖1。

    2.3 心肌組織Masson染色結(jié)果

    鏡下觀察結(jié)果顯示,正常對照組多為紅色為主的心肌纖維及藍色的細胞核,心肌間質(zhì)僅見少許淡藍色的膠原纖維;與正常對照組相比,心肌肥厚模型組大鼠心肌纖維化加重,心肌間質(zhì)膠原纖維增加;與模型組相比,tempol組心肌纖維化程度改善,間質(zhì)膠原纖維減少。見圖2。

    表2 各實驗組心臟重量指數(shù)結(jié)果

    注:與正常對照組相比,*P< 0.05;與模型組相比,#P< 0.05。

    Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05.

    2.4 心肌組織TNF-α、IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

    與正常對照組比較,模型組TNF-α、IL-6 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯增加(P< 0.05);與模型組比較,tempol組TNF-α、IL-6 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平降低,差異有顯著性(P< 0.05)。結(jié)果參見表3。

    注:A:正常對照組;B:Tempol組;C:模型組。圖1 各實驗組心肌組織HE染色結(jié)果(× 200)Note. A: Normal control group; B: Tempol group; C: Model group.Fig.1 Myocardial tissues of the rats in each group. HE staining

    注:A:正常對照組;B:Tempol組;C:模型組。圖2 各實驗組心肌組織Masson染色結(jié)果(× 200)Note. A: Normal control group; B: Tempol group; C: Model group.Fig.2 Myocardial tissues of the rats in each group. Masson staining

    2.5 心肌組織IκBα、p-p65、p65蛋白的表達水平

    與正常對照組比較,模型組p-p65/p65的表達明顯增加,NF-κB抑制蛋白IκBα表達降低(P< 0.05);與模型組比較,tempol組IκBα表達增加,p-p65/p65的表達有不同程度降低(P< 0.05)。見圖3。

    3 討論

    心肌肥厚(myocardial hypertrophy,MH)是心肌組織壓力超負荷的一種代償性反應,心肌肥厚發(fā)生過程伴隨心肌重構(gòu),其主要病理變化包括心肌細胞肥大、心肌間質(zhì)增殖以及心肌細胞外基質(zhì)重建等;而長期的心肌病理性肥厚可引起心臟舒張和收縮功能不全,最終導致心肌缺血、心律失常、心衰和猝死等[11-13]。心肌肥厚的發(fā)生機制與多種因素相關(guān),心肌細胞對多種刺激因素所產(chǎn)生的適應性反應,其病理過程復雜。因此如何有效的防治心肌細胞肥厚、心臟病理性重構(gòu)是心血管科學研究的重要課題,深入探索心肌病理性重構(gòu)的發(fā)生機制及尋找有效的治療靶點對防治心肌肥厚意義重大。

    研究發(fā)現(xiàn),NF-κB信號通路在心肌細胞的病理變化及心室重構(gòu)中作用很大[14-17]。NF-κB是廣泛存在于細胞內(nèi)的一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子,最常見的NF-κB二聚體是p65與p50組成的異二聚體。在靜息狀態(tài)下,NF-κB的抑制蛋白IκB蛋白家族之一IκBα與NF-κB的p65、p50兩個亞單位以失活狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中。促炎性或促氧化物直接刺激機體產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),改變細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài),IκB激酶(IκB kinase,IKK)被激活,從而導致IκB蛋白磷酸化、泛素化,隨后被蛋白酶體降解,NF-κB二聚體得到釋放并迅速移位到細胞核誘導相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄,導致組織損傷,參與多種心血管疾病的病理過程[14, 18]。近年來研究發(fā)現(xiàn)一些氮氧自由基(nitroxide radicals,NRs)等抗氧化劑可以通過清除過量產(chǎn)生的ROS,抑制脂質(zhì)過氧化,維持機體抗氧化酶系正常活性,從而減輕氧化應激對實驗動物的病理損害,有效地預防和逆轉(zhuǎn)肥厚反應,為臨床防治心肌肥厚開辟新的思路和方法[19-20]。NRs具有廣闊的臨床應用前景。

    表3 各實驗組心肌組織TNF-α、IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

    注:與正常對照組相比,*P< 0.05;與模型組相比,#P< 0.05。

    Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05.

    注:A:各組p-p65、p65蛋白Western blot結(jié)果;B:各組IκBα蛋白Western blot結(jié)果;C:p65、p-p65、p-p65/p65蛋白半定量統(tǒng)計圖,n=9;D:IκBα蛋白半定量統(tǒng)計圖,n=9。1:對照組;2:Tempol組;3:模型組。與對照組相比,*P< 0.05;與模型組相比,#P< 0.05。圖3 心肌組織IκBα、p-p65、p65蛋白的表達水平Note. A: Western blot of p-p65 and p65 in each group. B: Western blot of IκBα in each group. C: Semi-quantitative histogram of p65, p-p65 and p-p65/65, n=9. D: Semi-quantitative histogram of IκBα, n=9. 1: Control group; 2: Tempol group; 3: Model group. Compared with the control group,*P< 0.05. Compared with the model group,# P< 0.05.Fig.3 Western blot analysis of IκBα, p-p65 and p65 expression in the myocardial tissues of each group

    本項目通過皮下注射異丙腎上腺素ISO的方法建立大鼠心肌肥厚模型,然后給予氮氧自由基tempol干預,研究氮氧自由基tempol干預后ISO誘導的心肌肥厚大鼠NF-κB信號通路及相關(guān)炎癥因子的變化,并探討其對心肌肥厚的保護作用。結(jié)果顯示,與正常對照組比較,心肌肥厚模型組的HWI、LVWI增加,心肌HE染色見肌纖維增粗、心肌結(jié)構(gòu)紊亂、心肌細胞表面積增大,間質(zhì)見炎性細胞浸潤,說明ISO成功誘導了大鼠心肌肥厚模型;與正常對照組比較,心肌肥厚模型組的TNF-α、IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平、p-p65/p65水平明顯增加,NF-κB抑制蛋白IκBα表達減少(P< 0.05),說明經(jīng)ISO誘導的心肌肥厚模型激活了NF-κB信號通路。與模型組比較,tempol干預組HWI、LVWI減小(P< 0.05),TNF-α、IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平、p-p65/p65的表達有不同程度降低,NF-κB抑制蛋白IκBα表達增加,降解減少(P< 0.05),HE染色見心肌結(jié)構(gòu)紊亂、心肌細胞肥大程度降低,說明tempol對ISO誘導的心肌肥厚有治療作用,且對NF-κB信號通路有抑制作用。因此我們推測,tempol對心肌肥厚的干預作用可能與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。

    在今后的研究中,進一步研究tempol、心肌肥厚、NF-κB信號通路三者的相關(guān)關(guān)系,為肥厚性心肌病的防治提供理論和實驗依據(jù),對尋找病理性心肌肥厚相關(guān)治療靶點具有重要意義。

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