大鼠壓瘡局部不同干預(yù)溫度對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響

王 晴，杜曉菲，邢鳳梅，汪鳳蘭，張小麗

(華北理工大學(xué)護(hù)理與康復(fù)學(xué)院，河北 唐山 063000)

壓瘡是一種慢性皮膚潰瘍，常見于老年患者和長期臥床患者。壓瘡一旦發(fā)生，經(jīng)久不愈，給病人帶來極大的痛苦，甚至?xí)蚶^發(fā)感染致全身衰竭而危及生命。據(jù)報(bào)道[1]，壓瘡會(huì)使老年患者的死亡率升高3倍。探索防治壓瘡的有效方法是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。目前，關(guān)于壓瘡防治過程中如何對局部皮膚溫度進(jìn)行干預(yù)，日益引起人們的重視。傳統(tǒng)的壓瘡治療方法，多為熱干預(yù)的方法，如使用烤燈、紅外線照射等。但近年的研究顯示[2]，熱療方法可能會(huì)加重壓瘡損傷，而進(jìn)行冷干預(yù)具有良好效果。在壓瘡的防治中，冷、熱干預(yù)哪種方式更有效，尚未形成定論。目前認(rèn)為，缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是壓瘡形成最主要的機(jī)制[3]，而在壓瘡形成過程中，局部組織由于受壓產(chǎn)生缺血、缺氧，氧自由基增多，鈣超載等病理現(xiàn)象，這些都會(huì)誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，過度的ERS可通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，造成組織損傷[4]。本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠壓瘡局部分別進(jìn)行冷、熱干預(yù)，觀察ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況，比較不同溫度干預(yù)的治療效果，為臨床防治壓瘡提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性成年SD大鼠40只(質(zhì)量為250～300 g)，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供 [SCXK (京) 2014-0004]。飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 [SYXK (冀) 2015-0038]，飼養(yǎng)環(huán)境為：恒溫(18℃～24℃)，恒濕(45%～50%)，以及明暗交替各12 h。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合校動(dòng)物倫理管理委員會(huì)的規(guī)定(15-098)，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

兔源GRP78單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology)，兔源CHOP單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology)，兔源caspase-12單克隆抗體(英國Abcam公司)，兔源GAPDH單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology)，F(xiàn)ITC熒光素標(biāo)記羊抗兔IgG (H+L)(美國KPL公司)，TUNEL試劑盒(美國Chemicon公司)。

酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠)，壓瘡裝置(唐山鼓風(fēng)機(jī)器械制造廠)，自制恒溫箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型裝置制作

圖1 壓瘡造模示意圖Fig.1 The pressure ulcer modeling device

(1)壓瘡裝置：根據(jù)姜麗萍等[5]的方法設(shè)計(jì)壓瘡裝置。該裝置主要由固定支架、施壓柱(其頭端為圓形底面，其半徑0.5 cm)以及泡沫板組成(見圖1)。已知造模過程中需保持大鼠受壓的部位和壓強(qiáng)不變，因施壓柱頭端底面面積一定，通過在上面增減砝碼便可達(dá)到受壓部位所需壓強(qiáng)。

(2)恒溫箱：該裝置主要由溫度計(jì)、泡沫箱組成，在泡沫箱頂端設(shè)置通風(fēng)孔，可使外界空氣與箱內(nèi)空氣相通(見圖2)?？赏ㄟ^在泡沫箱內(nèi)放置冰袋或熱水袋來改變箱內(nèi)溫度，使其變成預(yù)期溫度Δt。使用時(shí)，將大鼠受壓部位放入箱內(nèi)，并根據(jù)溫度計(jì)的變化隨時(shí)打開通風(fēng)孔對箱內(nèi)溫度進(jìn)行調(diào)整，使箱內(nèi)溫度始終保持在(Δt±1) ℃。

1.3.2 大鼠壓瘡模型的制備

根據(jù)姜麗萍等[5]的方法建立大鼠壓瘡缺血再灌注損傷模型。使用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)對大鼠腹腔注射，麻醉后側(cè)臥位固定，在大鼠一側(cè)大腿股薄肌處剪毛，使皮膚暴露，在此處施加170 mmHg(22.47 kPa)的壓力。造模過程為5個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括缺血(施壓)2 h，再灌注(放松)0.5 h。造模時(shí)，將實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度保持在22℃，為保證大鼠的麻醉狀態(tài)按需補(bǔ)充麻藥。

圖2 溫度干預(yù)示意圖Fig.2 The temperature intervention device

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法

將40只SPF級(jí)雄性成年SD大鼠隨機(jī)分成sham組、模型組、熱干預(yù)組和冷干預(yù)組4組，按如下方法處理：

(1)Sham組(10只)：只麻醉，不做處理。

(2)模型組(10只)：麻醉后，在常溫(22℃)下實(shí)施5個(gè)缺血再灌注循環(huán)。

(3)冷干預(yù)組(10只)：將常溫22℃設(shè)為Δt，熱干預(yù)溫度=(Δt-10)℃=12℃。將大鼠麻醉后實(shí)施5個(gè)缺血再灌注循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)的缺血階段(1 h)在常溫下進(jìn)行，再灌注階段(0.5 h)需將受壓部位放入溫度保持在12℃的恒溫箱中。

(4)熱干預(yù)組(10只)：將常溫設(shè)為Δt，熱干預(yù)溫度=(Δt + 10) ℃=32℃。將大鼠麻醉后實(shí)施5個(gè)缺血再灌注循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的缺血階段(2 h)在常溫下進(jìn)行，再灌注階段(0.5 h)需將受壓部位放入溫度保持在32℃的恒溫箱中。

冷干預(yù)組和熱干預(yù)組的溫度參考Lee等[6]的實(shí)驗(yàn)方法設(shè)置，但由于二者實(shí)驗(yàn)方案不同，本實(shí)驗(yàn)在其基礎(chǔ)上做了些許改動(dòng)。

1.3.4 檢測方法

在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)于冰上剪取各組大鼠受壓部位肌肉組織，放入4℃生理鹽水中洗凈血液，用濾紙吸干水分，取大小為0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm的組織放于4%多聚甲醛中固定，用于制備石蠟切片，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光檢測以及細(xì)胞凋亡的檢測；另取500 mg組織放于-80℃超低溫冰箱保存，用于Western blot檢測。

(1)HE染色檢測骨骼肌的病理變化：取適量肌肉組織，用4%多聚甲醛固定后，制備骨骼肌組織石蠟切片?？酒撓?，蘇木素染核，鹽酸酒精分化，入水返藍(lán)，加伊紅染色，水洗并鏡下觀察，脫水，透明，中性樹膠封片。

(2)Western blot檢測GRP78、caspase-12與CHOP蛋白的表達(dá)水平：取適量肌肉組織，提取蛋白，計(jì)算濃度，確定上樣量，分裝、變性。制備SDS-PAGE凝膠，蛋白上樣，電泳并轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)入蛋白的膜用5%脫脂牛奶封閉，加一抗后4℃過夜。次日用TBST緩沖液洗膜，加入相應(yīng)的二抗，37℃孵育1～2 h。再次洗膜，顯色，通過Image J軟件分析各組條帶的灰度值。

(3)免疫熒光檢測caspase-12與CHOP的表達(dá)水平：取適量肌肉組織，用4%多聚甲醛固定后，制備心肌組織石蠟切片?？酒撓?，用檸檬酸鈉熱修復(fù)，3% H2O2滅活內(nèi)源性酶，用10%山羊血清封閉后加一抗，4℃濕盒過夜。次日加熒光標(biāo)記二抗，37℃暗濕盒0.5 h，PBS沖洗，DAPI染核，再次沖洗后封片，在熒光顯微鏡下觀察。

(4)TUNEL檢測細(xì)胞的凋亡情況：采用Chemicon公司的TUNEL凋亡檢測試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。光鏡下觀察染色結(jié)果并拍照計(jì)數(shù)。陽性表現(xiàn)為細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，成棕褐色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色檢測大鼠受壓部位骨骼肌的病理變化結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，sham組肌纖維形態(tài)正常，排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰，無明顯炎性細(xì)胞浸潤；模型組肌纖維間質(zhì)增寬，排列紊亂，部分出現(xiàn)明顯的斷裂、溶解，間隙處有明顯的炎性細(xì)胞浸潤；熱干預(yù)組與模型組相比損傷程度加重，大部分肌纖維溶解、斷裂，出現(xiàn)玻璃樣改變，炎性細(xì)胞浸潤增多；冷干預(yù)組與模型組相比損傷減輕，肌纖維排列較為整齊，出現(xiàn)的溶解、斷裂較少，炎性細(xì)胞浸潤較少(見圖3)。

注：A：Sham組；B：模型組；C：熱干預(yù)組；D：冷干預(yù)組。圖3 各組骨骼肌HE染色病理變化(× 200)Note. A: Sham group; B: Model group; C: High-temperature intervention group; D: Low-temperature intervention group.Fig.3 Pathological changes of the skeletal muscle tissues in the rats. HE staining

2.2 Western blot檢測大鼠受壓部位GRP78、caspase-12與CHOP蛋白的表達(dá)結(jié)果

與sham組相比，模型組GRP78、caspase-12與CHOP表達(dá)均顯著增加(P< 0.05)；與模型組相比，熱干預(yù)組三種因子的表達(dá)水平進(jìn)一步升高(P< 0.05)，而冷干預(yù)組的表達(dá)水平有所下降(圖4)。

注：A：蛋白GRP78、caspase-12和CHOP的Western blot檢測結(jié)果；B、C、D：分別為GRP78、caspase-12和CHOP的Western blot檢測結(jié)果柱形圖。1：Sham組；2：模型組；3：熱干預(yù)組；4：冷干預(yù)組。與sham組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05。圖4 Western blot檢測各組GRP78、caspase-12和CHOP的表達(dá)水平Note. A: Electrophoretic map of the proteins. B, C, D: Histograms of the protein expressions. 1: Sham group; 2: Model group; 3: High-temperature intervention group; 4: Low-temperature intervention group. Compared with the sham group,* P< 0.05. Compared with the model group,# P< 0.05.Fig.4 Expression levels of GRP78, caspase-12 and CHOP proteins in the pressure ulcer tissues of the rats detected by Western blot

2.3 免疫熒光檢測大鼠受壓部位骨骼肌細(xì)胞的凋亡情況

免疫熒光結(jié)果顯示，sham組幾乎檢測不到caspase-12與CHOP的熒光表達(dá)；模型組兩種因子的表達(dá)量均明顯增加，且主要表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi)。與模型組相比，兩種因子在熱干預(yù)組的熒光表達(dá)量進(jìn)一步增加，而在冷干預(yù)組有所減少(見圖5、圖6)。

注：A：Sham組；B：模型組；C：熱干預(yù)組；D：冷干預(yù)組。圖5 免疫熒光檢測各組CHOP的表達(dá)(× 400)Note. A: Sham group; B: Model group; C: High-temperature intervention group; D: Low-temperature intervention group.Fig.5 Expression of CHOP in the pressure ulcer tissues of rats detected by immunofluorescence assay

注：A：Sham組；B：模型組；C：熱干預(yù)組；D：冷干預(yù)組。圖6 免疫熒光檢測各組caspase-12的表達(dá)(× 400)Note. A: Sham group; B: Model group; C: High-temperature intervention group; D: Low-temperature intervention group.Fig.6 Expression of caspase-12 in the pressure ulcer tissues of the rats detected by immunofluorescence assay

2.4 TUNEL染色檢測大鼠受壓部位骨骼肌細(xì)胞的凋亡情況

TUNEL染色結(jié)果顯示，sham組僅有少數(shù)陽性染色細(xì)胞核，模型組陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加。與模型組相比，凋亡細(xì)胞數(shù)在熱干預(yù)組進(jìn)一步增加，而在冷干預(yù)組有所減少(見圖7、圖8)。

注：A：Sham組；B：模型組；C：熱干預(yù)組；D：冷干預(yù)組。箭頭指示凋亡細(xì)胞。圖7 TUNEL檢測各組骨骼肌細(xì)胞凋亡情況(× 200)Note. A: Sham group; B: Model group; C: High-temperature intervention group; D: Low-temperature intervention group. Arrows indicate apoptotic cells.Fig.7 Cell apoptosis in the pressure ulcer tissues of rats detected by TUNEL assay

注：A：Sham組；B：模型組；C：熱干預(yù)組；D：冷干預(yù)組。與sham組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05。圖8 TUNEL檢測各組凋亡細(xì)胞數(shù)量Note. A: Sham group; B: Model group; C: High-temperature intervention group; D: Low-temperature intervention group. Compared with the sham group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05.Fig.8 Number of apoptotic cells in the pressure ulcer tissues of the rats detected by TUNEL assay

3 討論

近年研究顯示[3]，缺血再灌注損傷是壓瘡形成最主要的機(jī)制，而其誘導(dǎo)的深部組織損傷(deep tissue injury，DTI)是壓瘡發(fā)展的重要原因，因此本實(shí)驗(yàn)以肌肉組織為中心研究壓瘡損傷。骨骼肌和其他組織不同，細(xì)胞內(nèi)含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成、儲(chǔ)存鈣離子等[7]。在壓瘡形成過程中，局部組織由于受壓產(chǎn)生缺血、缺氧，氧自由基增多，鈣超載等病理現(xiàn)象，骨骼肌細(xì)胞受到這些病理因素刺激致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。而過度的ERS會(huì)通過活化相關(guān)因子介導(dǎo)凋亡途徑而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2]。因此，抑制ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡成為減輕壓瘡損傷的關(guān)鍵。

過去在臨床防治壓瘡時(shí)，多應(yīng)用局部熱干預(yù)，在《基礎(chǔ)護(hù)理學(xué)》教材中寫到[8]：對Ⅱ期壓瘡用紅外線照射瘡面，Ⅲ期壓瘡應(yīng)用鵝頸燈照射，通過促進(jìn)受壓部位血液循環(huán)，提高細(xì)胞功能來減少組織損傷。但近些年的研究顯示[2]：當(dāng)受壓區(qū)域溫度升高時(shí)，會(huì)增加局部組織的代謝氧需要量，從而增加壓瘡的易發(fā)性。相反，降低局部溫度可通過降低組織代謝，減少需氧量，抑制炎性因子擴(kuò)散等來減輕缺血再灌注損傷[6]。近來陸續(xù)有研究顯示[9-11]，在壓瘡的防治過程中，應(yīng)用局部冷干預(yù)具有良好的效果。目前關(guān)于壓瘡溫度干預(yù)的研究大多為臨床上的研究，通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)獲得的理論支持不足。因此，通過對ERS相關(guān)蛋白及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的研究，對比局部冷、熱干預(yù)對大鼠壓瘡的治療效果，為臨床防治壓瘡提供依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)HE和TUNEL結(jié)果顯示，模型組骨骼肌損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，說明造模成功。而冷干預(yù)組與模型組相比損傷減輕，凋亡細(xì)胞減少，說明降低局部溫度可減輕壓瘡缺血再灌注損傷，這與Lee等[6]的研究結(jié)果相同。熱干預(yù)組與模型組相比損傷加重，說明局部溫度升高會(huì)加重壓瘡組織的損傷。

為了進(jìn)一步探討各組大鼠壓瘡組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡的情況，本實(shí)驗(yàn)研究了ERS相關(guān)蛋白GRP78、caspase-12與CHOP的表達(dá)情況。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，正常情況下與跨膜蛋白結(jié)合以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境極度敏感，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被破壞，即發(fā)生ERS時(shí)，GRP78會(huì)與跨膜蛋白解離而表達(dá)增高[12]。因此，GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白，一定程度上反映ERS的程度。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組GRP78蛋白表達(dá)高于sham組，表明壓瘡缺血再灌注損傷會(huì)破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，誘發(fā)ERS，這與Koyama等[13]的研究結(jié)果一致。與模型組相比，熱處理組GRP78蛋白表達(dá)進(jìn)一步上升，表明局部熱處理會(huì)加重ERS反應(yīng)程度；而冷處理組GRP78表達(dá)有所下降，說明局部冷處理會(huì)在一定程度上抑制ERS反應(yīng)，這與高宇等[14]的研究結(jié)果相同。

研究表明[4]，適度的ERS可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)，增加細(xì)胞對刺激的耐受力，但持續(xù)而嚴(yán)重的ERS會(huì)通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，造成細(xì)胞損傷。在這個(gè)過程中，CHOP、caspase-12起關(guān)鍵作用。CHOP是ERS早期凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，在多條ERS介導(dǎo)的凋亡通路中充當(dāng)下游凋亡信號(hào)分子，可阻滯細(xì)胞分裂誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，CHOP一定程度上可反映ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平[7]。caspase-12以酶原的形式定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，產(chǎn)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在發(fā)生ERS時(shí)被激活，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性的凋亡因子[15]。這兩種因子介導(dǎo)了ERS誘導(dǎo)的凋亡途徑，在壓瘡的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示，與sham組相比，模型組能夠顯著上調(diào)CHOP、caspase-12的表達(dá)，說明壓瘡損傷誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，介導(dǎo)凋亡通路生成，引起骨骼肌細(xì)胞凋亡；而局部熱干預(yù)使這兩種因子的表達(dá)在模型組的基礎(chǔ)上進(jìn)一步升高，說明溫度升高可能會(huì)因加劇ERS而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；經(jīng)局部冷干預(yù)后，壓瘡組織中CHOP、caspase-12的表達(dá)水平下降，說明冷干預(yù)會(huì)抑制細(xì)胞凋亡的進(jìn)展，這可能與低溫抑制ERS有關(guān)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，局部冷干預(yù)可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡通路而減輕大鼠壓瘡損傷；與之相反，局部熱干預(yù)可能會(huì)因加劇ERS而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，進(jìn)而加重大鼠壓瘡損傷。因此，在對壓瘡的臨床防治過程中，可能不宜使用熱干預(yù)方法，使用冷干預(yù)可能會(huì)有良好效果。

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