沉默白細(xì)胞介素-1β基因?qū)顾桠g挫傷大鼠波形蛋白的影響①

胡析，牛英杰，黃媛，李盈潔，曾茜，向陽(yáng)，張曉，梁楠

1.成都醫(yī)學(xué)院，a.臨床醫(yī)學(xué)院；b.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院；c.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，四川成都市610500

脊髓損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的外傷，常由于車輛事故、高空墜落等造成，給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的心理壓力和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。脊髓初期機(jī)械性損傷導(dǎo)致脊髓缺血、缺氧、水腫、炎癥、脂質(zhì)過(guò)氧化和自由基損傷等二次損傷，其中炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)損傷和功能喪失的重要原因[3-4]。

白細(xì)胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)是一種重要的炎性因子，可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，引起白細(xì)胞聚集，刺激白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)黏附分子，進(jìn)而導(dǎo)致過(guò)度的炎癥反應(yīng)和脊髓缺血，還能促進(jìn)自由基和興奮性氨基酸等神經(jīng)毒性物質(zhì)的產(chǎn)生和釋放[5-6]。IL-1β在脊髓損傷早期過(guò)量表達(dá)，參與急性脊髓損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程，加重炎癥反應(yīng)，造成組織損傷，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[7-8]。

波形蛋白(vimentin,Vim)是目前已知表達(dá)最廣泛的Ⅲ型中間絲蛋白，與微管、微絲一起構(gòu)成細(xì)胞骨架，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分化、發(fā)育以及損傷修復(fù)等生物學(xué)行為密切相關(guān)[9]。在脊髓損傷早期，炎癥反應(yīng)刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)。星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、肥大，發(fā)生反應(yīng)性膠質(zhì)增生，與結(jié)締組織等形成膠質(zhì)瘢痕[10]。在脊髓損傷早期，IL-1β作為炎癥因子不僅加重脊髓缺氧缺血區(qū)域的炎癥反應(yīng)，還會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生。在脊髓損傷晚期，脊髓膠質(zhì)瘢痕導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)功能難以恢復(fù)[11]。波形蛋白不僅能維持細(xì)胞骨架穩(wěn)定，還與損傷后膠質(zhì)瘢痕形成和抑制軸突再生有關(guān)[12]。

本研究采用免疫組化技術(shù)以及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)，對(duì)波形蛋白表達(dá)進(jìn)行定位和定量研究。利用慢病毒干擾IL-1β基因表達(dá)，生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)IL-1β與波形蛋白的關(guān)系，了解脊髓損傷后干預(yù)IL-1β的表達(dá)對(duì)脊髓膠質(zhì)瘢痕的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年Sprague-Dawley大鼠30只，3月齡，雌雄不限，體質(zhì)量200～220 g，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院提供，許可證號(hào)SCXK(川)2013-19。分籠飼養(yǎng)，溫度20～25℃。大鼠編號(hào)，采用Excel生成隨機(jī)數(shù)，將大鼠分為空載組(n=15)和干擾組(n=15)，兩組再分為3 d、7 d和28 d三個(gè)亞組，3 d和28 d亞組各3只大鼠，7 d亞組9只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒質(zhì)粒的制備

引物和質(zhì)粒均購(gòu)自GeneCopoeia。將IL-1βsiRNA序列克隆到紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,RFP)標(biāo)記的載體中，將該載體5μg和慢病毒1μl包裝質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，生成慢病毒質(zhì)粒。48 h后取含有慢病毒細(xì)胞的上清液，置于0.45μm醋酸纖維素過(guò)濾器中過(guò)濾，除去濾液，取5 ml，4℃、3500 r/min離心25 min，除去上清液，沉淀重新溶解在PBS 500 μl中。-80℃冰箱凍存。

1.2.2 載體注射

大鼠用3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉，雄性30 mg/kg，雌性20 mg/kg。俯臥位固定，常規(guī)備皮、消毒，背部T9-11水平正中切口，分離筋膜、肌肉，剝除T11棘突及椎板，充分暴露T10節(jié)段脊髓。使用DW-5腦立體定位儀(成都泰盟)于T10節(jié)段脊髓擬打擊點(diǎn)左右兩側(cè)各注射慢病毒質(zhì)粒5μl(干擾組)或含有空載體的質(zhì)粒5μl(空載組)，進(jìn)針3～5μm，朝著大鼠尾側(cè)進(jìn)針，與水平線呈45°。依次縫合肌肉、筋膜及皮膚，消毒及抗感染處理后獨(dú)籠飼養(yǎng)。

1.3 模型制備

大鼠在注射質(zhì)粒48 h后，同法麻醉，常規(guī)消毒，拆線打開(kāi)切口，采用Allen法以自行制作的打擊裝置，用10 g沖擊棒自30 mm高處自由墜落，致傷脊髓。逐層縫合傷口。

術(shù)后大鼠注射青霉素16萬(wàn)U、5%葡萄糖氯化鈉溶液2 ml，小心護(hù)理，獨(dú)籠飼養(yǎng)。每天早晚擠壓大鼠膀胱協(xié)助排尿各2次，至排尿反射恢復(fù)。注意觀察皮膚有無(wú)壓瘡或感染、下肢有無(wú)潰爛。室溫維持25～30℃，正常飲食。

大鼠的模型操作和術(shù)后護(hù)理遵循《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》、《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》、《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》的規(guī)定。

1.4 免疫組化染色

各組術(shù)后3 d、7 d及28 d各取3只大鼠，同法麻醉，俯臥位固定，自左心室插管，剪開(kāi)右心耳，快速灌注4℃生理鹽水，至肝臟變?yōu)辄S褐色，再灌注4%多聚甲醛20 min。打開(kāi)椎弓管，暴露并切除T8、T10、T12脊髓，固定48 h后放入自動(dòng)脫水包埋機(jī)，常規(guī)制備石蠟切片，厚5μm，取連續(xù)5張貼片、烤片。

酶免疫組化染色采用SP法?？酒?、脫蠟及水化，高壓熱抗原修復(fù)，3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶，正常山羊血清封閉非特異性抗原。加波形蛋白一抗(1∶200，武漢博士德)4℃過(guò)夜；次日取出復(fù)溫，0.01 mol/L PBS漂洗，依次加入SP試劑(SP-9001，北京中杉金橋)B液與C液，37℃孵育，間隔使用PBS漂洗；配制DAB-H2O2顯色液，室溫下反應(yīng)。顯微鏡下顯色充分，及時(shí)用0.01 mol/L PBS終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，1%鹽酸-酒精分色，自來(lái)水返藍(lán)，梯度灑精逐級(jí)脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。OLYMPUS光學(xué)顯微鏡400倍下觀察免疫陽(yáng)性反應(yīng)物分布情況。

1.5 RT-qPCR

術(shù)后7 d大鼠6只同法麻醉，以損傷段為中心，取出損傷段脊髓1 cm，-80℃冰箱保存。脊髓放入經(jīng)過(guò)DEPC水處理過(guò)后的玻璃勻漿器中，經(jīng)Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇處理，得到總RNA，去核酸水30μl溶解，保存于-80℃冰箱。取所得RNA經(jīng)全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo,1510)測(cè)量OD值，檢測(cè)其純度合格后，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(Revert AidTMFrist Strand cDNA Synthesis Kit，MBI公司)，然后進(jìn)行引物擴(kuò)增。擴(kuò)增參數(shù)：95℃2 min，95℃15 s，52℃20 s，60 ℃ 40 s， 45個(gè)循環(huán)。讀取Ct，按2-ΔΔCt計(jì)算出相對(duì)含量。

引物如下：

IL-1β：正向 5'-GAG CTG AAA GCT CTC CAC C-3'；逆向 5'-TTCCATCTTCTTCTTTGGGT-3'。

波形蛋白：正向5'-CTC TGC CAC TCT TGC TCC TGG A-3'；逆向5'-AAA TAT CTG ACC AAC TTGTTA C-3'。

β-actin：正向 5'-GAA GAT CAA GAT CAT TGC T-3'；逆向 5'-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3'。

1.6 生物信息學(xué)分析

通過(guò)http://www.genemania.org/進(jìn)行搜索。物種選擇H.sapiens(human)和R.norvegicus(rat)，目的基因選擇IL-1β和波形蛋白。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以(xˉ±s)表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析

2.1.1 人類基因

IL-1β與肌聯(lián)蛋白(Titin,TTN)存在共同表達(dá)關(guān)系，與IL-1受體1(IL1R1)位于同一信號(hào)通路，擁有相同的物理反應(yīng)結(jié)構(gòu)域。波形蛋白與IL1R1共表達(dá)，與TTN存在共同表達(dá)，并位于同一信號(hào)通路中。見(jiàn)圖1。

2.1.2 大鼠基因

波形蛋白與IL-18、CXC類趨化因子10(C-X-C motif chemokine ligand 10,CXCL10)、S100鈣結(jié)合蛋白A8(S100 calcium binding protein A8,S100A8)、S100A9、受體相互作用蛋白激酶-3(receptor interacting serine/threonine kinase 3,RIPK3)、趨化因子C-C配體3(C-C motif chemokine ligand 3,CCL3)存在共同表達(dá)關(guān)系。波形蛋白與CXCL2和磷脂酶A2-ⅣA(Phospholipase A2 Group IVA,PLA2G4A)存在共同表達(dá)和共同的物理反應(yīng)結(jié)構(gòu)域的關(guān)系。IL-1β與S100A8、S100A9、CCL3、CXCL2、PLA2G4A、CXCL1、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)存在共同表達(dá)。IL-1β與IL18存在共同表達(dá)和共享蛋白結(jié)構(gòu)域，與CXCL10和RIPK3存在共同表達(dá)和共同定位。見(jiàn)圖2。

2.2 免疫組化染色

波形蛋白存在于脊髓前角神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中。各時(shí)間點(diǎn)，干擾組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均低于空載組(P＜0.05)。見(jiàn)表1、圖3。

圖1 人類基因中IL-1β與波形蛋白的預(yù)測(cè)關(guān)系

圖2 大鼠基因中IL-1β與波形蛋白的預(yù)測(cè)關(guān)系

表1 各時(shí)間點(diǎn)各組脊髓中波形蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(/HD)

圖3 各時(shí)間點(diǎn)各組脊髓中波形蛋白表達(dá)(免疫組化染色，400×)

2.3 RT-qPCR

術(shù)后7 d，干擾組波形蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.279±0.023)，較空載組(0.818±0.178)明顯下降(t=6.692,P=0.002)。

3 討論

脊髓損傷是一個(gè)破壞性嚴(yán)重且病理生理比較復(fù)雜的臨床疾病，能夠造成神經(jīng)再生與功能恢復(fù)障礙，可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和自主神經(jīng)功能障礙。

本研究顯示，脊髓損傷后，大鼠神經(jīng)功能改善有限，不足以引起運(yùn)動(dòng)功能有意義的改變；波形蛋白主要在脊髓前角神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)；抑制IL-1β表達(dá)后，波形蛋白表達(dá)明顯下降。

脊髓損傷的功能恢復(fù)與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能密切相關(guān)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分布廣泛，具有支架作用，支持神經(jīng)元胞體和突起保持一定形態(tài)。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在出生后仍然保持一定的分裂能力[13]。

脊髓損傷后限制神經(jīng)再生的主要原因有膠質(zhì)瘢痕形成、抑制性微環(huán)境(硫酸軟骨素蛋白聚糖和髓磷脂相關(guān)抑制因素)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持的缺乏。其中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、波形蛋白和巢蛋白等中間絲蛋白的沉積是主要因素，星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大為特征的反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生[14]。

脊髓損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化與神經(jīng)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在炎癥因子等環(huán)境條件因子的作用下，靜止的星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，細(xì)胞體積肥大、數(shù)量增加，細(xì)胞間互相連接形成致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，過(guò)度表達(dá)中間絲蛋白，如GFAP和波形蛋白[15-16]。

波形蛋白是哺乳動(dòng)物中間絲蛋白的一種，表達(dá)于間充質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，在反應(yīng)型星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)上調(diào)[17-18]。波形蛋白在形成膠質(zhì)瘢痕并抑制軸突再生的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[19-20]。

IL-1β是重要的炎癥因子，在脊髓損傷后早期大量釋放，造成脊髓二次損傷[21]。IL-1β主要來(lái)源于脊髓損傷局部的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)中幾乎檢測(cè)不到IL-1β表達(dá)，但損傷后表達(dá)增加數(shù)倍[22]。宋興華等[23]研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β在脊髓損傷后30 min表達(dá)快速增高，并于損傷后6 h達(dá)到高峰，此后逐漸下降。IL-1β參與合成損傷介質(zhì)，促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致脊髓損傷局部炎癥和水腫[24]，引起脊髓組織潰變和壞死，進(jìn)而形成脊髓空洞。此外，IL-1β還可能參與細(xì)胞凋亡過(guò)程[25]。Nesic等[26]研究表明，IL-1β受體拮抗劑可明顯減少脊髓損傷區(qū)細(xì)胞凋亡。

脊髓損傷后IL-1β對(duì)波形蛋白表達(dá)可能有影響。GeneMANIA生物信息學(xué)分析顯示，IL-1β與波形蛋白存在著多種直接或間接關(guān)系。IL-1β是一種重要的炎性介質(zhì)，在正常脊髓組織中，IL-1βmRNA表達(dá)微弱，而在脊髓損傷后3 h表達(dá)迅速升高，并于12 h達(dá)到峰值；隨后表達(dá)逐漸降低[27]。脊髓損傷后，IL-1β可能參與誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生，促進(jìn)波形蛋白表達(dá)和膠質(zhì)瘢痕形成；抑制波形蛋白表達(dá)可減少瘢痕的形成，促進(jìn)損傷部位軸突的延伸。

綜上所述，波形蛋白廣泛表達(dá)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)損傷后膠質(zhì)瘢痕形成。通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子IL-1β可以影響膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和脊髓瘢痕形成，進(jìn)一步影響脊髓損傷后大鼠功能恢復(fù)，為將來(lái)臨床治療脊髓損傷提供了可能的治療新靶點(diǎn)。

[1]Toyooka T,Nawashiro H,Shinomiya N,et al.Down-regulation of glial fibrillary acidic protein and vimentin by RNA interference improves acute urinary dysfunction associated with spinal cord injury in rats[J].Injury,2011,28(4):607-618.

[2]Bradbury EJ,Carter LM.Manipulating the glial scar:chondroitinase ABC as a therapy for spinal cord injury[J].Brain Res Bull,2011,84(4):306-316.

[3]Cemil B,Topuz K,Demircan MN,et al.Curcumin improvesearly functional results after experimental spinal cord injury[J].Acta Neurochir(Wien),2010,152(9):1583-1590.

[4]de Rivero JP,Lotocki G,Marcillo AE,et al.A molecular platform in neurons regulates inflammation after spinal cord injury[J].JNeurosci,2008,28(13):3404-3414.

[5]Cheng Z,Zhu W,Cao K,et al.Anti-inflammatory mechanism of neural stem cell transplantation in spinal cord injury[J].Int JMol Sci,2016,17(9):E1380.

[6]Cong L,Chen W.Neuroprotective effect of ginsenoside Rd in spinal cord injury rats[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol,2016,119(2):193-201.

[7]Zhao J,Wang L,Li Y.Electroacupuncture alleviates the inflammatory response via effects on M1 and M2 macrophages after spinal cord injury[J].Acupunct Med,2017,35(3):224-230.

[8]Biglari B,Swing T,Child C,et al.A pilot study on temporal changes in IL-1beta and TNF-alpha serum levels after spinal cord injury:the serum level of TNF-alpha in acute SCIpatients as a possible marker for neurological remission[J].Spinal Cord,2015,53(7):510-514.

[9]Endo T,Ajiki T,Inoue H,et al.Early exercise in spinal cord injured rats induces allodynia through TrkB signaling[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,381(3):339-344.

[10]Sun D,Lye-Barthel M,Masland RH,et al.Structural remodeling of fibrous astrocytes after axonal injury [J].J Neurosci,2010,30:14008-14019.

[11]Ekmark-Lewén S,Flygt J,Kiwanuka O,et al.Traumatic axonal injury in the mouse is accompanied by a dynamic inflammatory response,astroglial reactivity and complex behavioral changes[J].J Neuroinflam,2013,10:44.

[12]Lee KW,Zhao X,Im JY,et al.Apoptosis signal-regulating kinase 1 mediates MPTP toxicity and regulates glial activation[J].PLoS One,2012,7(1):e29935.

[13]Wang X,Budel S,Baughman K,et al.Ibuprofen enhances recovery from spinal cord injury by limiting tissue loss and stimulating axonal growth[J].JNeurotrauma,2009,26(4):81-95.

[14]Lin B,Xu Y,Zhang B,et al.MEK inhibition reduces glial scar formation and promotes the recovery of sensorimotor function in rats following spinal cord injury[J].Exp Ther Med,2014,7(1):66-72.

[15]Ritz MF,Hausmann ON.Effect of 17beta-estradiol on functional outcome,release of cytokines,astrocyte reactivity and inflammatory spreading after spinal cord injury in male rats[J].Brain Res,2008,1203:177-188.

[16]Heimfarth L,Loureiro SO,Dutra MF,et al.In vivo treatment with diphenyl ditelluride induces neurodegeneration in striatum of young rats:Implications of MAPK and Akt pathways[J].Toxicol Appl Pharmacol,2012,264:143-152.

[17]Sutoh Yoneyama M,Hatakeyama S,Habuchi T,et al.Vimentin intermediate filament and plectin provide a scaffold for invadopodia,facilitating cancer cell invasion and extravasation for metastasis[J].Eur J Cell Biol,2014,93(4):157-169.

[18]Desclaux M,Perrin FE,Do-Thi A,et al.Lentiviral-mediated silencing of glial fibrillary acidic protein and vimentin promotes anatomical plasticity and functional recovery after spinal cord injury[J].Neurosci Res,2015,93(1):43-55.

[19]Li TZ,Yan Y,Liu Q,et al.Effect of suppressing apoptosissignal regulating kinase 1 on GFAPand vimentin expression and hindlimb mobility in rats after spinal cord injury[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao,2015,35(6):795-800.

[20]Xia Y,Zhao T,Li J,et al.Antisense vimentin cDNA combined with chondroitinase ABC reduces glial scar and cystic cavity formation following spinal cord injury in rats[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,377(2):562-566.

[21]Low K,Blesch A,Herrmann J,et al.A dual promoter lentiviral vector for the in vivo evaluation of gene therapeutic approaches to axon regeneration after spinal cord injury[J].Gene Ther,2010,17(5):577-591.

[22]Ismailo?lu ?,Oral B,Sütcü R,et al.Neuroprotective effects of raloxifene on experimental spinal cord injury in rats[J].Am JMed Sci,2013,345(1):39-44.

[23]宋興華,曹力,艾爾肯,等.大鼠慢性頸髓損傷后頸髓中IL-1β的表達(dá)及其與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].中國(guó)脊柱脊髓雜志,2007,17(3):222-225.

[24]Adams RA,Bauer J,Fliek MJ,et al.The fibrin-derived γ377?395 peptide inhibits mieroglia activation and suppresses relapsing paralysis in central nervous system autoimmune disease[J].JExp Med,2007,204(7):571-582.

[25]Hernandez-Rodriguez J,Segarra M,Vilardell C,et al.Tissue production of pro-inflammatory cytokines(IL-1beta,TNF-alpha and IL-6)correlates with the intensity of the systemic inflammatory response and with corticosteroid requirements in giant-cell arteritis[J].Rheumatology(Oxford),2004,43(3):294-301.

[26]Nesic O,Xu GY,Mcadoo D,et al.IL-1βreceptor antagonist prevents apoptosis and caspase-3 activation after spinal cord injury[J].J Neurotrauma,2001,18(9):947-956.

[27]Paniagua-Torija B,Arevalo-Martin A,Molina-Holgado E,et al.Spinal cord injury induces a long-lasting upregulation of interleukin-1βin astrocytesaround thecentral canal[J].Neuroscience,2015,284:283-289.