通過理性改造提高11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性研究進(jìn)展

吳占東， 韓文杰， 周 同， 張培玉*

(1.青島大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266071；2.濱州職業(yè)學(xué)院 繼續(xù)教育學(xué)院,山東 濱州 256603)

植物細(xì)胞中主要含有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素三種高分子化合物，其中半纖維素是除纖維素之外含量最高的多糖，半纖維素的主要骨架是由木聚糖構(gòu)成的，利用木聚糖酶將木聚糖水解為可發(fā)酵的單糖或寡糖在造紙與飼料工業(yè)中有著很高的應(yīng)用前景，也解決了當(dāng)前浪費(fèi)嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)廢棄物問題[1-3]。木聚糖的構(gòu)成較為復(fù)雜，通常側(cè)鏈都含有不同程度的取代基，如阿拉伯糖、O-乙?；⑽核岷?4-O-甲基葡萄糖醛酸等[4]，因此要完全降解需要一系列酶系協(xié)同作用。能夠降解半纖維素的酶制劑，主要包括β-1,4-木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和阿魏酸酯酶等[5]。一般來說，β-1,4-木聚糖酶能夠從內(nèi)部斷裂木聚糖主鏈的糖苷鍵，釋放出低聚木糖，是半纖維素降解過程中最重要的酶之一。根據(jù)NCBI預(yù)測的不同結(jié)構(gòu)域可將木聚糖酶歸分為不同的糖苷水解酶家族，其中大部分木聚糖酶屬于GH10和GH11家族，而11家族木聚糖酶由于體積較小，比酶活較高(一般大于1 000 U/mg)，有著廣泛的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性而逐漸獲得了更多 關(guān)注，到目前為止，根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示(www.cazy.org)，已經(jīng)有1 182種來自不同微生物產(chǎn)生的11家族木聚糖酶得到確認(rèn)，但只有200多種得到表征，得到晶體結(jié)構(gòu)的只有29種，GH11家族木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)通常是由兩個反向平行并高度螺旋的β折疊和α螺旋相互作用組成一個類似右手的結(jié)構(gòu)(圖1)，在底物結(jié)合裂縫區(qū)域(活性中心)有一對羧酸。

圖1 典型11家族木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)[6]Fig.1 The typical crystal structure of GH11 xylanase[6]

自然條件下大多數(shù)木聚糖酶因為沒有較好的熱穩(wěn)定性和比酶活而不能適應(yīng)工業(yè)化需要。因此，嗜熱型木聚糖酶有著廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景，目前，獲得熱穩(wěn)定木聚糖酶的方法基本只有兩種，一是從嗜熱微生物克隆基因進(jìn)行異源表達(dá)，二是利用分子生物學(xué)方法在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上進(jìn)行理性改造從而提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性，研究者主要通過在酶表面增加二硫鍵，或者將酶蛋白進(jìn)行翻譯后糖基化修飾，或者增強(qiáng)蛋白內(nèi)部疏水作用來增加蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。本文將主要從以上幾個方面對GH11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性分子改造的技術(shù)和方法進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步提高GH11家族木聚糖酶的熱穩(wěn)定性提供參考。

1 GH11家族木聚糖酶改造的常用技術(shù)和方法

1.1 二硫鍵對木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響

二硫鍵是蛋白質(zhì)分子中兩個半胱氨酸之間的-SH基被氧化而形成的存在于硫原子間的鍵，作為一種分子內(nèi)共價鍵對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定有著非常重要的影響。GH11家族木聚糖酶的結(jié)構(gòu)主要由一個α螺旋和兩個反向平行的β折疊片層組成一個半握的右手狀，將二硫鍵引入提高熱穩(wěn)定性一般集中在蛋白質(zhì)表面進(jìn)行，目的都是在不影響酶活性位點的情況下使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。

11家族木聚糖酶N末端對其蛋白分子的穩(wěn)定性有重要影響，因此目前在酶蛋白表面添加體外二硫鍵主要集中于酶的N末端。韓承業(yè)等[7]在來源于里氏木霉Trichdermareesei的木聚糖酶的N末端兩個β折疊片層間添加了一個二硫鍵(T2C-T28C)，發(fā)現(xiàn)突變酶最適溫度由50 ℃提高到60 ℃，70 ℃下的半衰期由1 min提高到了14 min。閔柔等[8]以11 家族耐熱木聚糖酶 EvXyn11TS為研究對象，通過多序列同源比對發(fā)現(xiàn)EvXyn11TSN端存在一個二硫鍵(Cys5-Cys32)，通過定點突變將此二硫鍵去掉后發(fā)現(xiàn)其最適溫度由突變前的85 ℃降為70 ℃，在90 ℃的半衰期由32 min降為9 min，說明N端二硫鍵的存在對木聚糖酶EvXyn11TS的熱穩(wěn)定性有重要影響。高樹娟等[9]以此為基礎(chǔ)，將EvXyn11TS的含有一個二硫鍵的N末端替換到來自米曲霉Aspergillusoryzae的11 家族木聚糖酶AoXyn11A，使重組酶最適溫度由改造前的50 ℃提高到75 ℃，在70 ℃的半衰期由1 min提高到197 min。Cheng等[10]在對來自胃瘤真菌Neocallimastixpatriciarum的11家族木聚糖酶XynCDBFV進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，其擁有一個由11個氨基酸組成的很長的N末端，上面的很多氨基酸殘基能與β片層上的一些殘基形成相互作用力而增強(qiáng)其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，其中第四位的半胱氨酸與β片層的第172位半胱氨酸之間形成的二硫鍵至關(guān)重要，通過定點突變將二硫鍵去掉后發(fā)現(xiàn)其在高溫下的酶活與熱穩(wěn)定性都有了非常明顯的降低。為進(jìn)一步研究XynCDBFV的很長的N末端對其熱穩(wěn)定性的影響，本實驗室通過分子生物學(xué)方法將XynCDBFV木聚糖酶的很長的N末端克隆到來自嗜熱厭氧菌Caldicellulosiruptorsp. F32的11家族木聚糖酶XynA上并且在其能夠形成二硫鍵的位點做了相應(yīng)的點突變以期提高酶的熱穩(wěn)定性，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組酶的比酶活由改造前的2 567 U/mg下降到1 106 U/mg，在85 ℃的半衰期由改造前的8 h下降到0.5 h。隨后，在重組酶上進(jìn)一步進(jìn)行定點突變在N末端加入一個二硫鍵(Cys5-Cys31)，結(jié)果使其酶活不變的情況下最適溫度由改造前的80 ℃上升為85 ℃，在85 ℃的半衰期由0.5 h提高到10 h。綜合作者實驗結(jié)果說明在酶蛋白分子中正確的位點添加二硫鍵確實會增強(qiáng)其熱穩(wěn)定性，但來源不同的木聚糖酶雖同屬11家族，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)卻存在一定差異，在XynCDBFV中形成的二硫鍵在XynA中反而使其酶活位點更暴露，從而降低了其熱穩(wěn)定性，這也說明在不正確的地方添加二硫鍵可能不僅不會增強(qiáng)其熱穩(wěn)定性，反而會達(dá)到相反的效果。

利用同源序列對比，借鑒其他木聚糖酶二硫鍵的位置相應(yīng)的引入二硫鍵也是增強(qiáng)木聚糖酶熱穩(wěn)定性的方法。劉曉彤等[11]將源于Thermomyceslanuginosus的耐熱木聚糖酶 XynA 中存在的一個二硫鍵引入米曲霉木聚糖酶AoXyn11A(Cys108-Cys152)，使突變酶的最適溫度由55 ℃提高到60 ℃，在50 ℃的半衰期較改造前提高了近兩倍。Jeong等[12]對來自BacillusstearothermophilusNo. 236的11家族木聚糖酶進(jìn)行研究，利用 disulfide by design(http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2/index.php)程序預(yù)測出能夠?qū)映晒π纬啥蜴I的氨基酸對，然后與同樣來自11家族的其他30多個木聚糖酶進(jìn)行序列對比，將這些預(yù)測點在其他11家族木聚糖酶中對應(yīng)的是半胱氨酸的作為突變點，最終選擇了第100位和第150位之間加入二硫鍵，使其在60 ℃下半衰期由147 min上升為386 min。

二硫鍵的添加并不會改變木聚糖酶特有的三維結(jié)構(gòu)，它只是通過減少蛋白去折疊狀態(tài)的熵變從而對蛋白的構(gòu)象起穩(wěn)定作用。因此，作為穩(wěn)定蛋白三級結(jié)構(gòu)的一種方法，通過引入體外二硫鍵提高11家族木聚糖酶的熱穩(wěn)定性使其更適應(yīng)工業(yè)用酶的需要正在被越來越多的研究人員所重視。

1.2 糖基化對木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響

糖基化是指蛋白在真核生物細(xì)胞內(nèi)得到翻譯后經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體與糖結(jié)合形成糖蛋白的過程，主要包括糖基與天冬酰胺側(cè)鏈基團(tuán)或者絲氨酸與蘇氨酸的羥基之間形成的共價鍵。作為一種蛋白的 翻譯后修飾方法，糖基化木聚糖酶由于疏水性增強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白的可溶性增強(qiáng)，也降低了非特異性蛋白之間的相互作用力。木聚糖酶發(fā)生糖基化后，酶表面的糖鏈可能會對整個結(jié)構(gòu)起到包裹作用，從而增強(qiáng)木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。同時，這些糖鏈還可能覆蓋某些蛋白質(zhì)表面的蛋白酶酶切位點，增強(qiáng)蛋白對蛋白酶的抗性[13]。

Fonseca-Maldonado等[14]系統(tǒng)地研究了糖基化對蛋白熱穩(wěn)定性的影響，實驗將來自Bacillussubtilis的11家族木聚糖酶XynA轉(zhuǎn)入畢赤酵母獲得糖基化使蛋白在55 ℃下的半衰期由8 min上升到20 min，隨后又通過一系列實驗說明：糖基化在Asn-Xaa-Thr的順序比在Asn-Xaa-Ser的順序更容易發(fā)生；蛋白并不是糖基化位點越多對熱穩(wěn)定性提升越明顯，而是發(fā)生糖基化的位置更加重要；糖基化會增強(qiáng)糖鏈與蛋白之間以及糖鏈之間的相互作用力，但是只有增強(qiáng)糖鏈與蛋白之間的作用力才有可能提升熱穩(wěn)定性。Zhao等[15]將來自Thermobifidafusca的11家族木聚糖酶Xyn11A轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33中進(jìn)行糖基化表達(dá)，使該酶最適溫度由60 ℃升至80 ℃，最適pH由7.0升至8.0，熱穩(wěn)定性也有了明顯提高。受此啟示，本實驗室將來自Caldicellulosiruptorsp. F32的11家族木聚糖酶XynA截短催化模塊TM1在畢赤酵母GS115中表達(dá)過后發(fā)現(xiàn)該酶在酶活沒有明顯差異的情況下熱穩(wěn)定性在80、85 ℃下較在大腸埃希菌中表達(dá)分別提高了1.5倍、2倍，后經(jīng)過驗證，該酶存在的兩個遠(yuǎn)離催化中心的糖基化位點(天冬酰胺N23、N189)對熱穩(wěn)定性有明顯的提高作用[16]。

1.3 疏水作用對木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響

疏水性氨基酸一般指來自非極性的脂肪族和芳香族氨基酸，常存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水區(qū)域，最大程度避免與水結(jié)合且保守性要高于其他區(qū)域，它們對于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)起著重要作用。另外，疏水性氨基酸在發(fā)生酶促反應(yīng)過程中酶與底物之間通過各種作用力形成各種非共價鍵的分子結(jié)合方面也具有重要作用[17]。

目前，幾乎所有嗜熱酶和嗜溫酶的內(nèi)部疏水中心都非常保守，序列對比比較一致，因此，通過引入疏水性氨基酸增強(qiáng)蛋白的疏水作用往往發(fā)生在酶表面。李同彪等[18]和柏文琴等[19]分別對來自AspergillusnigerXZ-3S的11家族木聚糖酶XynZF-2和來自芽胞桿菌Bacillussp. SN5的11家族木聚糖酶Xyn11A-LC引入芳香族氨基酸，同時將第9位氨基酸改為酪氨酸，第14位改為苯丙氨酸，二者通過苯環(huán)形成堆積作用(stacking force)，增強(qiáng)了木聚糖酶分子的剛性，從而使酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性得到提升。此后，李同彪等[20]又將XynZF-2的α螺旋處引入疏水性氨基酸，將Val125、Lys178和Gly180分別突變?yōu)槭杷园被酇la、Met 和Ala，使得突變酶最適溫度由40 ℃提高到48 ℃，在45 ℃的半衰期由改造前的7 min提高到了19 min。楊浩萌等[21]在來源于Streptomycesolivaceoviridis的木聚糖酶XynB的折疊簇β1與β2之間引入一個酪氨酸，研究折疊簇之間的疏水作用對木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)突變酶在畢赤酵母中表達(dá)后較野生型不僅熱穩(wěn)定性顯著提高，比酶活也上升了33%，Km值比原酶降低43%，說明突變酶較原酶有著更好的催化效率。

增強(qiáng)蛋白內(nèi)部疏水中心的疏水結(jié)合也可以增強(qiáng)蛋白分子的穩(wěn)定性，Yo等[22]通過定向進(jìn)化和定點突變獲得并鑒定了來源于胃瘤真菌Neocallimastixpatriciarum的木聚糖酶XynCDBFV內(nèi)部疏水核心的一個點突變(G201C),該點突變導(dǎo)致突變體的比酶活和熱穩(wěn)定性都得到明顯提高。SDS-PAGE和DTNB法測定自由 巰基的數(shù)量均表明這兩個位點的半胱氨酸之間并沒有形成二硫鍵。經(jīng)過驗證，在該突變體中，201位和50位的半胱氨酸所形成的疏水結(jié)合是導(dǎo)致熱穩(wěn)定性提高的主要原因。

1.4 其他作用對木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響

研究發(fā)現(xiàn)，11家族木聚糖酶的熱穩(wěn)定性也受蛋白表面精氨酸含量，以及鹽橋、離子對、氫鍵等因素影響。精氨酸由于解離常數(shù)較大且對酶促反應(yīng)的敏感度較低，因此比其他氨基酸更能適應(yīng)高溫環(huán)境[23]， 此外，精氨酸由于側(cè)鏈胍基容易與其他氨基酸殘基形成氫鍵等相互作用從而穩(wěn)定蛋白構(gòu)象。11家族木聚糖酶三維結(jié)構(gòu)中存在著一個保守的Ser/Thr平面，該平面富含絲氨酸和蘇氨酸，Turunen等[24]首先嘗試在Trichodermareesei的11家族木聚糖酶分子Ser/Thr平面的蘇氨酸和絲氨酸突變?yōu)榫彼岷?，使得酶的熱穩(wěn)定性得到提升，周晨妍[25]和李飛等[26]受此啟發(fā)，利用同樣的原理將精氨酸引入11家族木聚糖酶Ser/Thr表面，使突變酶熱穩(wěn)定性得到提高。有人發(fā)現(xiàn)增加脯氨酸的數(shù)量或減少甘氨酸的數(shù)量也會增強(qiáng)蛋白的熱穩(wěn)定性，這可能是因為降低了蛋白質(zhì)去折疊態(tài)的熵變來增加結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。Wang等[27]通過將來自Streptomycessp. strain S9的木聚糖酶XynAS9進(jìn)行點突變(V81P, G82E)從而提高了熱穩(wěn)定 性，可能是因為81與82位氨基酸所在的β折疊片層末端折疊的并不是很緊湊，將這兩個點突變后增強(qiáng)了這部分的剛性，并且將活性位點附近的與底物接觸有關(guān)的長裂隙底部填充，從而增強(qiáng)了木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。此外，氨基酸側(cè)鏈之間由于所帶正負(fù)電荷不同而形成的離子鍵也會對木聚糖酶熱穩(wěn)定性起到一定作用[28-29]。

2 結(jié) 論

木聚糖酶作為半纖維素降解過程中的最為關(guān)鍵的酶而被廣泛應(yīng)用于食品、造紙、能源、飼料等行業(yè)，而11家族木聚糖酶由于分子體積小、比酶活較高等諸多優(yōu)點而更適于工業(yè)過程的需要[30]，但是，工業(yè)用酶特別是造紙需要木聚糖酶在高溫條件下保持高酶活和熱穩(wěn)定性，自然條件下的大多木聚糖酶很難達(dá)到在高酶狀態(tài)下同時具有很好的熱穩(wěn)定性[31]。因此，通過一定的分子生物學(xué)方法對木聚糖酶進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)的改造，使其構(gòu)象更加穩(wěn)定，從而能夠適應(yīng)工業(yè)過程的高溫條件已經(jīng)成為可能。目前，研究者主要通過定點突變的方法改變酶蛋白分子的某些氨基酸殘基，使其之間能夠形成各種分子內(nèi)作用力以增強(qiáng)分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。李同彪等[32]詳細(xì)介紹了目前利用較多的通過分子改造手段增加二硫鍵對提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定的影響，而本文針對目前11家族木聚糖酶改造時常用的幾種方法(二硫鍵、糖基化、疏水作用和其他方法)，論述了它們在提高木聚糖酶熱穩(wěn)定性方面的原理和意義，旨在幫助研究者們進(jìn)一步加深對11家族木聚糖酶作用機(jī)制的了解，同時為指導(dǎo)11家族木聚糖酶的分子改良提供借鑒。

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