抗銅綠假單胞菌IgY的制備優(yōu)化及抑菌效果

姚羽菲,龍 敏，文薈淋,姚 剛

(1.四川大學華西臨床醫(yī)學院，成都 610041；2.四川大學生命科學學院，成都 610065；3.成都安蒂康生物科技有限公司 610041)

銅綠假單胞菌(PA)廣泛存在于自然界，是傷口感染較常見的一種條件致病菌，亦為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一。PA可感染人體的血液、呼吸、中樞神經(jīng)、泌尿等各個組織系統(tǒng)，引發(fā)一系列病變。當機體遭受嚴重燒傷或患代謝性疾病、血液病、惡性腫瘤，免疫功能受損，容易受該菌感染[1]。囊性纖維化(CF)是一種常染色體隱性遺傳病，也常常由于該菌的機會感染導致患者死亡[2]。近年來，由于抗菌藥物的廣泛使用，PA的耐藥菌株不斷增加，尋找一種具有特異性抑菌作用，又不產(chǎn)生耐藥性的產(chǎn)品對PA感染的預防和治療具有重要意義。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，采用抗原免疫產(chǎn)蛋的母雞可產(chǎn)生相應的卵黃免疫球蛋白(IgY)抗體，該抗體通過產(chǎn)蛋的方式遺傳給后代而儲存于蛋黃中[2-3]。IgY具有化學性質穩(wěn)定、產(chǎn)量高、成本低、特異性強且無不良反應等優(yōu)勢，且動物種系發(fā)生距離遠，不會發(fā)生交叉血清學反應。同時，IgY可通過被動免疫有效防治幽門螺桿菌、大腸埃希菌、沙門菌等引起的消化道感染性疾病，變異鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌等引起的口腔感染性疾病，以及腫瘤防治、抗病毒感染[4-5]。本文通過多種制備方法對比，探討高效價、高純度且生物活性好的抗PA的特異性雞卵黃IgY的制備工藝，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料來源 PA(CMCC10211)、大腸埃希菌(CMCC44103)購于中國食品藥品檢定研究院；PA臨床分離株(編號COCC072)由口腔疾病研究國家重點實驗室提供；4月齡的產(chǎn)蛋雞由四川大學華西五教動物實驗中心提供，正常飼養(yǎng)；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基購自英國Oxoid公司；弗氏完全佐劑(F5881)、弗氏不完全佐劑(F5506)以及50～200 μm玻珠購自美國Sigma公司；HRP酶標兔抗雞IgY(二抗)購自美國Promega公司；BCA試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；四甲基聯(lián)苯胺顯色劑購自潮州英創(chuàng)生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1裂解細菌抗原的方法 將PA復蘇并擴大培養(yǎng)，收集細菌，使其濃度為5×109CFU/mL，然后采用以下方法各裂解3 mL菌液：(1)超聲破碎。將菌懸液置于1.5 mL EP管中進行超聲破碎，設置功率為220 W，超聲5 s，暫停10 s，如此反復，共超聲30 min。(2)TissueLyserⅡ組織裂解儀共振裂解。2 mL EP管中加入菌懸液和50～200 μm玻珠50 μg，25 Hz 5 min，共振2～3次；(3)研磨破碎。離心取菌苔，-70 ℃與37 ℃反復凍融3次，取出置于研缽，將150 mL液氮邊加入邊研磨，用3 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)復溶。細菌裂解完成后，10 000 r/min 離心10 min， 取30 μL上清液做常規(guī)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測蛋白裂解的完全性，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。選取最完整裂解抗原用于后續(xù)免疫方案。

1.2.2免疫方案的優(yōu)化 將所得抗原與弗氏佐劑充分乳化。佐劑是一類可增強或改變機體對抗原免疫應答的非特異免疫增強劑。弗氏完全佐劑是常用的強效佐劑，但也常常造成對實驗動物組織的損傷；弗氏不完全佐劑的效力較低，但較少發(fā)生動物損傷。因此，一般在免疫應答最敏感的首免使用完全佐劑以增強免疫效果，而在跟蹤免疫時使用不完全佐劑以維持動物健康。采用上述方法篩選的細菌裂解液或經(jīng)過0.5%甲醛滅活的細菌作為抗原免疫母雞，將12只母雞隨機分為4組，每組3只。1組免疫抗原為1×109CFU/mL滅活菌；2組為1×109CFU/mL滅活菌，4周后免疫第2針；3組為2×109CFU/mL滅活菌；4組為1 mg/mL的裂解抗原。用等體積的弗氏完全佐劑(初次免疫)或弗氏不完全佐劑(再次免疫)充分乳化制成疫苗，初次免疫采用皮下多點注射，每只雞注射弗氏完全佐劑疫苗1 mL;再次免疫采用肌肉多點注射[6]，每只雞注射弗氏不完全佐劑疫苗1 mL。其中1、3、4組在初次免疫后第2、4、6、10周分別再次免疫，第2組在初次免疫后第4、6、10周分別再次免疫。

1.2.3IgY效價測定 從免疫后雞蛋中分離蛋黃，采用滅菌蒸餾水按1∶9(g/v)比例稀釋[6-7]，并用1 mol/L鹽酸調節(jié)pH值為5.0～5.2，4 ℃放置過夜。10 000 r/min離心15 min，取上清液，得水溶性組分(WSF)?？贵w效價測定采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA )，PA的裂解抗原以濃度5 μg/mL包被ELISA板，將疫苗免疫后不同時間收集的WSF先用蒸餾水1∶100(v/v)稀釋，再等比稀釋加入ELISA板中。 同時加入空白對照(生理鹽水)，陰性對照(未免疫蛋黃的WSF，蒸餾水1∶100稀釋)，然后加入酶標IgY二抗(1∶3 000)，以TMB底物溶液顯色，2 mmol/L硫酸終止，酶標儀450 nm處測吸光度(A值)。實驗孔A值大于陰性對照孔A值2.1倍的最大稀釋度即為效價。收集高效價組的雞蛋用于后續(xù)IgY的提取。

1.2.4IgY提取及純化 選取第2組11～14周的所有雞蛋進行WSF上清液的收集，然后緩緩加入飽和硫酸銨溶液使終濃度為50%，同時用攪拌子輕輕攪拌，靜置4 ℃放置過夜，離心留沉淀并溶于等體積的0.1 mol/L、pH為7.4的PBS中。緩緩加入飽和硫酸銨溶液，使終濃度為33%，輕輕攪拌混勻，靜置6 h，離心留沉淀并溶于原卵黃液等體積的蒸餾水中。采用Amicon Ultra-100K離心過濾器純化。SDS-PAGE檢測IgY蛋白裂解的完全性，BCA法測定蛋白濃度。

1.2.5IgY的體外抑菌實驗 IgY經(jīng)超濾濃縮、過濾除菌處理后濃度為27.02 mg/mL。取制備好的基礎固體培養(yǎng)基數(shù)個，用100 μL IgY(2.7 mg)與100 μL 1×104CFU/mL的PA標準株和臨床株菌液混合，作用1 min后均勻涂布于平板上，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后計算長出的菌落數(shù)。對照組用100 μL 蒸餾水與100 μL 1×104CFU/mL菌混合。

1.2.6掃描電鏡觀察細菌形態(tài)變化 截取1/4的1 cm×1 cm蓋玻片，蓋在IgY處理組和對照組的菌落上10 s，取出印有細菌的蓋玻片置于6孔板中，加入2.5%戊二醛4 ℃固定24 h。之后取出用PBS清洗2次，再依次用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇分別梯度脫水10 min。然后放入100%乙酸正戊酯溶液中置換處理20 min。再在CO2臨界點干燥機中進行干燥，干燥后用離子濺射儀噴射金粉，處理好后上機檢測。

2 結 果

2.1抗原裂解方法優(yōu)化 PA經(jīng)超聲破碎、共振裂解、研磨破碎處理所得抗原濃度分別為13.40、9.26、0.28 mg/mL，由圖1可知，超聲破碎法所得蛋白條帶濃度最高、條帶數(shù)最多，與菌液經(jīng)蛋白電泳上樣緩沖液破碎后產(chǎn)生的蛋白條帶譜最為接近，裂解效果最好。因此，后續(xù)實驗采用超聲破碎的裂解抗原用于免疫。

2.2免疫方案優(yōu)化及IgY效價變化 ELISA測定IgY抗體滴度隨時間的變化如表1所示。4組IgY抗體均在9周后有較高的滴度，第2組和第4組滴度相對其他組更高，可達1∶25 600；第1組在4～8周、第2組和第3組在4～9周、第4組在5～7周均未產(chǎn)蛋，3～4周僅第4組有產(chǎn)蛋。免疫后所產(chǎn)生的抗體滴度有波動，第1組、第3組抗體滴度均呈低水平趨勢，第2組11周后滴度在(1∶12 800)～(1∶25 600)，第4組第10周上升至最高點1∶25 600后下降并達到較低水平后穩(wěn)定。因此，第2組抗體的滴度和穩(wěn)定性最佳。

注：1為共振裂解；2為研磨破碎；3為超聲裂解；4為菌液(陽性對照)；M為蛋白質相對分子質量標準

圖1 不同方法裂解菌體抗原的SDS-PAGE分析表1 不同免疫方案產(chǎn)生的抗PA IgY抗體效價消長比較

注:-表示無數(shù)據(jù)

注：1為50%～33%硫酸銨沉淀的IgY；2為1產(chǎn)生的IgY再經(jīng)超濾管純化；M為蛋白質相對分子質量標準

圖2 IgY的純度分析

2.3IgY純化方案優(yōu)化及純度檢測 由圖2可知，SDS-PAGE電泳目的蛋白IgY的相對分子質量約為70×103和25×103。用50%～33%硫酸銨兩步法提取的IgY濃度較高，且雜帶少；經(jīng)超濾后可以進一步純化，使雜帶含量繼續(xù)減少。凝膠成像軟件分析兩種方法純化的IgY抗體純度分別為85%、94%。BCA法檢測后者IgY水平為27.02 mg/mL。

注：A為PA標準株CMCC10211；B為 PA臨床分離株COCC072

圖3 IgY抑菌效果檢測

2.4IgY抑菌效果檢測 由圖3可以看出，將純化IgY抗體以體積1∶1的比例與1×104CFU/mL的PA混合涂布培養(yǎng)后，不論是標準株還是臨床株的細菌生長均受到明顯抑制，IgY實驗組菌落數(shù)為對照組的1/10左右，細菌的綠色色素產(chǎn)生不明顯，革蘭染色顯示IgY實驗組細菌菌體變長變粗。

2.5IgY對PA形態(tài)影響 如圖4所示，IgY實驗組(圖B)的PA菌體較粗長，且有皺縮干癟。對照組細菌(圖A)成球桿或短桿狀，較飽滿。

注：A為對照組(×40 000)；B 為IgY實驗組(×40 000)

圖4 IgY抑制PA掃描電鏡圖

3 討 論

免疫抗原的常用裂解方法有超聲破碎、共振裂解、研磨破碎等。本研究的優(yōu)化裂解結果顯示PA是革蘭陰性細菌，菌體小且細胞壁薄，主要抗原為內(nèi)毒素，故經(jīng)超聲破碎裂解所得抗原效果最好，濃度最高，為13.40 mg/mL。而共振裂解和研磨破碎獲得的抗原濃度分別為9.26、0.28 mg/mL，均低于超聲破碎法，尤其是研磨破碎效果很差。

與張小鶯等[8]研究抗原劑量對免疫效果和抗體濃度的影響不同，本文研究了不同抗原劑量(1×109、2×109CFU/mL)、不同抗原狀態(tài)(完全抗原、裂解抗原)和不同免疫間隔時間(首次免疫和再次免疫間隔2周或4周)對免疫效果和抗體滴度的影響，結果顯示抗原劑量對其影響不大，而首次免疫和二次免疫間隔4周抗體滴度高達1∶25 600，約為間隔2周抗體滴度的8倍，裂解抗原組的抗體滴度也高達1∶25 600，但穩(wěn)定性不高，在10周達到最高后，11周滴度開始下降。綜合分析后推測，首次免疫形成較強的免疫記憶需要20 d以上，裂解抗原能使雞更快地形成較強免疫記憶，但無法穩(wěn)定地保持下去，可能是IgY半衰期較IgG短所致。第2組方案中，抗體產(chǎn)生形成了較長的節(jié)律符合張小鶯等[8]分析的抗體量周期性變化結果，即60 d左右為大周期，7 d為1小周期，產(chǎn)量由相對低谷到頂點再回落到低谷。雖然動物生物節(jié)律背后的生物學意義還缺乏統(tǒng)一認識，但這種節(jié)律的認知有助于解釋抗體表達波動現(xiàn)象[9]。免疫后4～9周母雞的產(chǎn)蛋量為0，可能免疫對母雞的產(chǎn)蛋有嚴重的抑制作用;3～4周僅第4組有產(chǎn)蛋，可能因為第4組是裂解抗原，其抗原特性和化學毒性物質不同于完整菌體。其次，細菌裂解碎片的抗原特異性可能不完全同于完整菌體，而抗原特性是影響雞產(chǎn)蛋能力的最重要因素。

本研究將100 μL IgY(27.02 mg/mL)與100 μL (1×104CFU/mL)細菌相互作用后，觀察到了顯著的抑菌(菌落數(shù)約為對照的1/10)現(xiàn)象。在王吉潭等[6]的抗豬大腸卵黃抗體對大腸埃希菌的體外抑菌實驗中，體積比為1∶1的抗體與菌液(1×108CFU/mL)相互作用，得出抗體的殺菌濃度為0.5 mg/mL，抑菌濃度為0.05 mg/mL。由此可知，所得濃度為27.02 mg/mL的抗PA抗體對濃度為1×104CFU/mL的菌液有很好的抑菌作用，相較于王吉潭等[6]的抗大腸埃希菌卵黃抗體，該抗體抑菌作用略差。

抗PA的IgY抗菌機制目前認為有以下方式：(1)IgY直接黏附于病原菌的細胞壁、菌毛上，抑制病原菌黏附宿主細胞的能力，破壞病原菌的完整性并抑制其增殖；如CF患者用特異性抗PA的IgY溶液漱口可以防止細菌初始黏附在口咽黏膜表面[10]?？筆A的IgY也可促進細菌聚集體形成，從而增加細菌疏水性，降低感染黏附[11]。(2)口服IgY可以發(fā)動固有免疫，促進中性粒細胞快速和及時地清除PA[12]。(3)部分病原菌IgY也可能在腸道消化酶的作用下降解為可結合片段，其中含有抗體的片段可變成容易被腸黏膜吸收的小肽，進入血液后與病原菌黏附因子結合，穩(wěn)定部分則仍留在腸內(nèi)但會失去對易感細胞的致病性[3]。革蘭染色觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗體處理的PA標準株的菌體變長變粗后，為進一步確定該變化，做了掃描電鏡觀察，證實了菌體變長變粗的現(xiàn)象的存在。結合抗體處理使菌株產(chǎn)色素時間延遲的現(xiàn)象，可推測抗體對PA的形態(tài)影響可能涉及到其生理的變化。

綜上所述，本研究采用滅活全菌免疫母雞，經(jīng)水稀釋、硫酸銨沉淀、超濾純化的制備方法可得到高純度和高效價的抗PA的IgY，所制抗體具有特異性和顯著抑菌活性。

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