甲狀腺微小乳頭狀癌組織中Bax、nm23蛋白的表達(dá)及臨床意義

顧桂源+王維格+黃山

[摘要] 目的 研究甲狀腺微小乳頭狀癌（PTMC）組織中B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白（Bax）、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因23（nm23）蛋白的表達(dá)及臨床意義。 方法 選擇2016年5月～2017年5月在南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院接受手術(shù)治療的PTMC患者的組織石蠟標(biāo)本103例記為觀察組，將術(shù)中切除的距離腫瘤組織≥5 cm的癌旁組織石蠟標(biāo)本103例記為對(duì)照組，另選同期在醫(yī)院接受手術(shù)治療的甲狀腺腺瘤（TA）患者100例記為TA組，檢測(cè)并對(duì)比各組Bax及nm23蛋白的表達(dá)，分析觀察組Bax及nm23蛋白的表達(dá)與其病理參數(shù)的關(guān)系，以及Bax與nm23蛋白的相關(guān)性。 結(jié)果 觀察組和TA組Bax蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均分別明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。觀察組nm23蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于TA組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。觀察組有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Bax及nm23蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均分別明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。根據(jù)Spearman法對(duì)相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，Bax與nm23蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.617，P < 0.05）。 結(jié)論 PTMC組織中Bax和nm23蛋白表達(dá)均明顯升高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，此二者關(guān)系緊密，可作為監(jiān)測(cè)靶點(diǎn)，有助于評(píng)價(jià)PTMC患者的病情及預(yù)后。

[關(guān)鍵詞] 甲狀腺微小乳頭狀癌；組織；Bax；nm23蛋白；表達(dá)；臨床意義

[中圖分類號(hào)] R736.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）12（c）-0029-04

[Abstract] Objective To study the expression and clinical significance of B lymphocyte tumor associated -2 related X protein （Bax）， tumor metastasis suppressor gene 23 （nm23） protein in papillary thyroid microcarcinoma （PTMC） tissues. Methods One hundred and three paraffin specimens of PTMC patients who was given surgery treatment in Haian Affiliated Hospital to Nantong University from May 2016 to May 2017 were selected as observation group， the resection of the tumor was ≥ 5 cm far from paraffin embedded specimens of 103 cases of tumor adjacent tissues selected was as control group， another 100 patients with thyroid adenoma （TA） who was given surgery at the same time were chosen and enrolled as TA group， the expression of Bax and nm23 protein in each group was detected and compared， the relationship between the expression of Bax and nm23 protein and pathological parameters in the observation group was analyzed， and the correlation between Bax and nm23 protein was analyzed. Results The positive expression rates of Bax protein in the observation group and the TA group were significantly higher than the control group， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The positive expression rate of nm23 protein in the observation group was significantly higher than the TA group and the control group， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The positive expression rates of Bax and nm23 protein in the observation group with lymph node metastasis were significantly lower than without lymph node metastasis， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. According to the correlation analysis of Spearman， it was found that the expression of Bax was positively correlated with the expression of nm23 protein （r = 0.617， P < 0.05）. Conclusion The expression of Bax and nm23 protein in PTMC tissues increased significantly， it is closely related to lymph node metastasis and both two indexes can be used as a monitoring target to evaluate the condition and prognosis of PTMC patients.endprint

[Key words] Papillary thyroid microcarcinoma； Tissue； Bax； nm23 protein； Expression； Clinical significance

近年來(lái)，甲狀腺癌在我國(guó)臨床上的發(fā)病率明顯上升，嚴(yán)重影響了患者的身體健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，甲狀腺在全身惡性腫瘤當(dāng)中占比為1%～2%，患病群體中尤以女性居多，對(duì)患者的家庭生活及生命安全均具有較大的威脅[1]。甲狀腺癌當(dāng)中，源自濾泡上皮細(xì)胞者占比約為90%，而這之中以乳頭狀癌及濾泡型癌為主。甲狀腺微小乳頭狀癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）是乳頭狀癌的一種，其在臨床上也較為常見(jiàn)[2]。由于此病患者頸部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移率較高，加之這種轉(zhuǎn)移機(jī)制十分復(fù)雜，既與抑癌基因的調(diào)控有關(guān)，也與受體的輔助作用有關(guān)。因此，研究PTMC的轉(zhuǎn)移情況與有關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系對(duì)于患者的診治具有重大的意義[3]。由于B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白（B lymphocyte tumor associated -2 related X protein，Bax）是一類促凋亡基因，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因23（Tumor metastasis suppressor gene 23，nm23）屬于腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制性基因，本文通過(guò)分析PTMC組織中Bax、nm23蛋白的表達(dá)以及臨床意義，旨在為臨床診治提供數(shù)據(jù)支持，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年5月～2017年5月在南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院接受手術(shù)治療的PTMC患者的組織石蠟標(biāo)本103例記為觀察組，男41例，女62例；年齡32～69歲，平均（50.31±1.33）歲。淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況：有轉(zhuǎn)移者18例，無(wú)轉(zhuǎn)移者85例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期61例，Ⅲ～Ⅳ期42例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為PTMC，且腫瘤直徑≤1 cm；②有手術(shù)指征；③年齡>30歲者；④對(duì)本次研究知情同意，并簽署了同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類別的惡性腫瘤者；②病歷資料數(shù)據(jù)缺失者；③術(shù)前有放化療或免疫治療史者。將術(shù)中切除的距離腫瘤組織≥5 cm的經(jīng)病理學(xué)檢查為癌旁正常組織的石蠟標(biāo)本103例設(shè)為對(duì)照組，另選同期在醫(yī)院接受手術(shù)治療的甲狀腺腺瘤（TA）患者100例設(shè)為TA組，男40例，女60例；年齡31～68歲，平均（50.29±1.26）歲。各組患者的性別以及年齡資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。關(guān)于本次研究，醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)已經(jīng)作出了評(píng)審?fù)ㄟ^(guò)的批示。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑 ①鼠抗人型Bax單克隆抗體（克隆號(hào)：2D2，編號(hào)：MAB-0254）；②鼠抗人型nm23單克隆抗體（克隆號(hào)：37.6，編號(hào)：MAB-0139）；③EDTA修復(fù)液（編號(hào)：MVS-0098/0099）；④MaxvisionTM/HRP型免疫組化試劑盒（編號(hào)：KIT-5030）；⑤DAB試劑盒。以上主要試劑均購(gòu)自福州的邁新公司。

1.2.2 Bax及nm23蛋白表達(dá)的檢測(cè) 通過(guò)免疫組化法實(shí)施測(cè)定，主要步驟為：①將石蠟標(biāo)本切片、脫蠟、入水；②經(jīng)抗原EDTA液熱修復(fù)，再用膦酸鹽的緩沖液（PBS）進(jìn)行3次沖洗，3次/min；③利用3%雙氧水行10 min的孵育，再進(jìn)行PBS液的3次沖洗，3次/min；④清除PBS，在切片上滴入一抗，放于4℃下過(guò)夜，而后進(jìn)行PBS液的3次沖洗，3次/min；⑤清除PBS，在切片上滴入MaxvisionTM/HRP，放在室溫下孵育約15 min，而后進(jìn)行PBS液的3次沖洗，3次/min；⑥清除PBS，經(jīng)DAB顯色；⑦用自來(lái)水沖洗以終止顯色，再用蘇木精復(fù)染，常規(guī)進(jìn)行乙醇脫水和二甲苯透明，以及樹膠封固處理，將PBS代替一抗用于陰性對(duì)照，將已知的陽(yáng)性切片用于陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) Bax蛋白陽(yáng)性主要定位于細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)，nm23蛋白陽(yáng)性主要定位于細(xì)胞漿內(nèi)，選取每個(gè)切片的10個(gè)高倍視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野內(nèi)的100個(gè)腫瘤細(xì)胞的陽(yáng)性數(shù)目，顏色為淡黃、棕黃亦或是棕褐色記為陽(yáng)性，不著色記為陰性[4]。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)比各組Bax及nm23蛋白的表達(dá)情況，分析觀察組Bax及nm23蛋白的表達(dá)與其病理參數(shù)的關(guān)系，以及觀察組Bax與nm23蛋白的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性用Spearman法進(jìn)行，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組Bax及nm23蛋白的表達(dá)情況對(duì)比

觀察組和TA組Bax蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均分別明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。但觀察組與TA組Bax蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。觀察組nm23蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于TA組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。但TA組與對(duì)照組的nm23蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1、圖1（封三）。

2.2 觀察組Bax及nm23蛋白的表達(dá)與其病理參數(shù)的關(guān)系分析

觀察組有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Bax及nm23蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。觀察組Bax及nm23蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡及臨床分期無(wú)明顯關(guān)系。見(jiàn)表2。

2.3 觀察組Bax與nm23蛋白的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，Bax與nm23蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.617，P = 0.013）。見(jiàn)圖2。endprint

3 討論

臨床上，甲狀腺腫瘤在內(nèi)分泌科較為常見(jiàn)，其在內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)病變中占據(jù)較高的比例。在甲狀腺腫瘤的類別中，乳頭狀癌屬于臨床最為多見(jiàn)的一類發(fā)生于甲狀腺的惡性腫瘤，且此類癌癥的發(fā)病率正呈現(xiàn)出逐年增加的態(tài)勢(shì)[5-6]。而臨床將直徑≤1 cm的乳頭狀癌記為PTMC，伴隨對(duì)PTMC的深入研究，當(dāng)前發(fā)現(xiàn)部分基因與PTMC的形成及進(jìn)展聯(lián)系緊密[7]。由于Bax是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的基因，而nm23屬于腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制性基因，分析此二者有關(guān)蛋白在PTMC組織中的表達(dá)及臨床意義，有助于臨床對(duì)于PTMC患者的診治提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)支持。

當(dāng)前臨床上關(guān)于Bax和nm23在PTMC中的研究進(jìn)展報(bào)道較少，尤其是針對(duì)nm23與PTMC關(guān)系的研究報(bào)道幾乎未見(jiàn)報(bào)道[8]，雖然臨床上對(duì)于Bax與甲狀腺的關(guān)系近年來(lái)作出了一定的研究，但Bax與nm23之間的關(guān)系則不容忽視，這也是本次研究的創(chuàng)新點(diǎn)。本研究通過(guò)分析后發(fā)現(xiàn)，觀察組和TA組Bax蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均分別明顯高于對(duì)照組（均P < 0.05），但觀察組與TA組比較，差異不明顯；且觀察組nm23蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于TA組和對(duì)照組（均P < 0.05），但TA組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），這些結(jié)果提示了Bax和nm23蛋白在PTMC及TA患者中均具有明顯升高的陽(yáng)性表達(dá)，且nm23蛋白在PTMC患者中的陽(yáng)性表達(dá)更高。分析原因，主要可能與Bax和nm23在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制有關(guān)。具體而言，Bax屬于Bcl-2基因家族群體當(dāng)中具有代表性的促凋亡基因，其可表達(dá)出多類亞型，可對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體的凋亡途徑進(jìn)行有效調(diào)控[9-10]。由于其表達(dá)蛋白通常定位在細(xì)胞漿內(nèi)，若獲得凋亡信號(hào)的刺激，則可產(chǎn)生同源二聚體而嵌入到線粒體膜內(nèi)，致使細(xì)胞色素C從線粒體不斷釋放進(jìn)胞質(zhì)，并在一系列聯(lián)結(jié)反應(yīng)后形成凋亡小體，最終使得細(xì)胞凋亡。nm23屬于腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制性基因，其可通過(guò)對(duì)磷酸二核苷激酶和組氨酸激酶的活性進(jìn)行作用，致使三磷酸核苷的來(lái)源缺乏，進(jìn)而使得細(xì)胞在減數(shù)分裂過(guò)程中的紡錘體形成異常，導(dǎo)致染色體畸變及形成非整倍體的細(xì)胞，最終介入到腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移中[11-13]。而Bax在PTMC及TA患者組織中的表達(dá)無(wú)明顯差異則可能是因?yàn)榘殡S腫瘤組織的細(xì)胞惡性程度加劇，為了保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，腫瘤組織的有關(guān)細(xì)胞提升了細(xì)胞凋亡的速度，但此時(shí)細(xì)胞已無(wú)法有效維持其自我穩(wěn)態(tài)，致使細(xì)胞凋亡速度的增大幅度明顯低于增殖速度的增大幅度，因此無(wú)法遏制DNA的錯(cuò)誤復(fù)制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此Bax蛋白在PTMC及TA患者組織中的陽(yáng)性表達(dá)差異不大。本研究還發(fā)現(xiàn)，觀察組Bax及nm23蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡及臨床分期無(wú)明顯關(guān)系，但有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Bax及nm23蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（均P < 0.05）。提示PTMC患者Bax及nm23蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與其局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。原因主要與Bax的促凋亡作用及nm23的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制作用有關(guān)。Bax蛋白的表達(dá)降低使得PTMC存在更加強(qiáng)大的侵襲能力，也更易朝局部淋巴結(jié)區(qū)域轉(zhuǎn)移[14-15]。而nm23可通過(guò)對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行作用而干擾腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而抑制其轉(zhuǎn)移[16-18]。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTMC患者中，Bax和nm23蛋白作用效果較差，二者的表達(dá)相對(duì)更低。本研究還發(fā)現(xiàn)，觀察組Bax與nm23蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（P < 0.05），再次證實(shí)Bax與nm23蛋白的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用具有一定的協(xié)同性，原因考慮是二者在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制雖然不同，但總體的抑癌效果趨于一致，這在Temiz等[19-20]的報(bào)道中也有相應(yīng)的結(jié)論可以證實(shí)。

綜上所述，PTMC組織中的Bax和nm23蛋白的表達(dá)均明顯升高，二者之間呈正相關(guān)，且陽(yáng)性表達(dá)率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者組織中明顯更低，臨床上可將Bax和nm23蛋白作為監(jiān)測(cè)靶點(diǎn)，對(duì)PTMC患者的病情及預(yù)后具有科學(xué)有效的評(píng)價(jià)作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 鄧水平，李泉水，陳勝華，等.甲狀腺微小乳頭狀癌的超聲特征與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)因素分析[J].臨床超聲醫(yī)學(xué)雜志，2017，19（6）：424-426.

[2] 林前煌，徐慧，郇金亮，等.甲狀腺微小乳頭狀癌診治進(jìn)展[J].實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2017，31（1）：61-64.

[3] 代妮娜，張文君.濾泡型甲狀腺乳頭狀癌和經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌超聲影像對(duì)比分析[J].四川醫(yī)學(xué)，2017，38（1）：93-96.

[4] 何堅(jiān)沃，羅文杰，梁偉彬，等.細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查應(yīng)用在甲狀腺微小乳頭狀癌診斷中的可行性分析[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2017，24（11）：75-77.

[5] 張真真，李青菊.血清促甲狀腺激素水平與甲狀腺乳頭狀微小癌的關(guān)系[J].山西醫(yī)藥雜志，2017，46（11）：1326-1329.

[6] 閆東.Galectin-3、CK19與HBME-1在甲狀腺微小乳頭狀癌中的表達(dá)及臨床意義[J].青島醫(yī)藥衛(wèi)生，2017，49（4）：298-300.

[7] 劉洋，石鐵鋒，石臣磊，等.甲狀腺微小乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素的研究[J].醫(yī)學(xué)臨床研究，2017，34（3）：553-555.

[8] 馬志斌.甲狀腺疾病快速冰凍切片的診斷及鑒別診斷分析[J].中國(guó)老年保健醫(yī)學(xué)，2017，15（3）：73-75.

[9] 魏廣民，周文波，武倫，等.Bax、nm23蛋白在甲狀腺微小乳頭狀癌的表達(dá)及意義[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2017，33（19）：3272-3273.

[10] 呂曉君.甲狀腺微小乳頭狀癌的臨床病理觀察[J].基層醫(yī)學(xué)論壇，2017，21（1）：83-84.

[11] Qian K，Guo K，Zheng X，et al. Contrastive study of two screening criteria for active surveillance in patients with low-risk papillary thyroid microcarcinoma： a retrospective analysis of 1001 patients [J]. Oncotarget，2017，8（39）：65 836-65 846.endprint

[12] 魏廣民，周文波，武倫，等.CyclinD1和Bax在甲狀腺微小乳頭狀癌中的表達(dá)及意義[J].重慶醫(yī)學(xué)，2017，46（3）：325-328.

[13] Cvejic D，Selemetjev S，Savin S，et al. Apoptosis and proliferation related molecules （Bcl-2，Bax，p53，PCNA） in papillary microcarcinoma versus papillary carcinoma of the thyroid [J]. Pathology，2008，40（5）：475-480.

[14] 宋小穎.甲狀腺乳頭狀癌Ⅲ區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素分析[J].河南醫(yī)學(xué)研究，2017，26（10）：1813-1814.

[15] 張科.甲狀腺微小乳頭狀癌預(yù)后指標(biāo)的研究[J].實(shí)用癌癥雜志，2017，32（1）：169-170.

[16] Li M，Zhu XY，Lv J，et al. Risk factors for predicting central lymph node metastasis in papillary thyroid microcarcinoma （CN0）：a study of 273 resections [J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21（17）：3801-3807.

[17] 許軍，丁旭貝，肖光雄，等.甲狀腺微小乳頭狀癌組織中CK19、TPO、Galectin-3和Survivin蛋白表達(dá)水平及診斷價(jià)值[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2017，29（6）：48-50.

[18] 吳珠，辛露，常宏，等.甲狀腺癌中Bax、Survivin及Livin的表達(dá)及意義[J].癌癥進(jìn)展，2017，15（8）：914-916.

[19] Temiz P，Akka？鬤 G，Ne？鬤e N，et al. Determination-of apoptosis and cell cycle modulators （p16，p21，p27，p53，BCL-2，Bax，BCL-xL，and cyclin D1） in thyroid follicular carcinoma，follicular adenoma，and adenomatous nodules via a tissue microarray method [J]. Turk J Med Sci，2015，45（4）：865-871.

[20] Selemetjev SA，Savin SB，Paunovic IR，et al. Changes in the expression pattern of apoptotic molecules （galectin-3，Bcl-2，Bax，survivin） during progression of thyroid malig？鄄nancy and their clinical significance [J]. Wien Klin Woch？鄄enschr，2015，127（9）：337-344.

（收稿日期：2017-10-11 本文編輯：任 念）endprint