LC-MS/MS同時測定MCF-7細胞中雌二醇及其羥基代謝物*

★ 朱瑞陳衛(wèi)東 葛芹 楊海寧 姚琪 趙亞男

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學院 合肥 230012；3.皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院臨床藥學部 安徽 蕪湖 240001；4.安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心 安徽 蕪湖 241001)

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤，隨著人口老齡化以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，并呈年輕化趨勢[1]。流行病學研究提出內(nèi)源性和外源性的雌激素是引發(fā)乳腺癌的主要危險因素。

雌激素是重要的內(nèi)源性物質(zhì)，在體內(nèi)發(fā)揮著多種生物學效應[2-4]。此外雌激素在乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌等疾病的發(fā)展中起著重要的作用[5]。雌激素主要以雌二醇存在，與雌激素受體結(jié)合后產(chǎn)生多種生理作用[6]。雌二醇是雌激素中最主要、活性最強的激素[7]，目前普遍認為過量堆積的雌二醇在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預后中具有重要的作用[8-10]。雌二醇可被胞色素P450酶CYP1A1代謝為2-OH雌二醇，被CYP1B1代謝為4-OH雌二醇， 2-OH雌二醇和4-OH雌二醇通過兒茶酚甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)轉(zhuǎn)化為2-甲氧基雌二醇和4-甲氧基雌二醇。同時4-OHE2、2-OHE2可被代謝成雌二醇-3,4-半醌，半醌式結(jié)構(gòu)進一步變成醌式結(jié)構(gòu)，與細胞內(nèi)DNA結(jié)構(gòu)中嘌呤結(jié)合，形成DNA加合物，導致DNA的損傷，產(chǎn)生致癌作用[11]。

已有研究者建立方法測定血液[12]、尿液[13]、水體[14]、奶粉[15]中雌激素含量，然而對于細胞中雌激素的測定，相關文獻報道較少，因此我們認為有必要建立一種細胞內(nèi)快速的定量測量雌二醇及其代謝物濃度的方法，為研究雌二醇及其代謝在不同乳腺癌細胞內(nèi)的藥物代謝動力學行為提供基礎。

1 實驗材料

1.1 儀器 Agilent 1290 Infinity 超高效液相色譜儀(美國 Agilent 公司)，AB SCIEX4500 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國 AB SCIEX 公司)，AB135-S 型十萬分之一電子分析天平(德國梅特勒-托利多公司)，TG88/16-WS 臺式高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，XW-80A 微型渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠有限公司)，LC-4016 型低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)，Millipore 超純水系統(tǒng)(美國 Millipore 公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。

1.2 試劑和藥品 雌二醇對照品(批號：100182-201205 純度：96.3%)、炔雌醇(批號：100052-200609 純度：99.5%)均購自中國食品藥品檢定研究院；2-Hydroxy-17β-estradiol(批號：6-STB-57-6 純度：96%)、4-Hydroxy-17β-estradiol(批號：6-STB-56-1 純度：98%)均購自加拿大TRC公司；吡啶-3-磺酰氯(上海源葉生物科技有限公司批號：S62313 純度：98%)；乙腈、甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。DMEM高糖培養(yǎng)基(無酚紅)、活性炭/葡聚糖處理的胎牛血清均購自于Hyclone公司；胰蛋白酶購自Gibco公司。

2 實驗內(nèi)容

2.1 MCF-7細胞培養(yǎng) MCF-7細胞株(購自中國科學院上海生命科學研究所),將細胞接種于培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，以含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液在培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。細胞按5×105個每孔接種于6孔板，隔天給藥。

2.2 對照品溶液與內(nèi)標溶液的配制 精密稱取雌二醇，2-OH雌二醇、4-OH雌二醇適量，加甲醇配制成2-OH雌二醇、4-OH雌二醇濃度為100 ng/mL，雌二醇濃度為200 ng/mL的混合對照品溶液，于-80℃保存?zhèn)溆?。精密稱取適量炔雌醇 (IS) 標準品，用甲醇配制成5 ng/mL的炔雌醇儲備液。

2.3 細胞樣品處理 取100 μL樣品，加入10 μL內(nèi)標溶液，用1 mL甲基叔丁基醚萃取，渦旋后離心，吸取上清液并用氮吹儀吹干。吹干后加入150 μL吡啶-3-磺酰氯，再加入50 μL碳酸氫鈉緩沖液(pH=10.71)，渦旋，于60 ℃進行水浴，40min后加入1 mL甲基叔丁基醚萃取，取上清吹干，再加入80%甲醇復溶，渦旋后離心，取上清液UPLC-MS/MS分析。

2.4 分析條件

2.4.1 色譜條件 色譜柱:ACQUITY UPLC CSHTMC18(2.1mm×100mm，1.7μm);柱溫：30℃；0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)；梯度洗脫(0-6 min，38%A-48%A；6-6.5 min， 48%A-38%A；6.5-7 min，38%A-38%A)；流速：0.2 mL/min；進樣量：2 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源(ESI源)，離子源溫度為350℃，進行正離子模式掃描，檢測模式為多反應監(jiān)測(MRM)，源噴射電壓為5500V，氣簾氣(CUR)為35psi，噴霧氣為氮氣，碰撞氣為氬氣，化合物具體質(zhì)譜參數(shù)參見表1。

2.5 細胞樣品方法學考察

2.5.1 方法專屬性 取細胞空白裂解液，標準品混合溶液加內(nèi)標溶液，空白裂解液加入標準品混合溶液、內(nèi)標溶液，按“2.3”方法處理樣品，“2.4”方法進樣測定，得到三者的色譜圖，由圖1可知空白裂解液中的內(nèi)源性雜質(zhì)對待測物和內(nèi)標的測定沒有干擾，表明方法專屬性良好。

表1 雌二醇、羥基雌二醇及內(nèi)標炔雌醇的質(zhì)譜相關參數(shù)

化合物母離子子離子DP(V)EP(V)CE(V)CXP(V)雌二醇414．2350．21381038112-OH雌二醇571．2365．21301038114-OH雌二醇571．2365．2130103811炔雌醇438．2374．2157103811

A標準品混合溶液色譜圖；B空白裂解液加標準品及

2.5.2 線性范圍考察和定量下限 精密吸取空白細胞裂解液90 μL置于EP管中，分別依次加入系列濃度混合標準工作溶液10 μL，制備成雌二醇濃度為0.4、0.8、1.6、2、4、8、16、20 ng/mL，2-OH雌二醇濃度為0.2、0.4、0.8、1、2、4、8、10 ng/mL，4-OH雌二醇濃度為0.2、0.4、0.8、1、2、4、8、10 ng/mL的系列對照品細胞樣品，按“2.3”方法處理樣品，“2.4”方法進樣測定。以細胞裂解液中各待測物的濃度X為橫坐標，待測物的峰面積與內(nèi)標峰面積之比Y為縱坐標，求得的直線回歸方程即為標準曲線，見表3。以 10 倍信噪比(S/N=10)確定儀器的定量下限(LLOQ)，雌二醇、2-OH雌二醇、4-OH雌二醇分別為0.4、0.2、0.2 ng/mL。

2.5.3 精密度和準確度 精密吸取細胞裂解液90 μL，配制6份雌二醇及羥基雌二醇定量下限濃度(LLOQ)、低濃度(LQC)結(jié)果顯示乙腈作為有機相時、中濃度(MQC)、高濃度(HQC)質(zhì)控樣品，雌二醇、2-OH雌二醇、4-OH雌二醇濃度分別為0.4、0.2、0.2，1.2、0.6、0.6，2.8、1.4、1.4，15、7.5、7.5 ng/mL，按“2.3”方法處理樣品，“2.4”方法進樣測定，記錄各物質(zhì)的峰面積，計算各藥物的峰面積與內(nèi)標的峰面積的比值，帶入當天隨行標曲并求得各藥物的實際濃度，計算實際測定量與加入量的比值，進而求算準確度及日內(nèi)、日間精密度,結(jié)果見表7-9。結(jié)果表明，該方法測定細胞中雌二醇及其羥基代謝物的日內(nèi)及日間精密度均良好，滿足生物樣品分析要求。

化合物回歸方程(ng/mL)rLLOQ(ng/mL)雌二醇Y=0．2707X+0．08350．99850．42-OH雌二醇Y=0．3932X+0．0050．99870．24-OH雌二醇Y=0．3915X+0．02110．99850．2

2.5.4 基質(zhì)效應考察 取細胞裂解液90 μL，分別加入低濃度、高濃度的標準品混合溶液10 μL, 配制成含雌二醇、2-OH雌二醇、4-OH雌二醇的LQC、HQC標準添加細胞裂解液的樣本(n=6)，按“2.3”方法處理樣品，“2.4”方法進樣測定，記錄各物質(zhì)的峰面積均為A1，另用90 μL超純水代替細胞裂解液。其他步驟同上，獲得相應峰面積為A2，結(jié)果如表10所示，基質(zhì)效應的計算公式為ME(%) = A1/A2×100%。由結(jié)果可知，雌二醇及其羥基代謝物、內(nèi)標炔雌醇的基質(zhì)效應均在85%～115%之間，即離子效應對本法結(jié)果測定影響較小，基本滿足底物定量分析的要求。

2.5.5 穩(wěn)定性考察 分別考察了雌二醇及其羥基代謝物的低、高6個QC質(zhì)控樣品的室溫放置2h的穩(wěn)定性、自動進樣器放置24h的穩(wěn)定性及樣品凍融3次穩(wěn)定性，以上穩(wěn)定性考察結(jié)果見表11。結(jié)果表明在上述條件下樣品均穩(wěn)定。

2.6 雌二醇細胞攝取實驗 取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，用含10%胎牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔5×105個細胞接種到6孔板，每孔體積1 mL ，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜后貼壁，撤掉上清液，PBS溶液清洗三遍，然后加入含有雌二醇培養(yǎng)基2mL，雌二醇的作用終濃度為0.4μM、0.8μM、1μM，實驗設6個復孔，藥物作用時間為10、30、40、60、120、240、480、720min，在藥物相應作用時間結(jié)束時撤掉藥物，并用PBS清洗細胞表面4次，加入Ripa裂解液(含1%PMSF)200 μL，冰上裂解十分鐘，收集細胞裂解液，然后以12000 rpm離心10 min，收集上清液，取一部分用于蛋白濃度測定，另一份按“2.3”方法處理樣品，“2.4”方法進樣測定，記錄各物質(zhì)的峰面積。最終細胞內(nèi)的藥物量用藥物(ng)/蛋白質(zhì)(μg)表示。

結(jié)果見圖4和圖5，MCF-7細胞中可以測得雌二醇及2-OH雌二醇，并呈劑量依賴性 細胞中2-OH雌二醇及雌二醇隨著時間增加而增多，而4-OH雌二醇未能測得，可能由于雌二醇在MCF-7中不經(jīng)過CYP1B1代謝，而經(jīng)過CYP1A1代謝。

表3 細胞中雌二醇、2-OH雌二醇、4-OH雌二醇日內(nèi)、日間精密度及準確度測定結(jié)果(n=6)

表4 MCF-7 細胞中雌二醇及其羥基代謝物 和內(nèi)標基質(zhì)效應(n=5)

表5 MCF-7 細胞中雌二醇及其羥基代謝物 內(nèi)標的穩(wěn)定性考察(n=6)

圖2 雌二醇在MCF-7細胞中平均藥量-經(jīng)時變化曲線

3 討論

本研究對流動相進行了篩選，分別考察了甲醇和乙腈作為有機相，結(jié)果顯示乙腈作為有機相時，各藥物響應值穩(wěn)定性良好、分析時間縮短，基底噪音信號較小，因此選擇乙腈作為本研究的有機相。此外加入0.1%甲酸，可以顯著提高待測物的離子化效率。

圖3 2-OH雌二醇在MCF-7細胞中平均藥量-經(jīng)時變化曲線

考慮到雌激素為低極性的化合物，缺少可離子化的基團，質(zhì)譜響應信號較低，針對這一問題，衍生化可以提高其離子響應，本實驗比較了衍生化試劑丹磺酰氯和吡啶-3-磺酰氯的離子化效率，發(fā)現(xiàn)吡啶-3-磺酰氯效果更好，還考察了碳酸氫鈉緩存液的pH值對于質(zhì)譜響應的影響，發(fā)現(xiàn)pH為10.71時響應最大，此外對衍生化時的溫度及時間也進行了考察，發(fā)現(xiàn)溫度60℃為宜，時間為40分鐘，溫度和時間不可過高，否則質(zhì)譜響應將降低。關于萃取試劑的選擇，發(fā)現(xiàn)甲基叔丁基醚的萃取效果比乙酸乙酯更好。

細胞實驗中，我們也嘗試測過給藥后細胞培養(yǎng)基中的藥物量，發(fā)現(xiàn)細胞外液中可以測到4-OH雌二醇，而實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞中沒有，這可能由于4-OH雌二醇可導致基因突變，細胞出于自身保護而做出的一種自發(fā)的外排行為。

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