絕經(jīng)后女性血漿骨代謝相關(guān)差異蛋白表達(dá)的研究*

★ 鄭雪峰吳鉛淡 林燕萍

(福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院 福州 350122)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是以全身骨量減少，伴骨組織顯微結(jié)構(gòu)改變，致使骨脆性增高及骨折患病風(fēng)險增加的一種全身性骨病。為常見的老年慢性疾病之一，尤其好發(fā)于絕經(jīng)后女性。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是指因卵巢功能衰竭引發(fā)、多種原因引起的單位體積骨組織中骨量減少，而骨礦物質(zhì)和基質(zhì)比不變的代謝性骨病。其發(fā)病機(jī)制與卵巢合成的激素降低有關(guān)，其與增齡性骨質(zhì)疏松不同的是，松質(zhì)骨的變化顯著，常見脊椎骨折及腕部骨折[1]。目前本癥已在世界常見病多發(fā)病中居第七位，現(xiàn)在患病人數(shù)已超過2億，每年住院費用高達(dá)250億美元，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥及其并發(fā)癥已然成為嚴(yán)峻的社會健康問題[2]。本研究基于課題組前期研究的基礎(chǔ)上，擬采用具有高通量、高靈敏度蛋白檢測的懸液芯片技術(shù)，分析不同骨量的自然絕經(jīng)后婦女血漿中ACTH、DKK-1、FGF-23、IL-1β、IL-6、Insulin、Leptin、OPG、BGP、OPN、PTH、SOST、TNF-a等骨代謝指標(biāo)的表達(dá)，分析并初步篩選出與骨代謝密切相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，為進(jìn)一步探索防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供有力的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 資料

1.1 基本資料 全部研究對象共150例，均來源于2015年9月1日—2016年10月31日期間福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬省泉州市正骨醫(yī)院就診的泉州地區(qū)常住漢族婦女PMOP患者150例，年齡45～65歲，絕經(jīng)年限均在1年以上，簽署自愿加入臨床研究。研究對象在性別、年齡、病程等方面經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照1994年世界衛(wèi)生組織(WHO)的骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，參考《中國人骨質(zhì)疏松癥建議診斷標(biāo)準(zhǔn)(第二稿)》[3]建議，基于雙能X線骨密度儀(DEXA)測定值的骨質(zhì)疏松癥分級診斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1)癥狀：疼痛、脊柱變形、脆性骨折；

2)骨密度：雙能X線吸收法(DEXA)測定值

T-score≥-lSD正常-2．5SD

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 1)符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；2)年齡45～65歲，籍貫為泉州地區(qū)，居住≥10年的自然絕經(jīng)后漢族女性，絕經(jīng)年限≥1年；3)自愿加入該臨床研究者，并簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 1)不符合骨質(zhì)疏松癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)者；2)年齡在45歲以下或65歲以上或自然絕經(jīng)不足1年的女性；3)長期服用其他有關(guān)治療藥物，不能立即停用者；4)治療前三個月內(nèi)服用治療PMOP中藥、西藥的病例；5)過敏體質(zhì)者、支氣管哮喘病史、晚期畸形、殘疾者；6)有內(nèi)分泌疾病、代謝性疾病或腫瘤，如甲亢、糖尿病、多發(fā)性骨髓瘤、骨科制動等引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松等；7)合并有心腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病及精神病患者；8)難以溝通，不配合者。

2 研究方法

2.1 骨密度測定方法 150例自然絕經(jīng)后婦女采用雙能X線骨密度儀(DEXA)檢測正位腰椎(L2-L4)骨密度。為消除體位和生理解剖對測量真實值的影響，囑患者仰臥，身體上下、左右范圍不能超出規(guī)定范圍，掌心向下，兩小腿抬高，下置立方體泡沫墊，使股骨與掃描床垂直，脛腓骨與掃描床平行。記錄腰椎正位BMD、BMC及腰椎最低T值。根據(jù)受試對象前期的骨密度檢測結(jié)果及調(diào)查問卷的情況，經(jīng)受試者同意簽署知情同意書后，予以免費檢測。

2.2 病例分組 將2015年09月01日至2016年10月31日期間福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬省泉州市正骨醫(yī)院就診的泉州地區(qū)常住漢族婦女PMOP患者150例，年齡45～65歲，絕經(jīng)年限均在1年以上，經(jīng)腰椎(L2-L4)骨密度檢測后，根據(jù)上述骨質(zhì)疏松癥分級診斷標(biāo)準(zhǔn)將上述病例分組如下：

①骨量正常組(T-score<-l.0 SD)；

②骨量減少組(-2.5 SD

③輕度骨質(zhì)疏松組(-3.0 SD

④中度骨質(zhì)疏松組(-3.5 SD

⑤重度骨質(zhì)疏松組(T-score≦-3.5 SD或T-score≧-2.5 SD伴一處或多處骨折)。

2.3 懸液芯片檢測血漿骨代謝蛋白差異

2.3.1 血漿樣本采集 所有研究對象空腹抽取外周肘靜脈全血5 mL置于EDTA抗凝管中，1000×g離心15 min，取上層血漿，-20℃貯存、備用。

2.3.2 懸液芯片檢測 采用液相芯片分析系統(tǒng)(Bio-Plex懸液芯片系統(tǒng)檢測儀，美國Bio-Rad公司)測定血漿標(biāo)本中的13個骨代謝細(xì)胞因子：ACTH、DKK-1、FGF-23、IL-1β、IL-6、Insulin、Leptin、OPG、BGP、OPN、PTH、SOST、TNF-a。具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0版統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析、處理，結(jié)果用±S表示。組間比較采用兩樣本t檢驗；多組間比較使用單因素方差分析；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有非常顯著性差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 不同骨量組自然絕經(jīng)后婦女血漿骨代謝蛋白比較 由表1可見，與骨量正常組相比，骨量減少組及不同程度骨質(zhì)疏松組各組中DKK-1、IL-6、BGP、ACTH、IL-1β、OPN、SOST、TNF-a含量增加，OPG、Leptin、FGF-23、Insulin含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PTH無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

3.2 骨密度與骨代謝蛋白的相關(guān)性分析 表2中顯示骨密度與各血中骨代謝蛋白的相關(guān)性分析的r值、P值。由表可見DKK-1、IL-6、OPN、BGP、OPG、Leptin、FGF-23、Insulin與骨密度的相關(guān)性有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中各組中隨著骨密度的降低，DKK-1、IL-6、OPN 、BGP水平呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，OPG、Leptin、FGF-23、Insulin水平呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。

表1 不同骨量組自然絕經(jīng)后婦女血漿骨代謝蛋白比較(pg/ml)

注 a:與骨量正常組相比，*P<0.05，**P<0.01；b:與骨量減少組相比，◇P<0.05，◇◇P<0.01；c:與輕度骨質(zhì)疏松癥組相比，☆P<0.05，☆☆P<0.01；d:與中度骨質(zhì)疏松癥組相比，◆P<0.05，◆◆P<0.01。

項目rpACTH-0．8160．093DKK-1-0．8850．046IL-6-0．8910．044Insulin 0．9340．021Leptin 0．8820．048TNF-a-0．8060．090OPG 0．9160．007BGP-0．9460．008OPN-0．9330．013PTH-0．0580．933FGF-23 0．9420．017

4 討論

PMOP目前的主要診斷依據(jù)是骨密度檢測，盡管骨密度是反映骨質(zhì)疏松輕重程度、預(yù)測骨折危險性的重要依據(jù)，同時也是評價骨量最有說服力的指標(biāo)之一，但是骨密度檢測具有以下缺點:無法反應(yīng)整個機(jī)體的骨變化情況，骨密度精度誤差約1%～5%，低于1%的變化難以被測定出來，不適合短期隨訪檢測；用來監(jiān)控藥物治療有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義至少需1年[4-5]。在骨質(zhì)疏松早期，骨生化指標(biāo)的改變較骨密度的改變出現(xiàn)早而明顯。因此，骨代謝生化指標(biāo)檢測也逐漸用于臨床骨質(zhì)疏松癥的診斷分型、預(yù)測骨折風(fēng)險以及抗骨質(zhì)疏松治療療效評價，并且在骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制研究及流行病學(xué)研究方面具有重要臨床意義。但是，傳統(tǒng)的骨代謝標(biāo)志物，如血鈣、血磷、血清ALP等，都存在特異性差、敏感性低、干擾因素多等缺點。近年來一些特異性的骨代謝生化指標(biāo)由于具有及時、靈敏、特異性等優(yōu)點，可以早期反映出骨的轉(zhuǎn)換水平，通過觀察這些特異性骨代謝指標(biāo)的變化，有利于發(fā)現(xiàn)骨折的高危人群，達(dá)到預(yù)測骨折發(fā)生的風(fēng)險性，可進(jìn)一步了解某治療方法或藥物對PMOP患者的早期療效，對PMOP的診治及治療方案的調(diào)整起指導(dǎo)作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，一些骨代謝的生化指標(biāo)與骨重建過程密切相關(guān)，BGP是骨基質(zhì)中最主要的非膠原蛋白成分，主要由成骨細(xì)胞合成，骨形成和骨吸收均可釋放BGP。因此，血漿中BGP濃度不僅與骨形成活躍程度有關(guān)，還反映了骨重建的整體水平。瘦素(Leptin)可通過與中樞和外周的受體結(jié)合從而對骨代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，在外周Leptin能直接刺激成骨細(xì)胞分化[7]。骨保護(hù)素(OPG)是1997年由Simonet發(fā)現(xiàn)的一種分泌型糖蛋白，在成骨細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞均有表達(dá)，血漿OPG水平與年齡密切相關(guān)，骨吸收過量時，OPG代償性分泌增加，絕經(jīng)后女性O(shè)PG水平高于絕經(jīng)前婦女[8]。DKK-1為成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間的耦聯(lián)失衡導(dǎo)致機(jī)體骨高轉(zhuǎn)換狀態(tài)，為骨質(zhì)疏松癥骨量減少的重要原因。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)是一類促進(jìn)細(xì)胞生長與分化的重要調(diào)節(jié)因子，能刺激骨髓成骨祖細(xì)胞增殖分化能力；刺激成骨細(xì)胞基因的合成與表達(dá)，增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成作用[9]。在本研究中，結(jié)果顯示隨著骨密度的降低，DKK-1、IL-6、OPN、BGP水平呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，OPG、Leptin、FGF-23、Insulin水平呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。提示DKK-1、IL-6、OPN、BGP、OPG、Leptin、FGF-23、Insulin可作為評價絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松嚴(yán)重程度的檢測指標(biāo)，

為進(jìn)一步探索防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供有力的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

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