3種蟲(chóng)草水提物體外抗氧化能力研究

羅勝勇 栗原博 樂(lè)志勇 于留榮 曹暉

摘要：測(cè)定了天然冬蟲(chóng)夏草、人工培育冬蟲(chóng)夏草及發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉三種蟲(chóng)草樣品水提取物的體外抗氧化能力及其所含SOD活性，分析了3種樣品體外抗氧化能力大小是否與其所含SOD活性高低有關(guān)。測(cè)定結(jié)果表明：各樣品對(duì)DPPH·、超氧陰離子都有很好的清除作用，最大清除率大小依次為：天然冬蟲(chóng)夏草、人工培育冬蟲(chóng)夏草、發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉;半教清除濃度從小到大依次為：天然冬蟲(chóng)夏草、人工培育冬蟲(chóng)夏草、發(fā)酵蟲(chóng)草茵粉。各樣品均具有一定的總抗氧化力和總還原力，總抗氧化能力大小依次為：天然冬蟲(chóng)夏草、人工培育冬蟲(chóng)夏草、發(fā)酵蟲(chóng)草茵粉;總還原力大小依次為：天然冬蟲(chóng)夏草、發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉、人工培育冬蟲(chóng)夏草。樣品SOD活性高低依次為：天然冬蟲(chóng)夏草、人工培育冬蟲(chóng)夏草、發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉。3種樣品體外抗氧化能力高低與其所含SOD活性高低有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞：天然冬蟲(chóng)夏草;人工培育冬蟲(chóng)夏草;發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉;抗氧化活性;超氧化物歧化酶

中圖分類號(hào)：R282. 71

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-9944（2018）14-0245-04

1 引言

氧自由基是一類具有不配對(duì)電子的活潑化學(xué)基團(tuán)，與人體健康具有密切關(guān)系。生理狀況下，人體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除保持平衡，但當(dāng)體內(nèi)清除自由基物質(zhì)不足、自由基過(guò)多時(shí)，就會(huì)與許多生物大分子發(fā)生氧化損傷反應(yīng)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明衰老、炎癥、癌癥、心血管疾病以及帕金森阿爾茨海默氏等神經(jīng)退行性疾病都與自由基氧化損傷有關(guān)。因此，尋找高效、無(wú)毒的具有清除自由基作用的天然抗氧化活性的物質(zhì)，對(duì)預(yù)防疾病、延緩衰老具有重要的意義。冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps sinensis （Berk.） Sacc.）為麥角菌科真菌寄生在蟲(chóng)草蝙蝠蛾（Hepialus armoricanus）幼蟲(chóng)上的子座及幼蟲(chóng)內(nèi)菌核的復(fù)合體，是一種名貴的滋補(bǔ)性傳統(tǒng)中藥材，除含有蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草多糖外，還含有豐富的超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD），具有明顯的抗氧化功能。但由丁天然野蟲(chóng)草資源有限，現(xiàn)市場(chǎng)上多采用人工培養(yǎng)蟲(chóng)草和發(fā)酵蟲(chóng)草產(chǎn)物進(jìn)行替代。研究擬對(duì)3種蟲(chóng)草水提取物抗氧化能力及其所含SOD酶活性進(jìn)行測(cè)定和比較，為今后更加科學(xué)合理的利用3種蟲(chóng)草資源、開(kāi)發(fā)抗氧化的蟲(chóng)草保健品提供理論依據(jù)。

2材料與方法

2.1材料和試劑

天然冬蟲(chóng)夏草、人工培育冬蟲(chóng)夏草，由康美（北京）藥物研究院有限公司

提供.批號(hào)：201607;發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉，由浙江萬(wàn)豐企業(yè)集團(tuán)制藥有限公司提供，批號(hào)：201404225。1，1-二苯基-2-：j硝基苯臍（DPPH），MACKLIN公司提供，批號(hào)：C10085683;鄰二氮菲，MACKLIN公司提供，批號(hào)：C10073869;NADH，Solarbio公司提供，批號(hào)：No.81180313;NBT，BIOSHARP公司提供;三氯醋酸，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)：20160920;吩嗪硫酸甲酯（PMS），aladdin公司提供，批號(hào)：A1614069;2，4，6-三吡啶三吖嗪（TPTZ），Solarbio公司提供，批號(hào)：No. 5258021;硫酸亞鐵（FeSO₄），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：2016。229;三氯化鐵，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)：20160616;雙氧水（H₂O₂），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20161008;Ve（分析純），上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160701;SOD試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)：20160516。

2.2儀器與設(shè)備

AL104電子天平，梅特勒一托利多（上海）有限公司提供：LTV-1750紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司生產(chǎn);電熱水浴鍋，上海醫(yī)療器械五廠生產(chǎn)：GL -16G- Ⅱ型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

2.3樣品制備

水提?。焊鳂悠啡?g細(xì)粉，用25 mL水在25℃振蕩提取，隔日用3000 r/min離心15 min，收集上清液，殘?jiān)儆蒙倭克?次，合并2次提取液，定容至40mL，樣品濃度計(jì)為50 mg/mL。取1/2樣品用于體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，剩余樣品用于測(cè)定SOD酶活性。

2.4樣品中SOD測(cè)定

丙酮純化：樣品經(jīng)水提取，將離心后上清液倒人燒杯并置冰水浴中沿杯壁加入1倍體積預(yù)冷至-15℃的丙酮，再以3000r/min離心15 min，棄去沉淀。上清液加入0.8倍體積預(yù)冷至-15℃的丙酮，靜置后離心收集沉淀，將沉淀溶于少量蒸餾水中，透析出除去丙酮。即可得到所需的酶溶液。取各樣品丙酮純化液，按照試劑盒說(shuō)明分別進(jìn)行SOD酶活力的測(cè)定和計(jì)算。

2.5 清除DPPH·（1，1-二苯基-2-三硝基苯臍試驗(yàn)

樣品水提取液原液濃度均為50 mg/mL，分別用雙蒸水倍比稀釋成25 mg/mL，12.5 mg/mL，6.25 mg/mL，3.12 mg/mL，1. 56 mg/mL，0. 78 mg/mL。4℃保存待用。精確吸取1.0 mL不同濃度各樣品液予10 mL試管中，再加入4.0 mL 0.004% （w/v）的DPPH自由慕溶液（用無(wú)水乙醇配制），使總體積為5.0 mL。用力搖勻后窒溫放置30 min后于524 nm處測(cè)吸光度值（紫外分光光度計(jì)）。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。樣品液對(duì)DPPH的清除率R按公式計(jì)算：

R=[A₀-（A₁-A₂）]/A₀×100%

（1）

式（1）中，A₀=4 mLDPPH，溶液+1 mL無(wú)水乙醇溶液的吸光度值;A₁=4 mLDPPH，溶液+1 mL樣品液的吸光度值;A₂=4 mL，無(wú)水乙醇溶液+1 mL樣品液的吸光度值。

以清除率R對(duì)樣品濃度進(jìn)行回歸處理，計(jì)算出各樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50）數(shù)值。

2.6清除超氧陰離子自由基作用

精確吸取0. 1mL不同濃度的樣品溶液，依次加入1.0 mL磷酸鹽緩沖液（pH值7.4）、1.0 mL 150 μmol/L的NBT（pH值7.4的磷酸鹽緩沖液配制）、1.0 mL468 μmol，/L的NADH（用pH值7.4的磷酸鹽緩沖液配制）、0.1 mL 60μmol/L的PMS（用pH值7.4的磷酸鹽緩沖液配制），混勻，室溫下（25℃）靜置反應(yīng)5mm，在560 nm下測(cè)定吸光度A。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。樣品液對(duì)超氧陰離子的清除率R按公式計(jì)算：

R=（ AO - A1）/AO×100%

（2）

式（2）中，A0=0.1mL，甲醇溶液+1.0mL磷酸鹽緩沖液+1.0mLNBT+1.0mLNADH +0.1 mL PMS的吸光度值;A1=0.1 mL，樣品溶液+1.0 mL磷酸鹽緩沖液+1. 0mLNBT+1. 0mLNADH+0.1 mLPMS的吸光度值。

以清除率R對(duì)樣品濃度進(jìn)行回歸處理，計(jì)算出各樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50）數(shù)值。

2.7 總抗氧化力測(cè)定（FRAP）

TPTZ工作液由25 mL醋酸鹽緩沖液（300 mmol/L，pH=3.6） ，2.5 mL 10 mmol/L TPTZ（用40 mmol/LHCl配制），2.5 mL FeCl₃ （FeCl₃·6H₂0，20 mmol/L）溶液配制而成。分別取不同體積（0. 15、0.20、0.25、0. 30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL）的0.25 mmol/LFeSO₄溶液，用蒸餾水補(bǔ)充至2 mL，再加入1 mL TPTZ工作液，混勻后于37℃反應(yīng)20 min，后丁593 nm處測(cè)定吸光度。用X軸表示FeSO₄溶液的摩爾質(zhì)量，Y軸表示吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。取不同濃度提取物溶液2mL，再加入1 mL TPTZ工作液，混勻后于37℃反應(yīng)20 min，后于593 nm處測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。根據(jù)吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算結(jié)果表示為1g提取物中FeSO₄（ mmol/L）含有量。

2.8總還原力測(cè)定

取1 mL不同濃度樣液于試管中，依次加入2.5 mL0.2 mol/L pH=6.6磷酸緩沖溶液和2.5mL 1%鐵氰化鉀（ K₃ Fe（ CN）₆）溶液，50℃水浴保溫20 min后決速冷卻，再加入2.5 mL 10%三氯醋酸溶液，4000 r/min離心10 min，取上清夜2.5 mL。向該上清液中依次加入2.5 mL蒸餾水，0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液振蕩搖勻，靜置10 min。700 nm下測(cè)其吸光度值（OD），吸光度越大，其總還原力越強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)組（ Ai）：1 mL樣品+2.5 mL緩沖液+2.5mL鐵氰化鉀+2.5 mL三氯乙酸+2.5 mL雙蒸水+0.5 mL三氯化鐵

對(duì)照組（Ao）：1 mL雙蒸水+2.5 mL緩沖液+2.5mL鐵氰化鉀+2.5 mL三氯乙酸+2.5 mL雙蒸水+0.5 mL三氯化鐵

空白組（Aj）：1 mL樣品+2.5 mL緩沖液十雙蒸水8 mL（加入量=鐵氰化鉀十三氯乙酸十雙蒸水十三氯化鐵的總量）

清除率（%）=[1- （Ai-Aj）/Ao]×100.

2.9數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以x±S表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

3結(jié)果

3.1各樣品中SOD含量

每個(gè)樣品取提取原液進(jìn)行測(cè)定（50 mg/mL），重復(fù)3次。結(jié)果顯示，天然蟲(chóng)草中SOD含量最高，人工培育蟲(chóng)草次之，發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉中SOD含量最低。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2各樣品對(duì)DPPH·的清除作用

結(jié)果顯示，各樣品對(duì)DPPH·都有很好的清除作用，最大清除率從大到小依次為：滅然蟲(chóng)草、人工培育蟲(chóng)草、蟲(chóng)草菌粉，3種樣品對(duì)DPPH·最大清除率差異有顯著性;DPPH·半數(shù)清除濃度從小到大依次為：天然蟲(chóng)草、人工培育蟲(chóng)草、蟲(chóng)草菌粉，3種樣品對(duì)DPPH·半數(shù)清除濃度差異有顯著性。具體結(jié)果見(jiàn)表2、3。

3.3各樣品對(duì)超氧陰離子清除作用

結(jié)果顯示，各樣品對(duì)超氧陰離子都有很好的清除作用，最大清除率從大到小依次為：天然蟲(chóng)草、人工培育蟲(chóng)草、蟲(chóng)草菌粉，3種樣品對(duì)超氧陰離子最大清除率差異有顯著性;超氧陰離子半數(shù)清除濃度從小到大依次為：天然蟲(chóng)草、人工培育蟲(chóng)草、蟲(chóng)草菌粉，3種樣品對(duì)超氧陰離子半數(shù)清除濃度差異有顯著性。具體結(jié)果見(jiàn)表4、5。

3.4各樣品總抗氧化力

3.4.1硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)濃度梯度測(cè)定吸光度值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體結(jié)果見(jiàn)表6、圖1。

3.4.2 各樣品吸光度值及總抗氧化能力

根據(jù)硫酸亞鐵含量標(biāo)準(zhǔn)曲線和各樣品吸光度值，計(jì)算各樣品中硫酸亞鐵含量，并以硫酸亞鐵含量大小反應(yīng)各樣品總抗氧化能力大小。結(jié)果顯示，各樣品均有一定的總抗氧化能力，總抗氧化能力最強(qiáng)為天然蟲(chóng)草，人工培育蟲(chóng)草和蟲(chóng)草菌粉次之。與天然蟲(chóng)草相比，人工培育蟲(chóng)草和蟲(chóng)草菌粉總抗氧化能力有明顯降低，差異有顯著性，人工培育蟲(chóng)草與蟲(chóng)草菌粉差異無(wú)顯著性。具體結(jié)果見(jiàn)表7。

4討論

目前市場(chǎng)中蟲(chóng)草主要分為天然蟲(chóng)草，人工培育蟲(chóng)草和蟲(chóng)草菌粉三類。以往研究表明冬蟲(chóng)夏草中具有明顯抗氧化作用，并含有豐富的超氧化物歧化酶（ SOD），但關(guān)于天然蟲(chóng)草與人工培育蟲(chóng)草及蟲(chóng)草菌粉的抗氧化能力之間的比較研究以及蟲(chóng)草產(chǎn)品的抗氧化能力與其所含的SOD是否有關(guān)還缺少報(bào)道。由于天然產(chǎn)物中含有成分較多，采用不同的抗氧化活性評(píng)價(jià)體系，不同溶劑提取物的抗氧化活性存在差異”。因此在進(jìn)行抗氧化劑篩選時(shí)，應(yīng)該采用多種方法綜合評(píng)定中藥的抗氧化能力才較為準(zhǔn)確。研究表明DPPH·自由基清除率與OH清除率、H₂O₂清除率相關(guān)性很低，但DPPH·自由基清除率與總抗氧化能力和總還原能力間呈顯著性相關(guān)性。而·OH清除率、H₂O₂清除率與總抗氧化能力和總還原能力相關(guān)性也較低。因此本研究采用DPPH·、超氧陰離子自由基清除率、總抗氧化活性、總還原能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)，以便更科學(xué)全面地評(píng)價(jià)受試樣品的體外抗氧化能力。結(jié)果顯示，3種樣品均具有明顯的體外抗氧化能力，在DPPH·清除、超氧陰離子自由基清除和總抗氧化能力測(cè)定試驗(yàn)中，天然蟲(chóng)草的作用均最為明顯，人工蟲(chóng)草次之，蟲(chóng)草菌粉作用相對(duì)最弱，在總還原力測(cè)定中試驗(yàn)中，天然蟲(chóng)草作用仍為最強(qiáng)，蟲(chóng)草菌粉次之，人工蟲(chóng)草作用相對(duì)最弱?？傮w評(píng)價(jià)，天然蟲(chóng)草的體外抗氧化能力最強(qiáng)，人工蟲(chóng)草次之，蟲(chóng)草菌粉作用相對(duì)最弱。

本研究結(jié)果還表明，天然蟲(chóng)草和人工蟲(chóng)草中均有明顯SOD活性，而天然蟲(chóng)草活性相對(duì)更高，蟲(chóng)草菌粉則基本無(wú)明顯SOD活性，與之相對(duì)應(yīng)的是天然蟲(chóng)草的體外抗氧化能力最強(qiáng)，人上蟲(chóng)草次之，蟲(chóng)草菌粉作用最弱。上述結(jié)果表明蟲(chóng)草的體外抗氧化能力大小與其所含SOD活性高低有密切關(guān)系，SOD活一降高低可以作為蟲(chóng)草產(chǎn)品的體外抗氧化能力的一個(gè)重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。雖然3種蟲(chóng)草抗氧化能力有差異，但在天然資源有限的情況下，人工培育蟲(chóng)草和蟲(chóng)草菌粉仍然不失為良好的替代品。本次試驗(yàn)結(jié)果可為更加科學(xué)合理地利用蟲(chóng)草資源提供新的理論依據(jù)。

同時(shí)研究中也發(fā)現(xiàn)，蟲(chóng)草菌粉基本無(wú)SOD活性，但也表現(xiàn)出明顯的抗氧化作用，表明蟲(chóng)草的抗氧化作用可能還與其他成分有關(guān)，比如蟲(chóng)草多糖等。另外應(yīng)該注意的是，冬蟲(chóng)夏草作為一種滋補(bǔ)藥材，主要還是以口服為主，因此后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)其體內(nèi)的抗氧化作用進(jìn)行深入研究。