間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療骨質(zhì)疏松研究進(jìn)展*

艾菊青，毛浩萍

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

骨質(zhì)疏松癥（OP）是以骨量減少、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)退化、破壞，導(dǎo)致骨脆性和骨折危險(xiǎn)性增加為特征的一種全身性、代謝性骨骼疾病[1]。年齡逐步增長(zhǎng)或女性進(jìn)入絕經(jīng)期，體內(nèi)性激素水平的驟減、鈣調(diào)節(jié)激素的分泌紊亂及微量元素的攝入不足是導(dǎo)致老年和絕經(jīng)女性原發(fā)性O(shè)P的重要病因。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，OP治療花費(fèi)亦在逐年增加。根據(jù)2009年國(guó)際骨質(zhì)疏松癥基金會(huì)首次在亞洲14個(gè)國(guó)家開(kāi)展的骨骼健康狀況和OP的綜合性研究報(bào)告指出：至2020年，中國(guó)OP或低骨密度患者將達(dá)到2.866億人次，而因骨質(zhì)疏松引起的髖部骨折治療經(jīng)費(fèi)將達(dá)到850億元，至2050年患者人數(shù)則將躍升至5.333億；治療經(jīng)費(fèi)更劇增至1.8萬(wàn)億元[2]。因此世界衛(wèi)生組織（WHO）將OP列為心血管疾病之后的第二位健康問(wèn)題，但目前尚未完全闡明OP的發(fā)生機(jī)制。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是來(lái)源中胚層存在于骨髓及多種組織中的多向分化的一類干細(xì)胞，可向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等分化。MSCs符合干細(xì)胞所特有的自我更新和多向分化的潛能，又不具有致畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)，因此MSCs剛被鑒定不久研究者就嘗試?yán)肕SCs移植治療多種疾病[3-5]。多項(xiàng)研究證實(shí)，OP的發(fā)生與MSCs向脂肪和成骨分化失衡密切相關(guān)，因此，本文擬圍繞MSCs與OP間的關(guān)系及現(xiàn)存有問(wèn)題進(jìn)行綜述，旨在為MSCs移植治療OP提供一定理論依據(jù)。

1 MSCs概述

Friedenstein等[6]最早發(fā)現(xiàn)MSCs是一類存在于骨髓，具有呈纖維樣貼壁非造血細(xì)胞。隨后諸多深入實(shí)驗(yàn)表明MSCs呈克隆樣單個(gè)核細(xì)胞團(tuán)，具有較強(qiáng)的增殖能力和一定的自我更新能力并有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的潛能。MSCs存在多種組織器官中，如骨髓、臍帶血、脂肪、肺、肝及皮膚，但在不同組織中占有比例不同：占骨髓有核細(xì)胞的0.001%-0.01%[7]，在羊水中具有較高的比例為0.9%～1.5%[8]。目前并未有公認(rèn)的MSCs表面分子鑒定金標(biāo)準(zhǔn)，而依據(jù)其來(lái)源種屬的不同具有相應(yīng)差異，如來(lái)源于人的MSCs表面標(biāo)記至少應(yīng)該具有Strom-1，CD44，CD71，CD90，CD105 的高表達(dá)；源于小鼠的為 Sca-1，CD105，CD140a，CD44 的高表達(dá)；造血和內(nèi)皮則標(biāo)記為陰性，如CD45，CD31，CD34，CD11b，CD79c等[9]。并且多項(xiàng)研究顯示來(lái)源于機(jī)體不同部位的MSCs，其表面分子表達(dá)標(biāo)記也具有差異性，如來(lái)源于脂肪組織的MSCs會(huì)高表達(dá)CD45，而來(lái)源于骨髓的MSCs則高表達(dá)CD271，表明MSCs的表面分子表達(dá)具有不穩(wěn)定性，這可能與MSCs異質(zhì)性、體外培養(yǎng)時(shí)間和代數(shù)等多種原因相關(guān)，同時(shí)也需要更多深入的研究來(lái)探索和準(zhǔn)確的鑒定MSCs表面分子標(biāo)記。

MSCs作為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的同源體，當(dāng)成骨-脂肪間失衡，就能引起OP。研究表明老化促進(jìn)MSCs向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可能是由于老化引起活性氧簇（ROS）增加，激活過(guò)氧化酶體增殖物激活（PPAR）受體，從而導(dǎo)致MSCs向脂肪細(xì)胞分化增多，造成成骨-脂肪的失衡[10-11]；李東菊等的研究也證實(shí)去勢(shì)后大鼠MSCs增殖能力及成骨分化能力減弱，且趨向脂肪細(xì)胞進(jìn)行分化[12]。同時(shí)，MSCs可分泌多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，利于受損組織進(jìn)行修復(fù)，如MSCs通過(guò)分泌骨形成蛋白（BMPs）進(jìn)行軟骨、骨及肌腱等修復(fù)[13]。且MSCs的獲得不受倫理限制，也無(wú)并發(fā)畸胎瘤等風(fēng)險(xiǎn)，MSCs具有易獲得性及明確的成骨分化能力，均為日后其移植治療骨質(zhì)疏松奠定了基礎(chǔ)。

2 MSCs移植治療OP的可行性

由于MSCs具有廣泛的獲得性并擁有多向分化的潛能，且多項(xiàng)研究表明MSCs能夠在機(jī)體組織損傷、生長(zhǎng)及愈合中進(jìn)行替換和更新體內(nèi)細(xì)胞。因此，被認(rèn)為具有較強(qiáng)促再生能力的MSCs在治療OP中具有廣泛的應(yīng)用前景。

2.1單純的MSCs移植治療OP 作為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的同源體，MSCs數(shù)量的減少或功能的缺損，會(huì)直接引起OP，因此，系統(tǒng)或局部移植正常功能的MSCs被認(rèn)為對(duì)治療OP具有一定的療效。

Deepshikha T等[14]研究去勢(shì)后大鼠MSCs修復(fù)功能，采用流式細(xì)胞術(shù)觀察去勢(shì)后大鼠MSCs數(shù)量的變化，發(fā)現(xiàn)去勢(shì)后大鼠MSCs干細(xì)胞表面分子標(biāo)記CD90和CD54表達(dá)率明顯下降，且去勢(shì)后大鼠的MSCs更傾向于脂肪細(xì)胞分化；而后分別將去勢(shì)后大鼠的MSCs及正常大鼠的MSCs移植至骨折大鼠，3 h后采用雙探頭單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)（SPECT/CT）掃描，結(jié)果顯示，盡管去勢(shì)后大鼠的MSCs也具有改善鈣結(jié)合能力及提高骨折區(qū)域骨量的功能，但效果明顯低于正常組的MSCs，且歸巢至骨折區(qū)域去勢(shì)大鼠的MSCs明顯少于正常組的MSCs。Jinhui S等[15]分別將1～2月齡的年輕小鼠和20～24月齡自然衰老老年小鼠的BMMSC移植至自然衰老的雌性小鼠中，6個(gè)月后發(fā)現(xiàn)移植年輕小鼠MSCs組骨膜有更多的MSCs，且骨鈣素（OC）含量要遠(yuǎn)高于老年組，這也證實(shí)了老化后MSCs的增殖、歸巢及成骨分化能力均要減弱，另外同時(shí)發(fā)現(xiàn)移植至年輕小鼠MSCs組的小鼠平均壽命長(zhǎng)于老年組。Dmitriy等首先應(yīng)用脊柱損傷大鼠，并分別采用MSCs移植或PTH注射單治療法或聯(lián)合治療2周，觀察脊柱傷口愈合情況，結(jié)果顯示PTH注射可以提高M(jìn)SCs遷移至骨折區(qū)，并促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化，從而促進(jìn)脊柱傷口的愈合。并且為了進(jìn)一步研究MSCs對(duì)脊柱損傷的作用情況，采用豬自分泌的MSCs，對(duì)脊柱損傷的小豬進(jìn)行了同樣的MSCs移植治療，結(jié)果顯示移植后的MSCs具有減緩損傷區(qū)域的骨丟失情況，這些研究結(jié)果表明PTH可能是作為一種黏合劑，從而促進(jìn)移植MSCs向損傷區(qū)域遷移，并進(jìn)一步分化為成骨細(xì)胞，并阻止骨量丟失。

2.2修飾后MSCs移植治療OP 雖然多項(xiàng)研究證實(shí)未經(jīng)任何修飾的MSCs移植雖然能夠駐留于骨，并具有一定增殖能力，且能夠向成骨細(xì)胞分化，增加成骨細(xì)胞的數(shù)量，因此在一定程度上能夠逆轉(zhuǎn)骨流失，但由于宿體移植后MSCs歸巢數(shù)量少，且駐留時(shí)長(zhǎng)短等問(wèn)題，造成MSCs治療療效存有爭(zhēng)議，因此，研究者通過(guò)基因修飾MSCs，期望以此提高M(jìn)SCs治療OP效果。

Yao W等[16]發(fā)現(xiàn)移植單純MSCs僅能在機(jī)體停留4～8周，導(dǎo)致MSCs療法效果甚微，因此，為了提高M(jìn)SCs療效，他們將雙磷酸鹽和MSCs表面高表達(dá)的整合素a4β1的擬態(tài)物配體（LL2A）制成混合物后，再與MSC復(fù)合后同時(shí)靜脈注入去勢(shì)小鼠，研究結(jié)果表明相比于單純的MSCs移植，LL2A-Ale與MSCs復(fù)合物可通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)MSCs的歸巢。Sun WC等[17]采取逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的方法將核因子kB活化因子（RANK-Fc）和（或）趨化因子受體4（CXCR4）整合至MSCs基因組中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靜脈注射至去勢(shì)后小鼠體內(nèi)，過(guò)表達(dá)RANK-Fc和CXCR4的MSCs均可改善去勢(shì)后引起的OP，且趨化因子受體CXCR4-MSCs更能提高M(jìn)SCs的歸巢數(shù)量。

3 MSCs移植治療OP機(jī)制研究

3.1MSCs歸巢作用 MSCs的歸巢是OP治療重要環(huán)節(jié)，需要多種趨化因子和蛋白等參與其中，首先，MSCs通過(guò)卷曲栓附等形式與內(nèi)皮組織進(jìn)行接觸，接著在G蛋白耦合因子活化、整合素介導(dǎo)等激活因素下，MSCs穿過(guò)內(nèi)皮組織，從而到達(dá)基底膜完成歸巢過(guò)程[18]。

SDF1/CXCR4被認(rèn)為是影響MSCs歸巢中最主要的信號(hào)通路，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1）最早被認(rèn)為由干細(xì)胞分泌的可溶性配體，為B祖細(xì)胞生長(zhǎng)因子[19]，隨著研究的深入，SDF-1并不同于其他炎癥因子誘導(dǎo)的產(chǎn)生趨化因子，它由基質(zhì)細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生，并為B淋巴細(xì)胞、骨髓髓系細(xì)胞及心血管內(nèi)皮細(xì)胞等生長(zhǎng)所必須的，而CXCR-4是目前已知的SDF-1唯一受體。源于骨髓的MSCs表達(dá)CXCR4，當(dāng)受損組織如心、腦、腎、骨等具有SDF-1高表達(dá)，在AKT及P38等信號(hào)通路參與下，調(diào)控CXCR-4-MSCs遷移至受損部位[20-22]。

3.2MSCs分泌細(xì)胞因子作用 研究顯示當(dāng)局部多種炎癥因子和缺氧等環(huán)境刺激，MSCs可通過(guò)自身及旁分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨組織再生和修復(fù)。Nixon AJ等發(fā)現(xiàn)MSCs移植至宿體后，能夠分泌多種細(xì)胞因子如生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換因子-1（TGF-β1），胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-I和BMP2等），促進(jìn)軟骨、骨及肌腱等受損組織的修復(fù)[9]。同時(shí)，外源性的MSCs進(jìn)入機(jī)體后，分泌生長(zhǎng)因子激活損傷組織周圍的干細(xì)胞，因此當(dāng)外源性MSCs凋亡或者不再在損傷部位駐留時(shí)，依然可以產(chǎn)生顯著的治療效果。不同于MSCs直接分化為成骨細(xì)胞，移植至機(jī)體的MSCs分泌多種因子，激活和啟動(dòng)宿主自身的再生過(guò)程發(fā)揮著更為廣泛的作用。

3.3與內(nèi)皮細(xì)胞共同作用 研究發(fā)現(xiàn)MSCs需要與內(nèi)皮組織接觸后遷移至受損部位，MSCs如何與內(nèi)皮組織作用機(jī)制尚未完全明確，有研究[23]顯示腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可激活內(nèi)皮細(xì)胞從而提高兩者的結(jié)合，并且在這過(guò)程中MSCs會(huì)分泌一系列的黏附因子，Steingen C等[24]發(fā)現(xiàn)是內(nèi)皮細(xì)胞的經(jīng)典表型，如血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1），整合素β1和基質(zhì)金屬蛋白2（MMP-2）調(diào)控，如內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的VACM-1與MSCs表達(dá)的VLA-4結(jié)合后介導(dǎo)MSCs遷移。

4 MSCs移植治療OP存在的問(wèn)題

盡管MSCs發(fā)現(xiàn)較早，并進(jìn)行相關(guān)研究多年，且MSCs療法治療多種疾病作用及機(jī)制亦得到驗(yàn)證，然而在追求MSCs療效最優(yōu)化且具較高安全性的同時(shí)，控制其適宜注射量、采取恰當(dāng)?shù)囊浦卜绞郊斑_(dá)到優(yōu)化療效的途徑仍是現(xiàn)在亟需廣大研究者解決的問(wèn)題。

4.1MSCs細(xì)胞注射量及注射途徑 目前，MSCs移植治療OP還多停留于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，MSCs細(xì)胞治療量暫無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，研究者多采用1～5×106個(gè)/kg的細(xì)胞數(shù)[25]，且注射途徑也未統(tǒng)一，多數(shù)研究者采用尾靜脈注射的方式。因尾靜脈注射會(huì)造成MSCs細(xì)胞的丟失，并會(huì)促進(jìn)MSCs向肺臟歸巢，故Shuo H等[26]采用心臟注射方式。Taketoshi K等[27]采用局部注射方法，直接向骨折區(qū)域注射MSCs，認(rèn)為可以提高M(jìn)SCs的歸巢數(shù)量，但也有研究認(rèn)為無(wú)論是系統(tǒng)移植還是局部移植，MSCs細(xì)胞歸巢的效率并沒(méi)有差別。

4.2MSCs體外培養(yǎng)時(shí)間及代數(shù)對(duì)療效的影響 雖然MSCs存在于機(jī)體大部分組織中，但是比例卻非常低，因此體外培養(yǎng)擴(kuò)增是MSCs治療的前期基礎(chǔ)。而目前尚未對(duì)MSCs細(xì)胞代數(shù)作統(tǒng)一規(guī)定，研究顯示隨著MSCs體外培養(yǎng)時(shí)間的增加，會(huì)弱化MSCs的歸巢能力。Rombouts等[28]通過(guò)系統(tǒng)移植未在體外培養(yǎng)的EGFP-MSCs至清髓的C57BL/6小鼠中，24 h后發(fā)現(xiàn)有55%～65%MSCs能夠歸巢至骨髓中，說(shuō)明原代MSCs具有較高的歸巢能力；研究者又分別移植了體外培養(yǎng)24 h和48 h的MSCs至清髓的C57/BL小鼠中，結(jié)果顯示體外培養(yǎng)24 h的MSCs導(dǎo)致MSCs歸巢能力降低至10%，而將MSCs體外培養(yǎng)48 h后，未能在骨髓等造血組織中發(fā)現(xiàn)MSCs，表明MSCs完全丟失了歸巢能力。James DK等[29]取新生6 d小鼠骨髓中MSCs，進(jìn)行體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，應(yīng)用茜素紅染色計(jì)算鈣沉積面積比，結(jié)果顯示P1 MSCs誘導(dǎo)的鈣沉積面積比為（46.7±9.0），胞外鈣含量為（0.27±0.06），而到P6時(shí)，MSCs誘導(dǎo)的鈣沉積面積比降低至（31.1±10.1），胞外鈣含量為（0.2±0.04），表明隨著MSCs體外培養(yǎng)代數(shù)的增加，其成骨能力會(huì)逐漸減弱，但這僅局限于新生小鼠的MSCs，研究者發(fā)現(xiàn)6周和1 a老年的小鼠MSCs并不因?yàn)榇鷶?shù)的增加而導(dǎo)致成骨能力降低，這可能與MSCs異質(zhì)性及體外增殖能力有關(guān)。

4.3MSCs細(xì)胞歸巢數(shù)量 盡管研究證實(shí)自體或異體MSCs系統(tǒng)移植均可改善OP，但多項(xiàng)研究表明移植后由于MSCs歸巢數(shù)量有限及駐留時(shí)長(zhǎng)問(wèn)題，導(dǎo)致MSCs治療OP有效率下降。Shuo H等[26]進(jìn)行系統(tǒng)移植MSC，運(yùn)用小動(dòng)物活體成像技術(shù)觀察移植MSCs后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞歸巢數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植1 h后，MSCs基本聚集在肺臟，移植5～8 d后，在骨折區(qū)僅有微弱的MSCs熒光信號(hào)，且持續(xù)1～3 d后消失。RE Ploemacher課題組[27]考察體外培養(yǎng)不同時(shí)間后MSCs歸巢能力，結(jié)果顯示隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的增加，MSCs歸巢能力逐漸減弱。針對(duì)這些問(wèn)題，研究人員也在不斷的思考，嘗試各種方法以試圖解決這些阻礙。如對(duì)MSCs進(jìn)行基因修飾，由于CXCR4/SDF-1軸被認(rèn)為是MSCs歸巢過(guò)程最為重要的通路，而MSCs表達(dá)CXCR4水平并不高，因此通過(guò)轉(zhuǎn)染等技術(shù)使得CXCR4在MSCs中過(guò)表達(dá)，以此提高M(jìn)SCs歸巢能力。諸多研究者利用基因修飾技術(shù)進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)，改造MSCs歸巢相關(guān)的基因，如整合素a4等，希冀提高M(jìn)SCs歸巢效率，但與此同時(shí)，也帶來(lái)了免疫反應(yīng)及MSCs增殖能力減弱等問(wèn)題。

5 小結(jié)

自2004年以來(lái)，與MSCs相關(guān)的臨床試驗(yàn)項(xiàng)目數(shù)量在全球范圍內(nèi)明顯增加，表明MSCs治療方案具有廣泛的應(yīng)用前景，雖然目前仍有許多問(wèn)題亟需研究者解決，包括如何獲得純度較高的MSCs；如何提高M(jìn)SCs細(xì)胞歸巢數(shù)量，選取合適細(xì)胞代數(shù)、細(xì)胞數(shù)量及治療時(shí)間窗等，但在骨組織再生領(lǐng)域中，MSCs移植治療可作為新策略實(shí)現(xiàn)骨組織再生和修復(fù)。正如前所述，MSCs移植后可直接增加骨內(nèi)MSCs總數(shù)量，提高成骨分化，更為重要的是可分泌多種趨化因子，這些趨化因子對(duì)于OP引發(fā)的骨折具有重要的治療意義，且MSCs治療相對(duì)傳統(tǒng)藥物治療具有治療時(shí)間短、方式便捷等優(yōu)勢(shì)，因此隨著研究者對(duì)MSCs認(rèn)識(shí)的不斷深入，目前未釋疑問(wèn)題將逐步解決，該治療方法因其具有傳統(tǒng)治療方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)，終將應(yīng)用于OP的臨床治療。

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