HPLC法測(cè)定不同采收期承德產(chǎn)山里紅葉牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量

杜義龍，李明臣，王領(lǐng)弟，李艷榮，潘海峰

（河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

HPLC法測(cè)定不同采收期承德產(chǎn)山里紅葉牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量

杜義龍，李明臣，王領(lǐng)弟，李艷榮，潘海峰△

（河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

目的：采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定承德地區(qū)不同采收期山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量。方法：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5?m）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液-乙腈-四氫呋喃溶液，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：340nm；流速1.0ml/min；柱溫30℃。結(jié)果：牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的線性范圍是0.001-0.16mg/ml；平均加樣回收率為100.2%（RSD=2.8%）；5-10月承德不同產(chǎn)地山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量均值分別為灤平縣3.00mg/g，雙橋區(qū)4.00mg/g，承德縣2.84mg/g。結(jié)論：承德地區(qū)山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量在8月份達(dá)到最高，為最佳采收期，以承德市雙橋區(qū)產(chǎn)的山里紅葉含量最高，為最佳產(chǎn)地。

山里紅葉；牡荊素-4″-O-葡萄糖苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

山里紅葉為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.var.major N. E. Br.的干燥葉，主產(chǎn)于河北承德、山東和遼寧等地［1-3］。山里紅葉藥材化學(xué)成分復(fù)雜，主要為黃酮類和有機(jī)酸類［1］?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，山里紅葉具有降血脂、抑制血小板聚集、改善冠脈流量保護(hù)心肌和清除自由基、抗氧化等作用［4-7］。黃酮類化合物是山里紅葉生理活性的主要成分，包括牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素等，其中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷在山里紅葉中含量較高［8］。本研究采用HPLC法測(cè)定了承德地區(qū)三個(gè)產(chǎn)地不同月份山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量，以期找到牡荊素-4″-O-葡萄糖苷含量變化的規(guī)律，從而確定針對(duì)牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的最佳采集時(shí)間，為承德山里紅葉資源的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent1200 Series液相色譜儀（G1322A在線脫氣機(jī)、G1311A二元泵、G1316A柱溫箱、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1315D二極管陣列檢測(cè)器）；Agilent Chemstation色譜工作站；KQ-700型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率700W，頻率40KHz），梅特勒-托利多AG245電子分析天平，HC-2062高速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）。

1.2 藥材 山里紅葉藥材均由河北民族師范學(xué)院董建新教授鑒定為薔薇科山楂屬植物山里紅的干燥葉，藥材分別于2011年6月、7月、8月、9月、10月采自承德市灤平縣、雙橋區(qū)和承德縣。對(duì)照品：牡荊素-4″-O-葡萄糖苷（批號(hào)，A0513），成都曼思特生物科技有限公司，純度＞99%。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）-四氫呋喃（C），梯度洗脫方式：0-20-30-40-50min，A（90%-84%-84%-78%-74%）、B（8%-14%-14%-20%-24%）、C（2%-2%-2%-2%-2%）；色譜柱：Agilent ZORBAX SBC18（4.6mm×250mm，5?m）；檢測(cè)波長(zhǎng)：340nm；流速1.0ml/ min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10?l。山里紅葉牡荊素-4″-O-葡萄糖苷色譜圖見(jiàn)附圖。

2.2 供試品溶液的制備 將山里紅葉去除雜質(zhì)后，65℃干燥至恒重（約2h），粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80目篩；取山里紅粉末0.5g，置于50ml具塞三角瓶中，加入80%甲醇25ml，稱重；超聲提取30min，稱重，補(bǔ)足失量；過(guò)濾，續(xù)濾液過(guò)0.45?m濾膜，即得。

附圖 山里紅葉HPLC色譜圖

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取牡荊素-4″-O-葡萄糖苷適量，置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成每ml含牡荊素-4″-O-葡萄糖苷0.16mg的對(duì)照品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 以對(duì)照品溶液為1號(hào)溶液，采用倍比稀釋法將對(duì)照品溶液制成系列濃度溶液，得2-5號(hào)對(duì)照品溶液。以2.1的色譜條件，分別取上述系列對(duì)照品溶液各10 μ l進(jìn)樣，記錄峰面積。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為A=15875C-9.6313（r=1.0000）。牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的線性范圍是0.001-0.16mg/ml。

2.5 精密度試驗(yàn) 按2.2的方法制備供試液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.1的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，峰面積RSD＜0.5%（n=6）。表明儀器的精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批山里紅葉藥材，按2.2的方法制備6份供試品溶液，按2.1的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，峰面積RSD＜1.5%（n=6）。表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，峰面積RSD＜3%（n=6）。表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知牡荊素-4″-O-葡萄糖苷含量的山里紅葉6份，每份0.25g，加入牡荊素-4″-O-葡萄糖苷適量，按2.2的方法制備供試品溶液，按2.1的色譜條件測(cè)定峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量，計(jì)算平均回收率和RSD。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 樣品含量測(cè)定 取各批次山里紅葉樣品，按2.2的方法制備供試品溶液各3份，按2.1的色譜條件測(cè)定分析，通過(guò)回歸方程計(jì)算山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表2：承德地區(qū)三個(gè)產(chǎn)地的山里紅葉中，8月份牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量最高，在8月份達(dá)到最高值后逐月減少；三個(gè)產(chǎn)地中以承德市雙橋區(qū)山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量最高。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 不同采收期藥材中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3 討論

研究不同采收時(shí)期藥材有效成分含量的變化，對(duì)確定目標(biāo)產(chǎn)物最佳采收期具有重要意義。本研究對(duì)承德地區(qū)6月到10月山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果顯示8月份牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量最高，為最佳采收期；三個(gè)產(chǎn)地中，以承德市雙橋區(qū)產(chǎn)山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量最高，為最佳產(chǎn)地。

［1］陳忠，盧樹(shù)杰，張維庫(kù)，等.HPLC測(cè)定山楂葉總黃酮中牡荊素鼠李糖苷含量［J］.中成藥，2009，31（10）：1615-1616.

［2］郝近大.實(shí)用中藥材經(jīng)驗(yàn)鑒定［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001.40-44.

［3］張文潔，楊英，張輝.山楂葉提取物對(duì)高血脂大鼠的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2008，35（2）：307-308.

［4］葉希韻，張隆，張靜，等.山楂葉總黃酮對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺血缺氧損傷的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2005，22（3）：202-204.

［5］蔡久英.山楂葉湯和銀杏葉片對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者血脂載脂蛋白和血小板聚集功能影響的比較［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，1999，6（8）：344-346.

［6］于秋紅，黃沛力，張淑華，等.山楂葉提取物抗氧化作用［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2006，22（4）：463-464.

［7］王領(lǐng)弟，李艷榮，張曉峰，等.山楂葉指紋圖譜研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（19）：74-78.（收稿日期：2015-10-12）

CONTENT DETERMINATION OF VITEXIN -4”-O-GLUCOSIDE IN CHENGDE HAWTHORN LEAF AT DIFFERENT COLLECTING TIME BY HPLC

DU Yi-long， LI Ming-chen， WANG Ling-di， et al
（Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine， Institute of Chinese Materia Medica，Chengde Medical College， Hebei Chengde 067000， China）

Objective: To determine the content of vitexin -4”-O-glucoside in Chengde hawthorn leaf at different collecting time by HPLC. Methods: The separation was carried out in Agilent ZORBAX SB-C18column （4.6mm×250mm，5μm） with 0.1% formic acid， acetonitrile and tetrahydrofuran as mobile phase in gradient elution model （detection wave: 340nm， fl ow rate:1.0ml/min， column temperature:30℃）. Results: The linear range of vitexin -4”-O-glucoside was 0.001-0.16 mg/ml. The average recovery rate was 100.2% （RSD=2.8%）. The average content of vitexin -4”-O-glucoside in Chengde hawthorn leaf from May to October was respectively 3.00mg/g from Luanping County， 4.00mg/g from Shuangqiao District and 2.84mg/g from Chengde County. Conclusions: According to the content of vitexin -4”-O-glucoside， August is the optimum collecting time and Shuangqiao District is the optimal producing area.

Hawthorn leaf； Vitexin -4”-O-glucoside； HPLC； Content determination

△

R284.1

A

1004-6879（2016）02-099-03