山羊痘病毒檢測方法研究進展

張瑩輝，姚文生，康 凱，王團結(jié)，薛 麒，吳思捷，趙俊杰，印春生

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

山羊痘病毒(goat pox virus，GTPV)屬于痘病毒科(poxviridae)脊椎動物痘病毒亞科(poxvirinae)山羊痘病毒屬(Capripoxvirus)，可感染綿羊和山羊引起惡性痘病，包括肯尼亞綿羊痘、山羊痘、印度羊皮炎、北非綿羊和山羊的石痘等，其中細毛羊、羔羊最易感山羊痘病毒。病羊呈現(xiàn)特征性的臨床表現(xiàn)：發(fā)熱、無毛或少毛部位皮膚黏膜發(fā)生丘疹和皰疹、淋巴結(jié)腫大、皮膚水腫、病羊消瘦、產(chǎn)乳量大幅度降低，嚴重降低了山羊的生產(chǎn)性能及羊毛和羊皮制品的質(zhì)量，是所有動物痘病中最為嚴重的一種，成年發(fā)病羊死亡率可高達42.06%，病羔羊死亡率高達100%，一旦發(fā)病可造成巨大經(jīng)濟損失[1-3]。本病在世界許多地區(qū)已有發(fā)生，特別是非洲北部、中東和亞洲的部分國家流行較為嚴重，我國周邊國家如尼泊爾、俄羅斯、印度等也均有流行。而我國境內(nèi)的江蘇、陜西、福建以及四川、云南、廣西等地也有該病的發(fā)生，主要是由于養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展過程中，品種的引進、流動引起了山羊痘的傳播和流行。此病為OIE規(guī)定的A類疾病，我國將其列為國家I類動物疫病[4-6]。此外山羊痘病毒還可感染人，重慶市彭水縣發(fā)生一例具有特異性病原學診斷依據(jù)人感染羊痘病例，其他地區(qū)還發(fā)生過幾例人感染羊痘的報道，所有病例均有與病羊的接觸史，為接觸性感染，因此山羊痘病毒檢測方法的研究具有重要的公共衛(wèi)生學意義[7]。為此，就近年來山羊痘病毒檢測方法研究進展進行了綜述，以為其確診提供參考。

1　病原學檢測

1.1病毒的分離鑒定病毒的分離鑒定可采集發(fā)病羊皮膚和黏膜的痘疹和痘斑以及鼻腔分泌物、發(fā)熱期血液和肺部病變組織、淋巴結(jié)等作為病料[8]。山羊痘病毒培養(yǎng)多選用原代或次代羔羊睪丸細胞或羔羊腎細胞，除這兩種細胞較為敏感外，犢牛睪丸細胞也具有同樣的敏感性，一些分離株也可在Vero、BHK-21及雞胚絨毛尿囊膜細胞上生長。

劉棋等[9]使用疑似病羊的皮膚丘疹、水泡或膿皰組織的病毒懸液接種于初生羔羊睪丸細胞觀察到明顯的細胞病變：接種第2天大部分細胞變圓、變細，細胞漿內(nèi)有可疑顆粒及空泡，感染單層細胞在5天內(nèi)死亡；而接種于9～10日齡雞胚絨毛尿囊膜，未見痘斑，傳3代均無異常變化。切環(huán)[10]取內(nèi)蒙古病羊的皮膚痘疹和水皰作病料樣品，分別接種BHK-21傳代細胞和10日齡SPF雞胚，BHK-21細胞出現(xiàn)了明顯的、規(guī)律的細胞病變：單層BHK-21細胞在24 h后開始收縮、聚集，于48 h后病變細胞開始拉網(wǎng)，出現(xiàn)空泡，至72 h細胞全部脫落死亡。接種病料樣品的10日齡SPF雞胚，在120 h后剖檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞胚胚體出血、充血，絨毛尿囊膜增厚，接種部位具有明顯的痘斑。周碧君等[11]取貴州省發(fā)生的疑似山羊痘病例山羊的皮膚皰疹和水疤作病料，接種BHK-21傳代細胞盲傳3代后，出現(xiàn)了明顯的、規(guī)律的細胞病變。用該BHK-21細胞培養(yǎng)物接種9日齡雞胚絨毛尿囊膜，隨著傳代次數(shù)的增加，痘斑病變的出現(xiàn)率有所上升。李有文等[12]將某制藥廠提供的山羊痘病毒毒株接種于經(jīng)過三種不同處理的綿羊睪丸細胞，出現(xiàn)了不同的細胞病變，其中接種于原代綿羊睪丸細胞，在病變初期細胞圓縮或變長，中期成片成葡萄串狀，后期為長梭細胞與葡萄串狀交織相連；而接種于傳代綿羊睪丸細胞，病變初期細胞變長，中期細胞交織拉網(wǎng)，后期細胞間質(zhì)變大、脫落；接種于凍存的綿羊睪丸細胞，細胞在病變初期變窄、變長，中期長細胞交織拉網(wǎng)，后期細胞間質(zhì)變大、脫落。

1.2病毒的電鏡觀察周碧君等[4]采集了貴州兩個山羊痘疫區(qū)的病死羊病料，經(jīng)過雞胚絨毛尿囊膜細胞和BHK-21細胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)所得材料制成切片，經(jīng)硝酸鉛和醋酸鉛雙重染色后對病毒粒子進行了觀察：初期的病毒粒子呈卵圓形，大小約為250 nm～350 nm，被膜完整或不完整，被膜內(nèi)所含電子密度較高而均勻的物質(zhì)所占比例大，另有電子密度中等而均勻的物質(zhì)分布在電子密度較高物質(zhì)的四周；中期的病毒粒子形狀和大小類似于初期病毒，但電子密度高的物質(zhì)所占比例較小，病毒粒子直徑較小，可見致密的類核體；完全成熟的病毒粒子致密，多呈卵圓形，電子密度不均勻，大小約為(150 nm～180 nm)×(220 nm～280 nm)，中央有呈啞鈴形的核酸芯髓和兩個功能不清的側(cè)小體。

2　血清學檢測方法

2.1病毒中和試驗病毒中和試驗是檢測羊痘病毒特異性較強的血清學診斷方法，但羊痘感染后主要以細胞免疫為主，感染動物僅產(chǎn)生低水平的中和抗體，導致病毒中和試驗的敏感性不高[13-14]。

2.2免疫瓊脂擴散試驗周碧君等[11]將盲傳4代后感染BHK-21細胞培養(yǎng)物反復凍融3次與山羊痘標準陽性血清做瓊脂擴散試驗，能夠出現(xiàn)白色沉淀線，而與正常對照細胞沉淀抗原和PBS不出現(xiàn)沉淀線。王開功等[15]采用瓊脂擴散試驗對患病山羊皮膚黏膜痘疹和感染細胞培養(yǎng)物進行檢查，發(fā)現(xiàn)對于病毒粒子含量較高的病料，其陽性檢出率亦較低，對感染細胞培養(yǎng)物也難以直接檢出病毒抗原。

2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗王芳等[16]將人工合成密碼子優(yōu)化的GPV p32基因，在大腸桿菌中進行表達，以純化的重組p32-opti蛋白作為ELISA包被抗原，建立了間接ELISA抗體檢測方法。該ELISA檢測方法具有良好的特異性、敏感性和重復性，可用于GPV感染的流行病學調(diào)查以及疫苗接種動物的抗體水平監(jiān)測。

2.4免疫熒光抗體試驗劉忠偉等[8]使用異硫氰酸熒光標記兔抗羊痘IgG，并以羊痘熒光抗體檢測羊痘皮膚痘疹切片和感染細胞抹片，發(fā)現(xiàn)了特異性黃綠色熒光。徐春志等[17]制備了山羊痘直接熒光抗體，檢測感染細胞中的山羊痘病毒抗原，可檢測出BHK-21感染細胞中病毒抗體原，且此熒光能夠被山羊痘標準陽性血清特異性抑制，用制備的熒光抗體檢測感染山羊痘病毒標準弱毒株、疫苗株及分離株的BHK-21細胞抹片，結(jié)果均為陽性，檢測正常細胞為陰性。

2.5血凝試驗王開功等[18]采用兔抗山羊痘病毒IgG致敏綿羊紅細胞建立的反向間接血凝試驗，對山羊痘病毒抗原有較高特異性和敏感性，與其它動物疾病病毒抗原不發(fā)生交叉反應。對現(xiàn)場采集的山羊痘待檢抗原的檢測結(jié)果表明其敏感性比AGP高，該反向間接血凝試劑可應用于獸醫(yī)臨床診斷(血清學監(jiān)測與流行病學調(diào)查)也可作為山羊痘病毒分離培養(yǎng)的血清學檢測指標，是一種靈敏、簡單、快速的診斷方法。

3　分子生物學檢測方法

3.1PCR檢測方法PCR又叫聚合酶鏈式反應，是體外酶促合成特異性DNA的一種方法，它能夠使目的DNA迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便等特點，可用于基因分離、克隆及核酸序列分析等研究。山羊痘病毒屬于雙股DNA病毒，更適于PCR檢測[19]。徐春志等[17]比較了Trizol法和SDS-蛋白酶K法提取山羊痘病毒DNA后，根據(jù)山羊痘病毒P32基因設計了引物，建立了可用于山羊痘臨床診斷的特異性強、可靠性好、靈敏度高的PCR方法，該方法可檢測出山羊痘病毒Y株、貴州現(xiàn)場分離毒LD株和QL株的細胞感染物以及山羊痘疹樣本中病毒DNA。張志成等[20]基于GenBank上發(fā)表的羊痘病毒全基因序列，設計合成了一對引物，建立了檢測羊痘病毒的PCR方法及其試劑盒。郭巍等[19]人基于山羊痘病毒P32特異性基因和α-微管蛋白特異性基因，設計了2對引物，擴增到了P32基因與GenBank上收錄序列同源性達到98%，表明了該方法具有很好的特異性和準確性。

3.2PCR-酶切檢測方法馮迎春等[21]針對山羊痘病毒T3A/T3C基因設計了1對特異引物，并以其DNA為模板進行PCR擴增，連接到pMD18載體進行序列測定，其結(jié)果與已報道的山羊痘病毒相應序列進行比對，其同源性高達98%。同時利用產(chǎn)物中的特有酶切位點EcpR V(89位)進行進一步的酶切分析，建立了特異的PCR/酶切檢測方法，結(jié)果表明該引物特異性好，敏感性強，可應用于山羊痘病毒感染的臨床診斷。

3.3熒光定量PCR檢測方法熒光定量PCR是20世紀90年代由美國某生物公司率先推出的一種新型的核算定量技術(shù)，相比普通PCR，它具有較強的直觀性，特異性強、敏感性好、精確性高，從而被廣泛用于疾病診斷、基因檢測和免疫分析等領(lǐng)域[22-23]。張倩等[24]針對山羊痘病毒基因組P32基因設計了1對特異性引物，構(gòu)建出穩(wěn)定的標準品，來替代定量測定山羊痘疫苗半成品中的核酸。該標準品敏感性和特異性高、穩(wěn)定性好，可用于山羊痘核酸的定量測定。實時熒光定量PCR通過在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實施監(jiān)測PCR的全過程，最后建立標準曲線對模板進行定量分析[25]，是一種靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性強的PCR方法，可廣泛用于分子生物學和醫(yī)學等領(lǐng)域的研究[26]。目前在獸醫(yī)領(lǐng)域，RQ-PCR應用于病原體分子檢測、基因表達定量分析、單核苷酸多態(tài)性及其突變分析等[27]。安維雪等[28]針對山羊痘病毒參考毒株A29L基因序列,設計了1對特異性引物以及2條TaqMan探針,同時制備重組質(zhì)粒標準品，建立了羊痘病毒實時熒光定量PCR檢測方法,該診斷方法與4種非羊痘病毒不發(fā)生交叉反應,其重復性試驗變異系數(shù)均低于2%，具有良好的特異性,靈敏性、穩(wěn)定性。姚俊等[29]針對山羊痘病毒gp063基因DNA序列，設計了1條PCR引物和1支TaqMan探針，同時制備了含有靶DNA序列的PEASY-T1重組質(zhì)粒標準品，經(jīng)過反應條件的優(yōu)化建立了山羊痘病毒Taqman法實時熒光定量PCR檢測方法，經(jīng)檢測該方法具有較高的靈敏性、特異性且安全、快速，適用于山羊痘病毒的早期檢測。趙文華等[30]基于小反芻獸疫病毒的N基因以及山羊痘病毒的ITR基因，分別設計合成了2套特異性引物及探針，分別用5’FAM-TAMRA3’及5’JOE-Eclipse3’標記后建立了N-ITR基因的二聯(lián)探針實時熒光定量RT-PCR，該方法特異性好，敏感度高，無交叉反應，且可實現(xiàn)兩種病毒的快速同步檢測。程振濤等[31]選取了位于山羊痘病毒基因組gp064區(qū)域的基因片段，設計合成了1對PCR引物和一條TapMan-MGB探針，建立了PQ-PCR和標準曲線，該檢測方法可用于臨床樣本、人工感染動物試驗組織以及三帶喙庫蚊體內(nèi)山羊痘病毒的定量檢測，特異性高、敏感性好、臨床應用性強。

3.4雙重PCR檢測方法在PCR技術(shù)不斷發(fā)展過程中，產(chǎn)生了多重PCR技術(shù)，能夠一次性鑒別多種疾病，在疫病的診斷上有著非常大的優(yōu)勢[32]。向智龍等[33]基于山羊痘病毒ITR和羊口瘡病毒H2L基因片段，合成兩對引物，以山羊痘病毒和羊痘瘡病毒的核酸混合物作為模板，建立了快速鑒別檢測兩種病毒的雙重PCR方法，該方法特異性強、敏感性高、快速簡便，可用于山羊痘病毒和羊口瘡病毒的聯(lián)合檢測和鑒別診斷。肖雯等[34]針對綿羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒的基因組序列，分別設計了2對特異性引物，經(jīng)優(yōu)化條件，建立了快速鑒別檢測SPPV和GTPV的雙重PCR方法，該方法特異性試驗中，未對牛疙瘩皮膚病病毒、犬細小病毒、大腸桿菌O157、沙門氏菌等有特異性擴增，同時具有較好的靈敏度。

4　存在的問題與展望

綜上所述，要防治山羊痘的發(fā)生和流行，其早期的診斷非常重要。在山羊痘病毒的檢測中，瓊脂擴散實驗操作簡便，但其敏感性不高。ELISA方法具有較高的靈敏性和特異性，是世界衛(wèi)生組織推薦的診斷方法之一。近年來我國學者研究的側(cè)重點主要是PCR方法，此方法多基于P32基因、ITR基因、A29L基因、末端反向重復序列等設計引物，具有靈敏度高、特異性好、快速等優(yōu)點，其中以熒光定量PCR方法最好，可作為實驗室診斷的有效方法。但是鑒于此方法對儀器設備、實驗操作人員以及實驗的條件等均由有較高的要求，在檢測成本有限的情況下推廣此方法有較高的難度。

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