納米技術(shù)提高抗菌藥物治療胞內(nèi)菌感染的研究進(jìn)展

周凱翔，李 超，王曉芳，謝書宇*

(1.國家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室(HZAU)/國家獸藥安全評價實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定 071000)

目前，專性和兼性胞內(nèi)病原菌(立克次體、衣原體、金黃色葡萄球菌、胞內(nèi)勞森菌、布氏桿菌、沙門氏菌、結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌)能通過自身特定的生存策略或者毒素透化細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，引起慢性和持續(xù)性感染，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在世界范圍內(nèi)每年約有5000萬頭牛感染結(jié)核，年均直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30億美元[1]。奶牛乳腺炎在我國的發(fā)病率為20%～70%左右，其中隱性乳腺炎的發(fā)病率高達(dá)70%，以金黃色葡萄球菌奶牛乳腺炎的發(fā)病率和危害最為嚴(yán)重。據(jù)權(quán)威統(tǒng)計(jì)，胞內(nèi)勞森菌引起的豬增生性腸炎(PPE)在美國每年造成的損失高達(dá)2000萬美元。

常規(guī)抗菌藥物因不能有效進(jìn)入宿主細(xì)胞、胞內(nèi)蓄積能力弱、活性降低或喪失等原因在胞內(nèi)感染靶位達(dá)不到有效的治療濃度和時間[2-4]，造成胞內(nèi)感染性疾病治療面臨具大的難題和挑戰(zhàn)。且長時間的亞治療劑量還易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。因此，胞內(nèi)感染疾病的治療難題成為了藥物學(xué)和獸醫(yī)工作者的研究焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。近些年來，研究發(fā)現(xiàn)納米抗菌藥物可以通過淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)和炎性部位毛細(xì)血管的滲透增強(qiáng)作用輸送到感染的靶部位和靶細(xì)胞[5]。納米藥物到達(dá)感染部位后，可以通過膜融合、內(nèi)吞、膜裂縫通道等多種途徑和方式被攝入感染細(xì)胞[6-7]，從而提高抗菌藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度和維持有效濃度的時間，顯著提高了胞內(nèi)感染的治療效果，為突破畜禽胞內(nèi)感染性疾病的治療難題提供新的途徑。本文就納米抗菌藥物治療胞內(nèi)感染性疾病的有效性、優(yōu)效性、治療研究進(jìn)展和面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了系統(tǒng)的總結(jié)和分析，以便為未來的研究提供思路，加快納米技術(shù)在胞內(nèi)感染性疾病治療的應(yīng)用研究進(jìn)程，為畜禽胞內(nèi)菌感染性疾病治療提供高效的獸藥產(chǎn)品。

1　胞內(nèi)感染性疾病治療面臨的難題

專性和兼性胞內(nèi)菌能通過特定的侵襲機(jī)制或者毒素透化細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。如圖1所示，金黃色葡萄球菌可以先通過β-毒素將細(xì)胞膜外層親水性磷酸膽堿水解暴露出疏水性神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)，再由δ-毒素透化疏水部分從而穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞；沙門氏菌在被細(xì)胞吞噬體吞噬后，其可以在吞噬小泡中存活下來，從而在細(xì)胞內(nèi)定居。此外，某些專性或兼性胞內(nèi)病原菌產(chǎn)生細(xì)菌毒素和靶向于宿主細(xì)胞膜的表面蛋白，或者合成效應(yīng)蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞核并改變“組蛋白密碼”，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞DNA甲基化模式的改變，引起宿主細(xì)胞的表觀遺傳變化和基因表達(dá)模式的改變，抑制抗菌免疫反應(yīng)并為細(xì)菌定植、增長、傳播創(chuàng)造有利條件[8]，引起急性和持續(xù)性感染。

圖1　金葡菌入胞機(jī)制Fig 1　The entrance cell mechanism of S.aureus

目前，獸醫(yī)臨床上胞內(nèi)菌感染性疾病的治療主要依賴于抗生素，而抗生素要起到抗菌效果首要前提是在胞內(nèi)感染靶位達(dá)到抑菌濃度，但常規(guī)的抗菌藥多難以透過細(xì)胞膜屏障進(jìn)入細(xì)胞起到高效的抑菌或殺菌作用。例如，β-內(nèi)酰胺類因其抗菌譜廣和抗菌活性強(qiáng)是獸藥臨床細(xì)菌感染首選藥物之一，但其多數(shù)成員與細(xì)胞膜的親和力不高，不能有效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且易被胞內(nèi)溶酶體酶所降解。又如，四環(huán)素類透膜能力差，在胞內(nèi)濃度往往達(dá)不到抑菌水平，不僅無法起到有效的治療作用，而且長時間的亞治療劑量還極易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生。氨基糖苷類抗生素分子極性強(qiáng)，透膜速率非常緩慢，進(jìn)入細(xì)胞后也主要分布在溶酶體，無法充分的發(fā)揮藥理學(xué)作用。研究報道，氨基糖苷類特別是慶大霉素對金葡菌的SCVs表型幾乎無效[9]。盡管，氟喹諾酮類抗菌藥物對細(xì)胞膜有很強(qiáng)的滲透性且跨膜速率較快，但當(dāng)胞外的濃度比胞內(nèi)的濃度低時，可在有機(jī)陰離子載體的作用下快速被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，導(dǎo)致其在胞內(nèi)不能有效蓄積而達(dá)不到有效抑菌時間[10]，常造成臨床治療的失敗。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素多與生物膜的親和力較高，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的速率和效率優(yōu)于大多數(shù)抗菌藥物，常被用來治療胞內(nèi)勞森菌等畜禽胞內(nèi)菌感染性疾病，但其在胞內(nèi)蓄積性能較弱，并且在酸性條件活性較差或變異較大。由此可見，多數(shù)常規(guī)抗菌藥物不能有效和高效的治療畜禽胞內(nèi)感染性疾病，從而導(dǎo)致胞內(nèi)菌感染性疾病嚴(yán)重危害了畜牧業(yè)的健康發(fā)展。

因此，如何利用制劑技術(shù)提高抗菌藥物對被感染細(xì)胞的傳遞效率、胞內(nèi)蓄積能力、維持和改善細(xì)胞內(nèi)藥物的活性是解決畜禽胞內(nèi)感染性疾病治療難題的有效策略。

2　納米抗菌藥物治療胞內(nèi)感染的有效性和優(yōu)效性

納米載藥技術(shù)是指將藥物溶解、包裹于固體脂質(zhì)基質(zhì)、高分子等載體材料中形成納米粒，常用載體有相嵌段共聚物、聚酯類、聚氰基丙烯酸烷酯類、磷脂、長鏈脂肪酸、三酰甘油酯、蜂蠟和膽固醇等。常見的納米載藥系統(tǒng)包括固體脂質(zhì)納米(SLNs)、脂質(zhì)體、聚合物納米、樹狀大分子和囊泡等。將藥物制成納米粒后，體內(nèi)過程依賴于載體的理化特性、粒徑、電位等理化性質(zhì)，所以藥物經(jīng)納米載藥系統(tǒng)搭載后與機(jī)體有良好的親和性，易于透過機(jī)體的生物屏障，在胞內(nèi)菌的治療中具有優(yōu)越的發(fā)展前景。大量研究表明，上述納米載藥系統(tǒng)可以改善藥物對機(jī)體生物膜屏障的透過能力，提高藥物在胞內(nèi)的蓄積能力，延長藥物的作用時間。研究報道(表1)，利用明膠納米系統(tǒng)和納米乳化技術(shù)分別延長了利福平和多西環(huán)素、氟苯尼考有效血藥濃度的維持時間[11]和體外釋放時間[12]。Pothayee等制備的聚合物膠束顯著增強(qiáng)了慶大霉素對胞內(nèi)布魯氏菌的抗菌活性[13]。Zaki等制備的殼聚糖納米粒有效提高了頭孢曲松鈉抗胞內(nèi)鼠傷寒沙門氏菌的效力[14]。利用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)納米來提高慶大霉素的胞內(nèi)濃度也有報道[15]。

表1　納米技術(shù)提高抗菌藥物性能的研究實(shí)例Tab 1　The examples of nanotechnologies improving the effect of antimicrobial

3　納米抗菌藥物在畜禽胞內(nèi)感染性疾病治療的研究

3.1結(jié)核分枝桿菌病的治療眾所周知，結(jié)核分枝桿菌感染的治療一直以來在醫(yī)學(xué)方面都是一項(xiàng)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致的結(jié)核病是以肉芽腫的發(fā)展為特點(diǎn)的慢性傳染病，而且是牛結(jié)核病的主要病原菌。2012年結(jié)核病被列入貧困國家死亡原因的前十，為這些國家的經(jīng)濟(jì)與醫(yī)療保障系統(tǒng)施加了巨大的壓力[16]。結(jié)核分枝桿菌不僅具有良好的細(xì)胞適應(yīng)性，且在進(jìn)化過程中學(xué)會了通過抵御宿主環(huán)境去平衡宿主的免疫防御策略而生存繁殖[17]。如表2所示，目前研究的用于治療肺結(jié)核的納米藥物，其易被內(nèi)化，優(yōu)先進(jìn)入細(xì)胞組織與器官，同時具有較高的穩(wěn)定性與生物利用度，比如PLGA納米可提高抗結(jié)核藥物(利福平、吡嗪酰胺、異煙肼)在肺和感染肺泡巨噬細(xì)胞中的生物利用度[18]。Gaspar等制備的利福布丁-SLNs延長了利福布丁在THP1細(xì)胞內(nèi)對結(jié)核桿菌的抗菌時間[19]。與莫西殺星相比莫西殺星聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)納米粒在巨噬細(xì)胞的蓄積能力提高了3倍，蓄積時間延長了6倍[20]。

表2　納米技術(shù)提高抗菌藥物治療結(jié)核分枝桿菌病的研究實(shí)例Tab 2　The examples of nanotechnologies improving effect of antimicrobial treatment infection of M.tuberculosis

3.2金黃色葡萄球菌感染的治療金黃色葡萄球菌既可以侵入專業(yè)吞噬細(xì)胞如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、多核性白細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)，也可侵入非專業(yè)吞噬細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞與上皮細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)[21-22]。侵入細(xì)胞后，金葡菌能通過從吞噬體中逃逸、阻止溶酶體和吞噬體結(jié)合形成吞噬溶酶體、顛覆細(xì)胞自噬等多種特定的生存策略在胞內(nèi)生存并增殖，最后使被感染細(xì)胞裂解，子代從細(xì)胞內(nèi)釋放出來，再次感染其他易感細(xì)胞。且金葡菌的突變表型SCVs表型對多種抗生素和環(huán)境壓力存在耐性，這也是金葡菌感染難以根治的重要原因之一。納米技術(shù)提高抗菌藥物對金葡菌及其耐藥型(MARS)的抗菌效果均有報道(表3)，Rassouli等制備的替米考星納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NLC)和脂質(zhì)核心納米膠囊(LCN)與替米考星比較，對金葡菌的最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)值都降低[23]。也有研究表明利用脂質(zhì)體技術(shù)可以提高達(dá)托霉素和克拉霉素對耐甲氧西林金葡菌(MARS)的抗菌活性[24]。Kalhapure等利用固體脂質(zhì)納米載藥系統(tǒng)延長了鹽酸萬古霉素和克拉唑銀的有效抑菌時間，提高了其對MARS的治療效果[25-26]。

表3　納米技術(shù)提高抗菌藥物治療金葡菌感染的研究實(shí)例Tab 3　The examples of nanotechnologies improving effect of antimicrobial treatment infection of S.aureus

3.3沙門氏菌感染的治療沙門氏菌引起的疾病是細(xì)菌性人畜共患病之一[27]，其在宿主細(xì)胞內(nèi)具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，主要引起畜禽副傷寒，死亡率很高，給畜牧生產(chǎn)造成了巨大的損失。它可以感染多種類型的細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和上皮細(xì)胞[28]，也可進(jìn)入非吞噬細(xì)胞[29]。組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌能夠生存在巨噬細(xì)胞內(nèi)，這表明在宿主細(xì)胞內(nèi)存活是鼠傷寒沙門氏菌致病的一個基本特征[30]。而且在細(xì)胞水平上，沙門氏菌在細(xì)胞內(nèi)的定位面臨著獨(dú)特的困難[31]，因此，目前有必要采取新的治療措施。據(jù)報道，替米考星納米乳、慶大霉素聚合物膠束分別增強(qiáng)了藥物對沙門氏菌抑制作用[32]和在巨噬細(xì)胞內(nèi)的抗菌活性[33]。Xie等制備的恩諾沙星-山萮酸固體脂質(zhì)納米顯著提高了恩諾沙星在小鼠RAW264.7單核巨噬細(xì)胞的蓄積能力，有效延長了抗胞內(nèi)沙門氏菌的抗菌時間[34](表4)。

表4　納米技術(shù)提高抗菌藥物治療沙門氏菌感染的研究實(shí)例Tab 4　The examples of nanotechnologies improving effect of antimicrobial treatment infection of Salmonella

3.4單核細(xì)胞增生性李斯特菌感染的治療李斯特菌包括十個菌株，其中，單核細(xì)胞增生性李斯特菌是唯一能夠引起人類疾病且一種短小的革蘭氏陽性無芽胞桿菌，被列為20世紀(jì)90年代四大食源性疾病致病菌之一，是一種人畜共患病的致病菌，具有潛在的危害性[35-36]。隨著納米藥物的研究不斷深入，如表5所示，有學(xué)者研究表明納米鉑顆粒具有優(yōu)秀的進(jìn)入單核細(xì)胞增生性李斯特菌細(xì)胞內(nèi)的能力[37]。聚氰基丙烯酸異己基酯(PIHCA)納米粒能顯著增強(qiáng)氨芐西林對單核細(xì)胞增生性李斯特菌的抗菌活性[38]。Imbuluzqueta等制備的PLGA納米改善了慶大霉素在胞內(nèi)的積聚能力，從而提高了抗胞內(nèi)李斯特桿菌的能力[39]。也有報道稱青霉素G脂質(zhì)體可以有效抑制李斯特菌在胞內(nèi)的增殖[40]。

表5　納米技術(shù)提高抗菌藥物治療李斯特菌感染研究實(shí)例Tab 5　The examples of nanotechnologies improving effect of antimicrobial treatment infection of L. monocytogenes

4　納米藥物跨膜和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)及其影響因素

4.1納米?？缒ず桶麅?nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的研究納米藥物的傳遞是一個極其多樣復(fù)雜、動態(tài)的過程，涉及方面較多，如內(nèi)吞作用，細(xì)胞內(nèi)交付，生物降解，藥物釋放和胞外分泌等。因此，綜合全面了解納米藥物入胞機(jī)制是發(fā)展納米藥物治療胞內(nèi)菌感染性疾病的前提條件。根據(jù)細(xì)胞種類不同，納米藥物攝入細(xì)胞的途徑主要分為吞噬作用和吞飲兩種，其中巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等專業(yè)吞噬細(xì)胞一般以拉鏈樣和觸發(fā)式的吞噬為主，非專業(yè)吞噬細(xì)胞以巨胞飲、脂伐介導(dǎo)和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的吞飲為主[41]。

納米藥物進(jìn)入細(xì)胞的途徑不同，其在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)方式也不同，大致可分為溶酶體途徑和非溶酶體途徑。據(jù)報道，巨胞飲和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞通常為溶酶體介導(dǎo)的途徑，該途徑中，攜帶藥物的晚期內(nèi)吞體和溶酶體結(jié)合形成吞噬溶酶體，溶酶體將納米材料降解而釋放出藥物；而脂伐介導(dǎo)的內(nèi)吞常為非溶酶體途徑，納米藥物結(jié)合到細(xì)胞膜表面后，沿著細(xì)胞膜移動到不含有溶酶體的脂伐囊泡中，并最終在胞質(zhì)中釋放?？梢姴煌{米藥物跨膜和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑不同，而不同胞內(nèi)菌入胞侵襲機(jī)制和胞內(nèi)定位也不同，深入研究納米藥物跨膜和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，將有助于增加抗菌藥物與胞內(nèi)菌接觸的機(jī)會，提高抗菌的效果。

4.2納米理化性質(zhì)對其胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響臨床上對于納米藥物的理化性質(zhì)的研究主要集中在形態(tài)結(jié)構(gòu)、粒徑、Zeta電位、材料、表面親疏水性等方面。起初認(rèn)為粒徑大小與表面電荷是決定細(xì)胞攝取和胞內(nèi)命運(yùn)的主要因素，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)納米粒正負(fù)電荷的種類、材料的強(qiáng)度、表面親疏水性等都可能會影響其與細(xì)菌細(xì)胞壁的親和力，從而影響其在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，粒徑、電位、表面親疏水性等理化性質(zhì)是納米藥物的重要特性，它們對于納米藥物治療胞內(nèi)感染性疾病的效果起著重要的作用。由于細(xì)胞膜帶負(fù)電荷，通常認(rèn)為帶正電荷的納米藥物與細(xì)胞的親和力更高，但有研究表明帶負(fù)電荷的納米藥物與細(xì)胞膜親和力也很高，如Straubinger等證明隨著表面負(fù)電荷的增加，環(huán)丙沙星脂質(zhì)體和阿奇霉素脂質(zhì)體的胞內(nèi)蓄積能力和對結(jié)核分枝桿菌的抗菌活性顯著提高[42]。Gasparm等試驗(yàn)也表明帶有負(fù)電荷的納米脂質(zhì)體更有利于其被細(xì)胞攝取[43]。Xie等的研究表明同等粒徑的恩諾沙星-山萮酸固體脂質(zhì)納米粒，表面電荷的絕對值越大，其細(xì)胞攝取率也越高，而電荷的絕對值相近的情況下，納米粒徑越大，越易被細(xì)胞攝取[34]?？梢娂{米粒的理化性質(zhì)與其性能有著重要聯(lián)系，對于不同的納米藥物，影響其胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的決定因素也不一樣，因此，建立能高效胞內(nèi)傳遞的納米藥物制備理論，將為胞內(nèi)菌感染的治療提供新模式。

5　納米藥物在胞內(nèi)感染性疾病治療中面臨的挑戰(zhàn)

綜上所述，納米載藥系統(tǒng)搭載的藥物可經(jīng)過多種轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)入細(xì)胞，為解決常規(guī)抗生素治療胞內(nèi)菌感染面臨的難題提供了新思路。但是，納米載藥系統(tǒng)要在獸藥領(lǐng)域推廣開來，還面臨著生產(chǎn)成本、系統(tǒng)自身缺陷、安全性等的多重考驗(yàn)?？紤]到藥物分子的理化性質(zhì)，納米載藥系統(tǒng)有時必須要采用合成高分子載體材料，但達(dá)到理想藥效的同時，生產(chǎn)成本和制備技術(shù)等問題也給其在獸藥領(lǐng)域的應(yīng)用提出了挑戰(zhàn)。同時，納米載藥系統(tǒng)還面臨著技術(shù)自身缺陷的挑戰(zhàn)。聚合物膠束納米的毒性、有機(jī)溶劑的殘留，規(guī)?；a(chǎn)工藝的缺乏等問題制約著其推廣應(yīng)用。固體脂質(zhì)納米載藥系統(tǒng)對某些親水性藥物的載藥量過低，脂質(zhì)狀態(tài)的復(fù)雜性，儲存過程中的晶型和粒徑的變化是影響其臨床開發(fā)的重要瓶頸。脂質(zhì)體制劑的物理穩(wěn)定性差、載藥量低、存儲滲漏性和體內(nèi)的不可控性是其臨床推廣應(yīng)用亟待突破的關(guān)鍵科學(xué)和技術(shù)難題[44]。安全性是藥物推廣使用的前提，通常認(rèn)為生理相容的脂質(zhì)材料是無毒的，但是，有學(xué)者提出其納米化后由于粒徑減小和表面能的增加，其毒性可能會發(fā)生變化，納米藥物的在體毒性的研究還有待進(jìn)一步深入。

6　納米抗菌藥物在畜禽胞內(nèi)感染疾病治療中的發(fā)展策略

為解決納米載藥系統(tǒng)面臨的挑戰(zhàn)，減小畜牧生產(chǎn)中因胞內(nèi)菌感染造成的巨大損失，未來的發(fā)展可以從以下幾個發(fā)面入手：①現(xiàn)有納米載藥技術(shù)的完善和改進(jìn)，改善現(xiàn)有載藥系統(tǒng)自身面臨的安全性、穩(wěn)定性、載藥量低等問題，同時加強(qiáng)載體材料修飾的研究，使藥物在體內(nèi)的過程更符合人類的意愿。②目前理化因素對納米藥物在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響還尚未有定論，各學(xué)者的結(jié)論并未統(tǒng)一，進(jìn)一步深入研究什么范圍內(nèi)的粒徑、電荷更有利于納米藥物被細(xì)胞攝取，這對指導(dǎo)納米載藥系統(tǒng)的制備與優(yōu)化顯得尤為重要，建立起納米藥物高效胞內(nèi)靶向傳遞理論，也有利于減小其開發(fā)和生產(chǎn)的成本。③利用特定胞內(nèi)菌的生存策略，開發(fā)相應(yīng)的載藥系統(tǒng)，如圖2所示，Zhang等用紅細(xì)胞膜包被抗菌藥物，制備出了紅細(xì)胞膜包被的納米凝膠系統(tǒng)，與常規(guī)抗菌藥相比該系統(tǒng)顯著提高了抗菌藥對MARS的治療效果，該系統(tǒng)巧妙地利用了金葡菌的生存策略，當(dāng)金葡菌識別載藥細(xì)胞的膜上受體，釋放毒素透化細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后，正好暴露在抗生素環(huán)境中，整個釋藥系統(tǒng)對金葡菌來說成為了一個陷阱[45]。該技術(shù)的提出為解決常規(guī)抗菌藥物難以透過細(xì)胞膜的難題提供了新思路。④研究表明，成本低廉、安全性好的萜類化合物不僅可以增加藥物的透膜能力[46]，而且可以破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，萜類化合物與抗菌藥物聯(lián)合使用來治療胞內(nèi)菌感染的研究，有待進(jìn)一步深入。⑤兩親性的樹狀大分子材料因其分子表面較多種類的原子基團(tuán)，能與多種親水性藥物的原子團(tuán)共價結(jié)合，從而增加藥物與組織細(xì)胞的親和力，增加親水性藥物的入胞能力和胞內(nèi)停留時間[47]，改善藥物的口服生物利用度。大量研究也表明帶有季銨鹽陽離子的樹狀大分子本身也具有抗菌活性，其與抗菌藥物的聯(lián)合使用也有利于減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，研究的不斷深入，納米載藥技術(shù)將會更加成熟，更多的納米載藥技術(shù)將會運(yùn)用到解決胞內(nèi)菌感染的難題上來，為我國畜牧產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展保駕護(hù)航。

圖2　細(xì)胞膜包被的納米膠束抗菌機(jī)制Fig 2　The mechanism of cell membrane-coated nanoparticles against bacteria

參考文獻(xiàn)：

[1]Steele, J.H.Regional and Country Status Report. In：Thoen, C.O.and J.H.Steele(Eds).Mycobacterium bovis infection in animals and humans[A].1995, 169-172.

[2]H.Hillaireau, P.Couvreur.Nanocarriers'entry into the cell：relevance to drug delivery[J], Cellular and Molecular Life Sciences, 2009, 66：2873-2896.

[3]J.Panyam, V.Labhasetwar.Sustained cytoplasmic delivery of drugs with intracellular receptors using biodegradable nanoparticles[J].Molecular Pharmaceutics, 2004, 1：77-84.

[4]P.Sendi, R.A.Proctor.Staphylococcusaureusas an intracellular pathogen：the role of small colony variants[J].Trends Microbiology, 2009, 17：54-58.

[5]Dwivedi G R, Sanchita, Singh D P,etal. Nano particles：emerging warheads against bacterial superbugs[J].Current Topics in Medicinal Chemistry, 2016, 16(18)：1963-1975.

[6]Jain S, Sharma J M, Agrawal A K,etal. Surface stabilized efavirenz nanoparticles for oral bioavailability enhancement[J]. Journal of Biomedical Nanotechnology, 2013, 9(11)：1862-1874.

[7]Akhtar N, Talegaonkar S, Khar R K,etal. Self-nanoemulsifying lipid carrier system for enhancement of oral bioavailability of etoposide by P-glycoprotein modulation：invitrocell line andinvivopharmacokinetic investigation[J].Journal of Biomedical Nanotechnology, 2013, 9(7)：1216-1229.

[8]Hans Helmut Niller, Janos Minarovits. Patho-epigenetics of infectious diseases caused by intracellular bacteria[J].Advance Experiment Medicine and Biology, 2016, 879：107-130.

[9]Martin Vestergaard, Wilhelm Paulander, Bingfeng Leng,etal. Novel pathways for ameliorating the fitness cost of gentamicin resistant small colony variants[J].Frontiers in Microbiology, 2016, 7：1-12.

[10] A.H.Pinto-Alphandary, P.Couvreur.Targeted delivery of antibiotics using liposomes and nanoparticles：research and applications[J].International Journal Antimicrobial Agents, 2000, 13：155-168.

[11] Gaurav Kant Saraogi, Puspa Gupta, U.D.Gupta,etal. Gelatin nanocarriers as potential vectors for effective management of tuberculosis[J].International Journal of Pharmaceutics, 2010, 385：143-149.

[12] Li X Q, Xie Sh Y, Pan Y H,etal. Preparation, characterization and pharmacokinetics of doxycycline hydrochloride andorfenicol polyvinylpyrroliddone microparticle entrapped with hydroxypropyl-cyclodextrin inclusion complexes suspension[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces, 2016, 141：634-642.

[13] N.Pothayee, N.Jain, T.P.Vadala,etal. Block ionomer complexes containing cationic antibiotics to kill intracellular brucella melitensisinvitro[J].Polymers for Advanced Technologies, 2012, 23：1484-1493.

[14] N.M.Zaki, M.M.Hafez.Enhanced antibacterial effect of ceftriaxone sodium-loaded chitosan nanoparticles against intracellularSalmonellatyphimurium[J].AAPS Pharm Sci Tech, 2012, 13：411-421.

[15] C.Lecaroz, C.Gamazo, M.J.BlancoPrieto.Nanocarriers with gentamicin to treat intracellular pathogens[J].Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2006, 6：3296-3302.

[16] Merchant Z, Buckton G, Taylor R M,etal. A new era of pulmonary delivery of nano-antimicrobial therapeutics to treat chronic pulmonary infections[J].Current Pharmaceutical Design, 2016, 22(17)：2577-2598.

[17] Weiss G, Schaible U E.Macrophage defense mechanisms against intracellular bacteria[J].Immunological Reviews, 2015, 264：182-203.

[18] Sukhithasri V, Vinod V, Varma S,etal. Mycobacterium tuberculosis treatment modalities and recent insights[J].Current Drug Delivery, 2014, 11(6)：744-752.

[19] Diana P.Gaspar, Vasco Faria, Lídia, M.D,etal. Rifabutin-loaded solid lipid nanoparticles for inhaled antitubercular therapy：Physicochemical andinvitrostudies[J].International Journal of Pharmaceutical, 2016, 497：199-209.

[20] K.O.Kisich, S.Gelperina, M.P.Higgins,etal. Encapsulation of moxioxacin within poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles enhances efcacy against intracellular mycobacterium tuberculosis[J].International Journal of Pharmaceutics, 2007, 345：154-162.

[21] Marjorie Bardiau, Johann Detilleux, Isabelle Ote,etal. Associations between properties linked with persistence in a collection ofStaphylococcusaureusisolates from bovine mastitis[J].Veterinary Microbiology, 2014, 169：74-79.

[22] Matteo Bonazzi, Pascale Cossart.Bacterial entry into cells：a role for the endocytic machinery[J].FEBS Letters, 2006, 580：2962-2967.

[23] Alwan Al-Qushawi, Ali Rassouli, Fatemeh Atyabi,etal. Preparation and characterization of three tilmicosin-loaded lipid nanoparticles：physicochemical properties andinvitroantibacterial activities[J].Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 2016, 15(4)：663-676.

[24] Li Y H, Su T T, Zhang Y,etal. Liposomal co-delivery of daptomycin and clarithromycin at an optimized ratio for treatment of methicillin-resistant staphylococcus aureus infection[J].Drug Delivery, 2015, 22(5)：627-637.

[25] Rahul S.Kalhapure, Sandeep J.Sonawane, Dhiraj R.Sikwal,etal. Solid lipid nanoparticles of clotrimazole silver complex：An efficient nano antibacterial againstStaphylococcusaureusand MRSA[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces, 2015, 136：651-658.

[26] Rahul S.Kalhapure, Chunderika Mocktar, Dhiraj R.Sikwal,etal. Ion pairing with linoleic acid simultaneously enhances encapsulation efficiency and antibacterial activity of vancomycin in solid lipid nanoparticles[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces, 2014, 117：303-311.

[27] 趙志偉, 莫國東, 韋 平. 畜禽生產(chǎn)中沙門氏菌病的防控意義[J].廣西畜牧獸醫(yī), 2011, 27(2)：75-77.

Zhao Z W, Mo G D, Wei P. The significance of prevention and control to salmonella in livestock and poultry production[J].Guangxi Journal of Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2011, 27(2)：75-77.

[28] Fink S L, Cookson B T. Pyroptosis and host cell death responses during salmonella infection[J].Cellular Microbiology, 2007, 9(11)：2562-2570.

[29] Liu Y H, Zhang Q F, Hu M,etal. Proteomic analyses of intracellular salmonella enterica serovar typhimurium reveal extensive bacterial adaptations to infected host epithelial cells[J].Infection and Immunity, 2015, 83：2897-2906.

[30] Richter-Dahlfors A, Buchan A M, Finlay B B.Murine Salmonellosis studied by confocal microscopy：Salmonellatyphimuriumresides intracellularly inside macrophages and exerts a cytotoxic effect on phagocytesinvivo[J].Biotechnology Laboratory and Department of Physiology, 1997, 186(4)：569-580.

[31] Pasmans F, Baert K, Martel A,etal. Induction of the carrier state in pigeons infected withSalmonellaenterica subspecies enterica serovar typhimurium PT99 by treatment with florfenicol：a matter of pharmacokinetics[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2008, 52(3)：954-961.

[32] 李向輝, 歐陽五慶, 楊雪峰, 等. 替米考星納米乳的制備及其質(zhì)量評價[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報, 2009, 37(4)：42-46.Li X H, Ouyang W Q, Yang X F,etal. Preparation and quality evaluation of tilmicosin nanoemulsion[J].Journal of Northwest A&F University, 2009, 37(4)：42-46.

[33] A.Ranjan, N.Pothayee, M.N.Seleem,etal.invitrotrafficking and efficacy of core-shell nanostructures for treating intracellularSalmonellainfections[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009, 53：3985-3988.

[34] Xie Sh Y, Yang F, Tao Y F,etal. Enhanced intracellular delivery and antibacterial efficacy of enrofloxacin-loaded docosanoic acid solid lipid nanoparticles against intracellularsalmonella[J].Scientific Reporter, 2017.

[35] Silk B J, Mahon B E.Comment on"Listeriosis in human pregnancy：a systematic review"[J].Journal of Perinatal Medicine, 2011, 39(6)：749-750.

[36] 郭宏華, 賈芙蓉, 韓曉英, 等.單核細(xì)胞增生性李斯特菌研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2013, 17(1)：197-199.

Guo H H, Jia F R, Han X Y,etal. Research progress of monocyte proliferativeListeriamonocytogenes[J].Chinese Journal of Laboratory Diagnosis, 2013, 17(1), 197-199.

[37] Sawosz E, Chwalibog A, Szeliga J,etal. Visualization of gold and platinum nanoparticles interacting withsalmonellaenteritidis andListeriamonocytogenes[J].International Journal of Nanomedicine, 2010, 5：631-637.

[38] F.Forestier, P.Gerrier, C.Chaumard,etal. Effect of nanoparticle-bound ampicillin on the survival ofListeriamonocytogenesin mouse peritoneal macrophages[J].Journal of Antimicrobial Chemotherap.1992, 30：173-179.

[39] E.Imbuluzqueta, C.Gamazo, J.Ariza,etal. Drug delivery systems for potential treatment of intracellular bacterial infections[J].Frontiers in Bioscience(Landmark Edition), 2010, 15：397-417.

[40] M.Ito, E.Ishida, F.Tanabe,etal. Inhibitory effect of liposome-encapsulated penicillin G on growth ofListeriamonocytogenesin mouse macro-phages[J].tohoku journal of experimental medicine, 1986, 150：281-286.

[41] Shuyu Xie, Yanfei Tao, Yuanhu Pan,etal. Biodegradable nanoparticles for intracellular delivery of antimicrobial agents[J].Journal of Controlled Release, 2014, 187：101-107.

[42] Oh Y K, Nix D E, Straubinger R M,etal. Formulation and efficacy of liposome-encapsulated antibiotics for therapy of intracellular mycobacterium avium infection[J].Antimicrob Agents Chemother, 1995, 39(9)：2104-2111.

[43] Gasparm M, Calado S, Pereira J,etal. Targeted delivery of paromomycin in murine infectious diseases through association to nano lipid systems.Nanomedicine：Nanotechnology, Biology and Medicine[J].2015, 11：1851-1860.

[44] Allen T M, Chonn A.Large unilamellar liposomes with low uptake into the reticuloendothelial system[J].Federation of the European Biochemical Societies, 1987, 223：42-46.

[45] Yue Zhang, Jianhua Zhang, Wansong Chen,etal. Erythrocyte membrane-coated nanogel for combinatorial antivirulence and responsive antimicrobial delivery againstStaphylococcusaureusinfection[J].Journal of Controlled Release, 2017.

[46] Kunta, J.R, Goskonda, V.R, Brotherton, H.O.etal. Effect of menthol and related terpenes on the percutaneous absorption of propranolol across excised hairless mouse skin[J].Journal of Pharmaceutical Sciences, 1997, 86：1369-1373.

[47] Zanini SF1, Silva-Angulo AB, Rosenthal A,etal. Effect of citral and carvacrol on the susceptibility ofListeriamonocytogenesandListeriainnocuato antibiotics[J].Letters in Applied Microbiology, 2014, 58：486-492.