共免疫對(duì)跳蚤叮咬引起的貓過敏性皮炎保護(hù)效果評(píng)價(jià)

趙 兵，溫良海，劉正偉，王 瀚，張愛國(guó)，李慧敏，李延鵬，陳瑞愛,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；2.廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司，廣東新興 527400)

貓桎首蚤分布很廣，寄生于動(dòng)物體表，以吸血為生，是對(duì)犬貓?jiān)斐蓢?yán)重危害的蚤類。跳蚤過敏性皮炎(Flea allergy dermatitis, FAD)是由跳蚤叮咬吸血時(shí)引起動(dòng)物的皮炎、劇烈瘙癢以及抓撓導(dǎo)致的二次感染的過敏性皮膚病[1]。因此，對(duì)貓桎首蚤的防控及其導(dǎo)致的過敏性皮炎的防治顯得尤為重要。

人們針對(duì)跳蚤叮咬引起犬貓過敏性皮炎的防治方法有多種。首先利用殺蟲劑、寵物香波等進(jìn)行動(dòng)物除蚤，然后采用藥浴、涂抹激素類藥物等對(duì)癥治療，雖能取得一定的療效，但是這種方法存在療效差、激素類藥物副作用大等缺點(diǎn)，而且當(dāng)跳蚤侵?jǐn)_時(shí)不能阻止跳蚤過敏性皮炎再次發(fā)生[2]。也有人嘗試免疫脫敏療法，該方法通過反復(fù)接種過敏原，提高患病動(dòng)物對(duì)變應(yīng)原的耐受性，當(dāng)動(dòng)物再次接觸過敏原時(shí)，機(jī)體會(huì)大大減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而減輕過敏性皮炎的發(fā)病程度，但該方法缺點(diǎn)是療程長(zhǎng)，可能會(huì)造成動(dòng)物皮膚損傷甚至導(dǎo)致過敏性休克，效率也不穩(wěn)定，重復(fù)性低[3-4]。

研究表明，過敏性疾病的發(fā)生與Th1向Th2漂移，Th2處于優(yōu)勢(shì)地位有關(guān)[5]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以通過細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)影響Th1、Th2的平衡[6]，對(duì)防止自身免疫性疾病發(fā)生，限制慢性炎癥等具有重要作用[7]。共免疫rFSA1和與之編碼相匹配的質(zhì)粒可以誘導(dǎo)一群誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(iduced Treg, iTreg)，能夠改善鼠和貓F(tuán)AD的癥狀[8-9]。為了解共免疫能否有效預(yù)防過敏性疾病，研究評(píng)價(jià)了共免疫對(duì)貓F(tuán)AD的預(yù)防保護(hù)效果。

1　材料與方法

1.1貓和跳蚤45只年齡大于12個(gè)月、體重超過2 kg的同一品種家貓，購(gòu)自北京市興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠；貓桎首蚤，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2試劑與儀器pET28a載體、pVAX1載體購(gòu)自淼靈生物科技(武漢)有限公司；E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ，DNA連接酶, DL2000 DNA Marker,DL15000 DNA Marker蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)粒抽提試劑盒等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；Ni-NTA親合層析柱填料購(gòu)自北京諾博萊德科技有限公司；Biosafer150-96超聲波細(xì)胞破碎儀購(gòu)自賽飛(中國(guó))有限公司；NanoDrop?Lite紫外分光光度計(jì)購(gòu)自北京蘭博康斯科技有限公司；諾普星購(gòu)自諾華動(dòng)物保健(上海)有限公司；鱟試劑購(gòu)自湛江博康海洋生物有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3FSA1基因與引物的設(shè)計(jì)合成FSA1基因與引物均由上海生工生物工程有限公司合成。參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的FSA1基因序列(登錄號(hào)為AF102502)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增FSA1基因的引物P1、P2和P3，核酸序列如下P1：5'-CGGGAATTCATGGAAGATATTTGG-3'；P2：5'-CGGCTCGAGTTATTTATTTTTTGG-3'；P3：5'-GCCTCTAGATTATTTATTTTTTGG-3'。P1為上游引物，帶有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；P2、P3為下游引物，分別帶有XhoⅠ、XbaⅠ酶切位點(diǎn)。

1.4FSA1基因的克隆

1.4.1原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定以人工合成的FSA1基因?yàn)槟０?，以P1、P2為引物，PCR擴(kuò)增基因片段，克隆至原核表達(dá)載體pET28a，并轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB卡那抗性平板，挑取單菌落，EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切并測(cè)序鑒定，將鑒定正確的原核表達(dá)質(zhì)粒命名為pET28a- FSA1,重組菌命名為BL-FSA1。

1.4.2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定以P1、P3為引物，PCR擴(kuò)增基因片段，克隆至真核表達(dá)載體pVAX1，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB卡那抗性平板，挑取單菌落，EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切并測(cè)序鑒定，將鑒定正確的重組菌命名為DH-FSA1。鑒定成功的pVAX1-FSA1參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR鑒定pVAX1-FSA1在真核細(xì)胞中的表達(dá)。

1.5共免疫疫苗的制備

1.5.1rFSA1蛋白制備與純化將重組菌BL-FSA1接種于含有卡那霉素的LB液中培養(yǎng)，待OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，將菌液分為4組，其中3組分別以0.1、0.5、1.0 mmol/L IPTG濃度誘導(dǎo)，另一組不誘導(dǎo)作為對(duì)照，用SDS-PAGE法分析4 h后重組蛋白表達(dá)量。收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，冰浴條件下進(jìn)行超聲波破碎，以10000 r/min離心包涵體15 min，取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

收集包涵體，用8 mol/L脲過夜攪拌溶解包涵體，離心取上清液，通過Ni-NTA親和層析柱分離目的蛋白，洗脫液(8 mol/L脲、300 mmol/L KCl、50 mmol/L KH2PO4、500 mmol/L咪唑、pH8.0)洗脫目的蛋白FSA1，重組蛋白：0.5 mol/L精氨酸以1∶20(V∶V)比例稀釋復(fù)性，置于透析袋中透析36 h，每12 h更換一次透析液(PBS)。利用曲拉通去除內(nèi)毒素，將10%曲拉通X-114按1∶4體積比與rFSA1/PBS混勻，冰浴10 min，然后37 ℃水浴15 min，10000 r/min離心15 min，吸出上層液，重復(fù)以上步驟3次，按照鱟試劑使用說明書檢測(cè)溶液內(nèi)毒素。按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度后，于-70 ℃保存。

1.5.2真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-FSA1的制備將重組菌DH-FSA1接種于含有卡那霉素的LB液中，37 ℃過夜培養(yǎng)，按照文獻(xiàn)[7]所述方法制備質(zhì)粒pVAX1-FSA1。去除質(zhì)粒溶液內(nèi)毒素并檢測(cè)內(nèi)毒素含量。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，于-70 ℃保存。

1.6免疫效力評(píng)價(jià)45只貓隨機(jī)分為5組。共免疫組每只免疫500 μg rFSA1蛋白+500 μg pVAX1-FSA1質(zhì)粒，載體對(duì)照組每只免疫500 μg rFSA1蛋白+500 μg pVAX1空載體；蛋白對(duì)照組每只免疫500 μg BSA蛋白+500 μg pVAX1-FSA1質(zhì)粒，于腿部肌肉注射。二免后14 d開始攻跳蚤，每只貓每輪攻100只跳蚤(新羽化未吸血的成蚤)，每次攻跳蚤48 h后，飼喂諾普星(有效成分：烯啶蟲胺)除蚤，間隔12 d后開始下一輪攻蚤，總共攻4輪(攻4輪跳蚤后貓F(tuán)AD皮炎評(píng)分能達(dá)到最高值，額外的輪數(shù)并不會(huì)增加皮炎評(píng)分分值)[6]。FAD對(duì)照組不免疫，采用相同的步驟攻4輪跳蚤和飼喂除蚤藥?？瞻讓?duì)照組既不免疫也不攻跳蚤，但是飼喂諾普星作為陰性對(duì)照。由專業(yè)的獸醫(yī)人員給貓皮炎癥狀打分，評(píng)價(jià)共免疫對(duì)貓F(tuán)AD的保護(hù)效果。實(shí)驗(yàn)在跳蚤活躍季節(jié)夏、秋季實(shí)施，所有貓飼養(yǎng)在鐵籠里，籠具長(zhǎng)90 cm、寬63 cm、高82 cm，每日打掃貓的排泄物，給予干凈的水和貓糧，以提供舒適的環(huán)境。空白對(duì)照組貓?jiān)诟舯诨\舍飼養(yǎng)，所有籠舍通風(fēng)良好。貓實(shí)驗(yàn)分組情況見表1。

表1　貓實(shí)驗(yàn)免疫分組Tab 1　Dividing cats into five groups

“-”代表不操作

"-" on behalf of not operating

FAD癥狀主要包括丘疹、結(jié)痂、脫毛。每種皮損評(píng)分從0分至3分：0分-沒有發(fā)病癥狀；1分-發(fā)病程度輕微；2分-中等程度的發(fā)??；3分-發(fā)病程度嚴(yán)重。各種皮損計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：丘疹1～3個(gè)計(jì)1分，4～6個(gè)計(jì)2分，7個(gè)及以上計(jì)3分；脫毛面積大于或等于1 cm2且小于4 cm2計(jì)1分，大于或等于4 cm2且小于9 cm2計(jì)2分，大于或等于9 cm2計(jì)3分；結(jié)痂1個(gè)計(jì)1分，2個(gè)計(jì)2分，3個(gè)及以上計(jì)3分。有3個(gè)部位的癥狀需要被觀察：(1)頸背部，從頭頂?shù)轿膊康膮^(qū)域；(2)胸腔側(cè)：從近肘部的胸腔到最后一根肋骨出的區(qū)域；(3)跳蚤三角區(qū)，動(dòng)物下腹部和兩條后肢根部組成的一個(gè)三角區(qū)。

關(guān)于皮炎計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)文獻(xiàn)[9]所述方法進(jìn)一步細(xì)化得出的量化計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)，有助于方便、準(zhǔn)確評(píng)估FAD發(fā)病程度。

2　結(jié)　果

2.1FSA1基因的克隆及鑒定結(jié)果FSA1基因與原核表達(dá)載體pET28a連接后構(gòu)建pET28a-FSA1，質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切可產(chǎn)生5400 bp左右的空載體條帶和一條480 bp的目的條帶(圖1)；FSA1基因與真核表達(dá)載體pVAX1連接構(gòu)建pVAX1- FSA1，質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ+XbaⅠ雙酶切可產(chǎn)生3000 bp左右的空載體條帶和一條480 bp的目的條帶(圖2)。pET28a-FSA1與pVAX1-FSA1測(cè)序鑒定結(jié)果與預(yù)期相符。將pVAX1-FSA1轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，采用RT-PCR法測(cè)定重組質(zhì)粒在BHK細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明重組質(zhì)粒pVAX1-FSA1轉(zhuǎn)染后能在BHK細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)(圖3)。

M1: DL15000 bp DNA Marker;M2: DL2000 bp DNA Marker；1：重組質(zhì)粒pET28a-FAS1；2：重組質(zhì)粒 EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物M1: DL15000bp DNA Marker; M2: DL2000bp DNA Marker;1: recombinant plasmid pET28a-FSA1; 2: The product from recombinant plasmid pET28a-FSA1 digested with EcoRⅠ+XhoⅠ圖1　重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-FSA1的雙酶切鑒定Fig 1　Double restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid pVAX1-FSA1

M1: DL15000 bp DNA Marker; M2: DL2000 bp DNA Marker；1：重組質(zhì)粒pVAX1-FAS1；2：重組質(zhì)粒EcoRⅠ+XbaⅠ雙酶切產(chǎn)物M1: DL15000bp DNA Marker; M2: DL2000bp DNA Marker;1: recombinant plasmid pVAX1-FSA1; 2: The product from recombinant plasmid pET28a-FSA1 digested with EcoRⅠ+XbaⅠ圖2　重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-FAS1的雙酶切鑒定Fig 2　Double restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pVAX1-FSA1

M: DL2000 DNA Marker；1：轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞中表達(dá)的FSA1基因；2：未轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞M: DL2000 DNA Marker; 1: Transfected BHK cells express the FSA1 gene；2: untransfected BHK cells圖3　FSA1基因的RT-PCR鑒定Fig 3　Identification of FSA1 gene by RT-PCR

2.2共免疫疫苗的制備

2.2.1蛋白制備重組菌BL-FSA1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后用SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果表明在37 ℃、0.1 mmol/L IPTG的條件下誘導(dǎo)4 h能大量表達(dá)重組蛋白rFSA1，更高濃度的IPTG并不會(huì)增加目的蛋白的表達(dá)量(圖4)。

M：未預(yù)染的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET28a未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；2：pET28a-FSA1未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；3：pET28a-FSA1經(jīng)0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)；4：pET28a-FSA1經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)；5：pET28a-FSA1經(jīng)1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)M: Unstained protein molecular weight Marker; 1: pET28a without induction with IPTG; 2: pET28a-FSA1 without induction with IPTG;3: pET28a-FSA1 induction with IPTG at 0.1 mmol/L;4: pET28a-FSA1 induction with IPTG at 0.5 mmol/L;5: pET28a-FSA1 induction with IPTG at 1.0 mmol/L圖4　FSA1基因誘導(dǎo)表達(dá)IPTG濃度的優(yōu)化Fig 4　Determination of induction IPTG concerntration for FSA1 gene

收集裂解菌離心后的上清液和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE，可溶性分析表明rFSA1主要以包涵體形式存在；重組蛋白溶液通過曲拉通去除內(nèi)毒素后，經(jīng)鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素含量<1.25 EU/mL；重組蛋白溶液經(jīng)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度為0.5 mg/mL。

2.2.2質(zhì)粒制備將按照文獻(xiàn)[10]中方法提取的質(zhì)粒通過曲拉通去內(nèi)毒素后，鱟試劑檢測(cè)其內(nèi)毒素含量<1.25 EU/mL，質(zhì)粒溶液經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度為1.5 mg/mL。

2.3皮炎評(píng)分結(jié)果對(duì)各組貓每次攻跳蚤后第3天給貓進(jìn)行FAD癥狀打分,計(jì)算丘疹、脫毛、結(jié)痂各種皮炎總分。隨著各組攻跳蚤的次數(shù)增多，貓出現(xiàn)多處丘疹，結(jié)痂，脫毛等臨床病癥，引起了嚴(yán)重的過敏性皮炎。FAD對(duì)照組(5.5分)在第4次攻跳蚤后皮炎評(píng)分達(dá)到最高值，它與載體對(duì)照組(5.7分)和蛋白對(duì)照組(5.3分)得分接近。共免疫組第4次攻跳蚤后皮炎評(píng)分為1.9分，與FAD對(duì)照組、載體對(duì)照組和蛋白對(duì)照組相比分值明顯減小(圖5)。以上結(jié)果說明對(duì)照組rFSA1+pVAX1和BSA+pVAX1-FSA1對(duì)貓F(tuán)AD沒有影響或影響較小。而共免疫rFSA1+pVAX1-FSA1能顯著抑制貓F(tuán)AD，因此可以成為預(yù)防貓F(tuán)AD的候選疫苗。圖6為貓F(tuán)AD發(fā)病的典型癥狀。

圖5　各組實(shí)驗(yàn)貓皮炎總評(píng)分Fig 5　The total dermatology scores of five groups

圖6　貓F(tuán)AD的典型癥狀Fig 6　Typical symptoms of FAD in cats

3　討　論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類具有調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞功能的T細(xì)胞亞群。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有多種免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，其中最重要的一種是通過分泌細(xì)胞因子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。研究人員發(fā)現(xiàn)共免疫可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一群CD4+CD25-Foxp3+Treg，這群iTreg具有對(duì)特異性抗原的反應(yīng)性，分泌IL-10和TGF-β等抑制性細(xì)胞因子，抑制炎癥T細(xì)胞[8]。靳津在治療貓F(tuán)AD的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證明了共免疫可以減弱貓對(duì)跳蚤提取物皮試反應(yīng)、減少組織中肥大細(xì)胞的聚集和抑制T細(xì)胞增殖，這與機(jī)體中過敏相關(guān)細(xì)胞因子IL-5的分泌減少，抑制性細(xì)胞因子IL-10的分泌增加有關(guān)，從而改善了跳蚤過敏性皮炎的癥狀[9]。除了細(xì)胞因子途徑以外，Treg還可以通過細(xì)胞溶解、代謝阻斷、調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的成熟或功能發(fā)揮抑制作用。但目前尚不清楚共免疫誘導(dǎo)的iTreg調(diào)節(jié)免疫抑制是否有多種機(jī)制共同作用。據(jù)此推測(cè)，利用共免疫預(yù)防保護(hù)貓F(tuán)AD具有上述類似的抑制機(jī)理。

在觀察貓F(tuán)AD發(fā)病情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，即使在相同的環(huán)境下誘導(dǎo)FAD，貓F(tuán)AD的發(fā)病程度也會(huì)存在差異。為了說明試驗(yàn)中貓的發(fā)病程度，將FAD對(duì)照組皮炎評(píng)分分值劃為4個(gè)檔次：0分為不發(fā)??；1～3分為發(fā)病輕微；4～6分為中度發(fā)??；6～9分為嚴(yán)重發(fā)病。FAD對(duì)照組在攻完4輪跳蚤后有6只貓嚴(yán)重發(fā)病，有1只中度發(fā)病，有2只發(fā)病輕微，甚至還有1只沒有任何癥狀，說明FAD組貓發(fā)病程度的差異較大與貓對(duì)跳蚤的敏感性存在個(gè)體差異有關(guān)，即有的貓被少量跳蚤叮咬就能引起劇烈瘙癢，產(chǎn)生明顯的病癥，但有的貓即使感染了大量跳蚤只表現(xiàn)出輕微病癥甚至不發(fā)病。因此，人為誘導(dǎo)貓F(tuán)AD發(fā)病是存在個(gè)體差異的，這與Wilkerson誘導(dǎo)犬FAD的發(fā)病程度存在差異的情況類似[11]。

攻跳蚤和皮炎評(píng)分方法首先是由Wilkerson等[11]建立并用于評(píng)價(jià)犬FAD發(fā)病程度，后來靳津等[9]將這種方法優(yōu)化后用于評(píng)價(jià)共免疫對(duì)貓F(tuán)AD的治療效果。試驗(yàn)證明按照同樣的方法能成功誘導(dǎo)貓F(tuán)AD并進(jìn)行皮炎評(píng)分，通過四輪攻跳蚤后皮炎評(píng)分達(dá)到最高值，該模型可以對(duì)共免疫預(yù)防貓F(tuán)AD的效果進(jìn)行客觀評(píng)定。靳津通過建立貓F(tuán)AD模型后，利用共免疫治療貓F(tuán)AD，皮炎評(píng)分迅速下降，取得了顯著治療效果。通過預(yù)先共免疫，再進(jìn)行誘導(dǎo)貓F(tuán)AD，皮炎評(píng)分只是略微增加，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于FAD對(duì)照組的皮炎評(píng)分，證明了共免疫重組蛋白rFSA1+質(zhì)粒pVAX1-FSA1對(duì)貓F(tuán)AD具有顯著的預(yù)防保護(hù)效果。為了排除其他DNA和蛋白質(zhì)組合誘導(dǎo)非特異性免疫抑制的可能性，試驗(yàn)增加了免疫rFSA1+pVAX1、BSA+pVAX1-FSA1的貓作為載體對(duì)照組和蛋白對(duì)照組，結(jié)果表明免疫非相關(guān)組合rFSA1+pVAX1、BSA+pVAX1-FSA1對(duì)貓F(tuán)AD沒有保護(hù)效果,只有共免疫rFSA1+pVAX1-FSA1才能對(duì)貓F(tuán)AD起到保護(hù)作用，體現(xiàn)了該候選疫苗的特異性。然而共免疫組(1.9分)與空白對(duì)照組(0.4分)相比，仍有輕微的皮炎癥狀，這可能與免疫方式或免疫劑量有關(guān)。此次試驗(yàn)中，貓是每14 d免疫1次，共免疫2次，每次500 μg BSA+500 μg pVAX1-FSA1于腿部肌肉注射，下一步可通過改進(jìn)免疫方式、免疫劑量以期得到更好的保護(hù)效果。

試驗(yàn)表明利用共免疫生物制劑預(yù)防跳蚤過敏性皮炎能取得較好的預(yù)防效果，具有操作方便、療程短的優(yōu)點(diǎn)，且無副作用，是一個(gè)安全性高、具有抗原特異性的方法，作為候選疫苗具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景，但如何提高共免疫的預(yù)防保護(hù)效果還需進(jìn)一步研究。

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