HPLC-ELSD法聯(lián)合UPLC-MS/MS法檢測魚腥草注射液中非法添加的慶大霉素

王靜文，龔旭昊，范 強*，孫 雷，汪 霞

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

魚腥草注射液為魚腥草經(jīng)水蒸氣蒸餾制成的滅菌水溶液，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功能[1]，在中獸醫(yī)臨床具有廣泛應用。然而，近兩年來已先后在魚腥草注射液中發(fā)現(xiàn)有非法添加甲氧氯普胺、林可霉素、水楊酸、氧氟沙星[2-4]等化學藥品的現(xiàn)象，最近又在一批委托檢驗樣品中檢出慶大霉素。這種在處方外非法添加化學藥品的現(xiàn)象不僅嚴重威脅了動物用藥安全，擾亂了獸藥市場，也給動物源性食品安全帶來了隱患。慶大霉素是一種氨基糖苷類廣譜抗生素，主要用于治療細菌感染，尤其是革蘭陰性菌引起的感染[5]。分析慶大霉素常見的方法有微生物法、熒光免疫法、薄層色譜法、高效液相色譜法等，其中僅有色譜技術(shù)能定量慶大霉素中各組分的含量。目前尚未有應用UPLC-MS/MS檢測獸藥中非法添加慶大霉素的報道，本實驗首次建立了HPLC-ELSD聯(lián)合UPLC-MS/MS系統(tǒng)篩查魚腥草注射液中慶大霉素的方法，以期為相關(guān)工作提供技術(shù)支持。

1　儀器與材料

1.1儀器SHIMADZU高效液相色譜儀SPD-20A(日本島津公司)、Alltech ELSD 2000ES、Waters Acquity超高效液相色譜(美國Waters公司)、Waters Quattro Premier XE(美國Waters公司)、Masslynx工作站軟件(美國Waters公司)、 Mettler XS205型十萬分之一天平(美國Mettler Toledo公司)、MiliQ純水機。

1.2試藥與試劑慶大霉素對照品(C1a：27.8%，C2：24.6%，C2a：22.0%，C1：25.7%，批號：K0071502，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。供試品：魚腥草注射液空白樣品(批號：150303)，魚腥草注射液陽性樣品(批號：2015122611)。乙腈(Merck，色譜純，批號：1747130433)，甲醇(Merck，色譜純，批號：1748007433)，甲酸(Fisher Scientific，色譜純，批號：106055A)，七氟丁酸酐(HFBA，Alfa Aesar，色譜純，10132012)，三氟醋酸(Fisher Scientific，色譜純，135262)，去離子水(MiliQ純化系統(tǒng)制備的去離子水)。

2　方　法

2.1溶液制備

2.1.1HPLC-ELSD用魚腥草注射液樣品溶液制備

取魚腥草注射液樣品1.0 mL，置錐形瓶中，加0.2 mol/L三氟醋酸-甲醇(92∶8)稀釋至50 mL，搖勻；過0.45 μm濾膜，即得。

2.1.2UPLC-MS/MS用魚腥草注射液樣品溶液制備取魚腥草注射液樣品1.0 mL，置刻度管中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至10 mL，搖勻；取200 μL，置刻度管中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至10 mL，搖勻；過0.22 μm濾膜，即得。

2.1.3HPLC-ELSD用慶大霉素對照品溶液制備取慶大霉素對照品10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加0.2 mol/L三氟醋酸-甲醇(92:8)溶解并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，即得。

2.1.4UPLC-MS/MS用慶大霉素對照品標準儲備液取慶大霉素對照品38.9 mg(相當于慶大霉素C110.0 mg)，精密稱定，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。配制完后轉(zhuǎn)移至塑料離心管內(nèi)于4 ℃冰箱保存，有效期為1個月。

2.1.5UPLC-MS/MS用慶大霉素對照品工作溶液

取慶大霉素標準儲備液1.0 mL，置10 mL量瓶中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至刻度，搖勻；取100 μL，置10 mL量瓶中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。配制完后轉(zhuǎn)移至塑料離心管內(nèi)于4 ℃冰箱保存。

2.1.65 mmol/L七氟丁酸酐溶液取0.25 mL HFBA，加水稀釋至200 mL，搖勻，即得。

2.2儀器條件

2.2.1HPLC-ELSD色譜條件色譜柱：資生堂MG C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：0.2 mol/L三氟醋酸 -甲醇(92∶8)，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量10 μL ，蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD，漂移管溫度110 ℃，載氣流量2.8 L/min)。

2.2.2UPLC色譜條件色譜柱：Waters C18(2.1×50 mm，1.7 μm)，流動相：0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液(10∶90)，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

2.2.3質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI+)；離子源溫度為110 ℃；檢測方式為多反應監(jiān)測(MRM)；毛細管電壓為3.2 kV；霧化氣溫度為350 ℃；霧化氣流速為650 L/h；錐孔氣流速為50 L/h；碰撞氣體為氬氣。慶大霉素C1的定性、定量離子對及對應的錐孔電壓、碰撞能量參考值見表1。

表1　慶大霉素C1定性、定量離子對及對應錐孔電壓、碰撞能量參考值Tab 1　Mass spectrometry detection conditions of Gentamicin C1

3　結(jié)果與分析

3.1非法添加物的發(fā)現(xiàn)及初步分析某單位在獸藥監(jiān)督工作中發(fā)現(xiàn)一批魚腥草注射液樣品中疑似添加有慶大霉素，由于技術(shù)條件有限，委托予以確認。由于慶大霉素分子結(jié)構(gòu)中無共軛雙鍵，無紫外吸收，無法采用常規(guī)的HPLC-PDA方法進行初篩，故參考《中國獸藥典》一部硫酸慶大霉素檢查項下慶大霉素C組份的HPLC-ELSD測定方法進行初篩，色譜條件參見2.2.1項，溶液的配制參見2.1.1和2.1.3項，發(fā)現(xiàn)這批魚腥草注射液樣品在與慶大霉素對照品四個組份相應位置出現(xiàn)相同色譜峰，且四個組份的含量比例接近，進一步確定，此樣品中添加有慶大霉素(圖1～圖2)。

在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上，建立針對此批樣品的UPLC-MS/MS的慶大霉素檢查方法，并對實際樣品進行檢測。

圖1　慶大霉素對照品(1 mg/mL)色譜圖(依次為慶大霉素C1a、C2、C2a、C1)Fig 1　Chromatogram of Gentamicin(1 mg/mL)(Gentamicin C1a、C2、C2a、C1)

圖2　魚腥草注射液色譜圖(依次為慶大霉素C1a、C2、C2a、C1)Fig 2　Chromatogram of Houttuynia Injection (Gentamicin C1a、C2、C2a、C1)

3.2UPLC-MS/MS方法學考察

3.2.1專屬性通過溶劑空白試驗和魚腥草注射液空白試驗排除溶劑及制劑處方中主要成分對于被測物的干擾。精密量取5 mmol/L七氟丁酸酐溶液、魚腥草注射液空白溶液、慶大霉素對照品溶液(相當于慶大霉素C11 μg/mL)10 μL，照2.2.2和2.2.3項液相質(zhì)譜條件，注入UPLC-MS/MS，記錄特征離子質(zhì)量色譜圖，結(jié)果表明5 mmol/L七氟丁酸酐、魚腥草注射液本底對慶大霉素C1檢測無干擾(圖3～圖5)。

圖3　5 mmol/L七氟丁酸酐溶液特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 3　Characteristic ions mass spectrometry of HFBA (5 mmol/L)

圖4　魚腥草注射液空白溶液特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 4　Characteristic ions mass spectrometry of sample blank

圖5　慶大霉素C1對照品溶液特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 5　Characteristic ions mass spectrometry of Gentamicin C1

3.2.2線性取慶大霉素對照品儲備液(相當于慶大霉素C11.0 mg/mL)150 μL置10 mL容量瓶中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至刻度，搖勻，得濃度為15 μg/mL的慶大霉素C1對照品溶液；精密量取上述溶液1、3、5、7、9 mL置100 mL量瓶中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.15、0.45、0.75、1.05、1.35 μg/mL的標準曲線溶液，照2.2.2和2.2.3項液相質(zhì)譜條件測定。按慶大霉素C1定量離子峰面積與對應的濃度作標準曲線，并計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。慶大霉素C1回歸方程為y=5519.3x+879.24，R=0.9965。表明慶大霉素C1在0.15～1.35 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

3.2.3檢測限添加適量慶大霉素對照品儲備液至1.0 mL魚腥草注射液空白樣品中，按2.1.2項同法處理，照2.2.2和2.2.3項液相質(zhì)譜條件測定，觀察慶大霉素C1特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N)和對應藥物濃度，S/N>3作為方法的檢出限。取魚腥草注射液空白樣品1.0 mL三份，置刻度管中，分別加入慶大霉素對照品儲備液(相當于慶大霉素C11.0 mg/mL)適量(100、150、200 μL)，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至10 mL，搖勻；取200 μL，置刻度管中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至10 mL，搖勻；過0.22 μm濾膜，精密吸取上述檢測限樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，照2.2.2和2.2.3項液相質(zhì)譜條件測定檢測限，結(jié)果表明中間加入量為慶大霉素C1的檢測限為0.15 g/L。

3.2.4準確度及精密度以魚腥草注射液空白樣品加慶大霉素對照品做回收率試驗來考察方法的準確度?；厥章试囼炄芤号渲疲喝◆~腥草注射液空白樣品1.0 mL、慶大霉素對照品儲備液(相當于慶大霉素C11.0 mg/mL)750 μL，置同一10 mL量瓶中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至刻度，搖勻；取200 μL，置10 mL量瓶中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至刻度，搖勻；過0.22 μm濾膜，平行配制上述試驗溶液各6份。精密吸取上述試驗溶液各10 μL，注入液相色譜儀，照2.2.2和2.2.3項液相質(zhì)譜條件檢測。結(jié)果顯示：魚腥草注射液中慶大霉素C1回收率為97.7%，RSD為5.5%。

3.3樣品測定結(jié)果參考歐盟2002/657/EC中有關(guān)規(guī)定，樣品溶液色譜圖中如出現(xiàn)與對照品保留時間一致的峰(差異小于等于±2.5%)，定性離子對與對照品一致(表1)，特征離子豐度比與對照品溶液一致(偏差符合表2的要求)，計算樣品中慶大霉素C1的濃度，如大于檢測限，判定為檢出慶大霉素。取魚腥草注射液待測樣品照2.1.2項制備方法操作，照2.2.2和2.2.3項液相質(zhì)譜條件測定慶大霉素，結(jié)果為：魚腥草注射液中慶大霉素C1含量為0.86 g/L，陽性樣品檢測結(jié)果見表3。

表2　離子豐度比的最大允許偏差Tab 2　Maximum permitted tolerances for relative ion intensities

表3　陽性樣品檢測結(jié)果Tab 3　Result of the sample

4　討論與小結(jié)

4.1篩查思路的選擇目前非法添加物篩查工作總體上可分為無目標篩查和有目標篩查兩種。無目標篩查主要是針對新發(fā)現(xiàn)的非法添加物，借助色譜光譜質(zhì)譜核磁等[6]分析手段，結(jié)合合理的臨床藥理依據(jù)，推導出可能的化合物結(jié)構(gòu)及名稱；有目標篩查是指在各實驗室已積累的非法添加物數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上，對樣品進行數(shù)據(jù)庫中收載的化合物篩查，常見的方法有液相色譜-二極管陣列法(HPLC-PDA)[7]、液相色譜-高分辨質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等(HPLC-MS/MS)[8]。本研究屬于有目標篩查范圍，由于慶大霉素結(jié)構(gòu)中不含有共軛雙鍵，無紫外吸收，無法采用HPLC-PDA法進行篩查，同時由于慶大霉素為多組分化合物，建立包含各組分的質(zhì)譜分析方法工作量大且無必要，故先采用HPLC-ELSD法對樣品進行初篩，首先明確樣品是否添加有慶大霉素，再選取慶大霉素主要成分之一慶大霉素C1，建立相應的HPLC-MS/MS檢測方法。

4.2UPLC-MS/MS測定溶劑、流動相的選擇由于慶大霉素在水中易溶，在乙醇、丙酮或乙醚中不溶[9]，故選擇水作為對照品溶劑。在無離子對情況下，慶大霉素在C18硅膠柱上無保留，在流動相中添加20 mmol/L七氟丁酸酐溶液后，情況改善，保留時間為6.1min，但這類抑制劑會抑制離子化，污染LC/MS表面，減低儀器靈敏度，故本研究嘗試以5 mmol/L七氟丁酸酐溶液代替水作為對照品儲備液和樣品的稀釋溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)既可改善慶大霉素無保留情況，又可降低對儀器的損害。

4.3溶液儲存條件的選擇氨基糖苷類抗生素對極性表面有非常高的吸附親和力，所以容量瓶、樣品瓶等試驗用具應盡量選擇吸附性弱的材質(zhì)，玻璃和其他吸附性強的塑料制品均會對慶大霉素產(chǎn)生強烈的吸附作用，導致樣品的損失，在溶液儲存時應當盡量避免[10-13]。慶大霉素在酸性水溶液和堿性水溶液中均穩(wěn)定，其水溶液在4～8 ℃可以保存六個月[11]。

本文建立了一種系統(tǒng)篩查魚腥草注射液中非法添加慶大霉素的篩查方法，結(jié)合了液相色譜操作簡單普及率高和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜準確靈敏的優(yōu)勢，進一步完善了非法添加檢測工作中有目標篩查板塊的技術(shù)儲備。該方法具有良好的可操作性和重現(xiàn)性，可廣泛應用于非法添加檢測工作。

參考文獻：

[1]中國獸藥典委員會. 獸藥國家標準化學藥品、中藥卷[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2013：256.

The Commission of Chinese Veterinary Pharmacopoeia, National Standards of Veterinary Drug (the volume of chemical drug and traditional Chinese medicine) [M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2013：256.

[2]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2448號. 魚腥草注射液中非法添加甲氧氯普胺檢查方法[S].

Announcement No. 2448 of the Ministry of Agriculture. Determination of Metoclopramide in Houttuynia Injection[S].

[3]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2448號. 魚腥草注射液中非法添加林可霉素檢查方法[S].

Announcement No. 2448 of the Ministry of Agriculture. Determination of Lincomycin in Houttuynia Injection[S].

[4]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2448號. 魚腥草注射液中非法添加水楊酸、氧氟沙星檢查方法[S].

Announcement No. 2448 of the Ministry of Agriculture. Determination of Salicylic Acid and Ofloxacin in Houttuynia Injection[S].

[5]中國獸藥典委員會．獸藥使用指南化學藥品卷[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：32.

The Commission of Chinese Veterinary Pharmacopoeia. The Usage Guideline of Veterinary Drug( the volume of chemical drug)[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2010：32.

[6]董玲玲，曹 瑩，于曉輝，等. HPLC-PDA聯(lián)合UPLC-Q/TOF法確證硫酸卡那霉素注射液中的非法添加物[J]. 中國獸藥雜志，2016,50(8)：15-19.

Dong L L, Cao Y, Yu X H,etal. Identification of compound illegally adulterated in one batch of kanamycin sulfate injection by UPLC-Q/TOF MS and HPLC-PDA Method[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2016, 50(8): 15-19.

[7]王靜文，龔旭昊，范 強，等. 三種呼吸系統(tǒng)獸藥制劑中非法添加鹽酸溴己新、吲哚美辛的HPLC-PDA檢測方法的建立[J]. 中國獸藥雜志，2016,50(12)：45-50.

Wang J W, Gong X H, Fan Q,etal. Determination of bromhexine hydrochloride and indometcain illegally added in three veterinary preparations by HPLC-PDA[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2016, 50(12): 45-50.

[8]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2448號.阿維拉霉素預混劑中非法添加莫能菌素檢查方法[S].

Announcement No. 2448 of the Ministry of Agriculture. Determination of Monensin in Avilamycin Premix[S].

[9]中國獸藥典委員會．中華人民共和國獸藥典2015年版一部[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015：352.

The Commission of Chinese Veterinary Pharmacopoeia. the Veterinary Pharmacopoeia of the People's Republic of China[M].Beijing: China Agriculture Press, 2015：352.

[10] Heller D N, Peggins J Q, Nochetto C B,etal. LC/MS/MS measurement of gentamicin in bovine plasma, urine, milk, and biopsy samples taken from kidneys of standing animals[J]. J Chromatoger B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2005,821(1):22-30.

[11] Heller D N, Clark S B, Righter H F. Confirmation of gentamicin and neomycin in milk by weak cation-exchange extraction and electrospray ionization/ion trap tandem mass spectrometry[J]. J Mass Spectrom, 2000,35(1):39-49.

[12] A Boussairi, F Guyon. Liquid chromatographic analysis with electrochemical detection for Bromhexine Hydrochloride in human plasma[J]. Chromatographic, 1987,23(9): 651- 652.

[13] Ishii R, Horie M, Chan W,etal. Multi-residue quantitation of aminoglycoside antibiotics in kindney and meat by liquid chromatography with tandem mass spectrometry[J]. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess, 2008,25(12):1509-1519.