雞白痢沙門氏菌陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品制備用菌株的篩選

張 媛，魏財文，李 建，王秀麗，彭國瑞，張一幟，辛凌翔，蔣玉文

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

雞沙門氏菌病包括雞白痢、雞傷寒以及雞副傷寒，是影響?zhàn)B雞業(yè)的細(xì)菌性傳染病，嚴(yán)重影響雛雞成活率，也是成年雞減產(chǎn)的重要隱患之一，而且會造成其肉蛋產(chǎn)品的污染，進(jìn)而帶來或引起食品安全問題[1]。水平傳播和垂直傳播在雞白痢的流行過程中均發(fā)揮著重要作用[2]。感染雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌的種雞所產(chǎn)的蛋帶菌率高達(dá)33%[3]。雞沙門氏菌病普遍存于我國雞養(yǎng)殖業(yè)中，對養(yǎng)雞業(yè)危害極大[4-6]。

目前國內(nèi)對于雞沙門氏菌病，尤其是對雞白痢和雞傷寒還無有效的疫苗可用?？刂齐u白痢、雞傷寒最有效的措施是參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 536-2017雞傷寒和雞白痢診斷技術(shù)》[7]對雞群進(jìn)行雞白痢-雞傷寒抗體檢測，淘汰陽性雞只。雞白痢雞傷寒診斷試劑質(zhì)量直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對試劑質(zhì)量進(jìn)行評價與控制。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所是我國獸用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制、供應(yīng)的法定單位，已有多年制備雞白痢抗原和陽性血清的經(jīng)驗，但還需繼續(xù)對陽性血清進(jìn)行系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化研究。

英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)與檢定所(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC)，是世界衛(wèi)生組織WHO的一個國際標(biāo)準(zhǔn)品供應(yīng)中心，研制和供應(yīng)雞白痢沙門氏菌陽性血清標(biāo)準(zhǔn)型及變異型標(biāo)準(zhǔn)品。雞白痢陽性血清國際標(biāo)準(zhǔn)品由于制備過程復(fù)雜、需組織國際協(xié)作標(biāo)定、費用較高、供應(yīng)量少等原因，而難于被廣泛用于雞白痢雞傷寒診斷結(jié)果的確認(rèn)、診斷技術(shù)的驗證。因此，亟需研制相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品。

雞白痢沙門氏菌是研究、制備雞白痢沙門氏菌陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品的基礎(chǔ)，篩選出抗原性及免疫原性良好的制備用菌株是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立的關(guān)鍵和重要前提，對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量具有很大影響。本課題組從10株來源背景清晰的雞白痢沙門氏菌菌株中篩選出分別符合標(biāo)準(zhǔn)型菌株特性及變異型菌株特性且抗原效價較為理想的CVCC79201株菌株及CVCC79207株菌株，兩株菌均具備較好的免疫原性，可分別用于制備標(biāo)準(zhǔn)型雞白痢沙門氏菌陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品及變異型雞白痢沙門氏菌陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品。

1　材料與方法

1.1菌株備選雞白痢沙門氏菌菌株，共10株，均為CVCC保藏[8]。各菌株來源歷史如表1所示。

表1　實驗所用菌株Tab 1　Strains in the test

1.2培養(yǎng)基及試劑普通肉湯、普通瓊脂、硫代硫酸鈉瓊脂、磷酸鹽緩沖鹽水(0.07 mol/L，pH7.0～7.2)均購自北京中海動物保健科技公司。革蘭氏染色液、沙門氏菌生化鑒定管均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。國際標(biāo)準(zhǔn)品Anti-S.Pullorum Serum(S)、 Anti-S.Pullorum Serum(V)購自英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)與檢定所。沙門氏菌O9定型血清購自丹麥國家血清研究院。Premix Taq購自TaRaKa公司。MarkerⅡ購自Biomed公司。瓊脂糖購自寶生物工程(大連)有限公司。染料Goldview購自Biotium公司。細(xì)菌比濁標(biāo)準(zhǔn)管購自中國食品藥品檢定研究院。沙門氏菌O122、O123定型血清、1∶500吖啶黃溶液、PCR陰性對照品(大腸桿菌PCR產(chǎn)物)、雞白痢雞傷寒多價染色平板抗原參考品均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所細(xì)菌制品檢測室提供。

1.3PCR引物選取沙門氏菌invA基因合成引物，上游引物為5'-TGTTCGTCATTCCATTACCT-3'，下游引物為5'-ATCGGCATCAATACTCATCT-3'，引物均由上海Invitrogen公司合成。

1.4實驗動物1.5～2.0 kg健康家兔購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.5形態(tài)取菌種培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

1.6生化特性參照試劑的使用說明書進(jìn)行檢定。

1.7培養(yǎng)特性菌種接種普通肉湯和普通瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長特性。

1.8變異檢查將菌種的普通瓊脂新鮮培養(yǎng)物，與1∶500吖啶黃溶液及生理鹽水分別進(jìn)行平板凝集反應(yīng)。

1.9PCR檢測無菌操作取1.0 mL滅菌生理鹽水于1.5 mL EP管中，用接種環(huán)挑取不同菌種的菌落純培養(yǎng)物置于滅菌生理鹽水中，沸水浴5 min，放置低溫迅速冷卻，備用。PCR體系：Premix Taq 12.5 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，模板溶液2 μL，三蒸水10.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共32個循環(huán)；最后72 ℃ 5 min，20 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物電泳鑒定：配制2.0 %瓊脂糖溶液，按50 μL /L加Goldview制膠，取7 μL PCR產(chǎn)物點樣，以Marker Ⅱ作對照，120 V電泳20 min取出凝膠，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

1.10血清學(xué)特性參照試劑的使用說明書進(jìn)行檢定。

1.11抗原性鑒定用菌種接種硫代硫酸鈉瓊脂扁瓶培養(yǎng)基，收集菌苔后，調(diào)整菌液濃度為2.0×1010CFU/mL，滅活后制備成平板凝集反應(yīng)抗原。將WHO標(biāo)準(zhǔn)實驗室提供的Anti-S.Pullorum Serum(S)及Anti-S.Pullorum Serum(V)國際標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，使其終濃度分別為500 IU/mL (強(qiáng)陽性血清)及10 IU/mL (弱陽性血清)。取稀釋好的強(qiáng)陽性血清與弱陽性血清分別與反應(yīng)抗原進(jìn)行平板凝集試驗，2 min內(nèi)記錄結(jié)果。

1.12免疫原性

1.12.1免疫抗原的制備根據(jù)抗原性鑒定結(jié)果，分別選擇抗原效價最好的標(biāo)準(zhǔn)型雞白痢沙門氏菌及變異型雞白痢沙門氏菌各1株制備免疫抗原。接種硫代硫酸鈉瓊脂扁瓶，置37 ℃培養(yǎng)48 h，取純粹生長的扁瓶，吸棄凝集水，用含2 %甲醛溶液的磷酸鹽緩沖鹽水(0.07 mol/L，pH7.0～7.2)將培養(yǎng)物洗下，收集于帶玻璃珠的中性玻璃瓶中，振蕩打碎菌塊，置37 ℃滅活48 h，經(jīng)無菌檢驗合格后，無水乙醇沉淀濃縮，以細(xì)菌比濁標(biāo)準(zhǔn)管為標(biāo)準(zhǔn)確定其濃度。保存于2～8 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.12.2免疫程序家兔靜脈注射免疫原6次，免疫劑量分別為1.0×109、2.0×109、4.0×109、8.0×109、1.6×1010、3.2×1010CFU/只，每次間隔7日，末次注射7日后試血。如血清效價不夠，再用最后免疫劑量注射1次，當(dāng)血清效價達(dá)到1∶2560以上，方可采血。

1.12.3血清制造以常規(guī)方法采血，提取血清，按血清總量的0.02%加入硫柳汞。

1.12.4血清效價測定用菌種接種硫代硫酸鈉瓊脂扁瓶培養(yǎng)基，收集菌苔后，調(diào)整菌液濃度為1.0×109CFU/mL，滅活后制備成試管凝集反應(yīng)抗原。將血清稀釋成1∶400、1∶800、1∶1600……1∶12800等稀釋度；同法稀釋Anti-S.Pullorum Serum(S)及Anti-S.Pullorum Serum(V)國際標(biāo)準(zhǔn)品。吸取每個稀釋度的血清加入試管中，每管1.0 mL，每管加入試管凝集反應(yīng)抗原1.0 mL?？乖瓕φ諡楹?.5 %苯酚生理鹽水1.0 mL與試管凝集反應(yīng)抗原1.0 mL混合，觀察是否有自凝現(xiàn)象。振搖混勻后，置37 ℃反應(yīng)20 h，然后置室溫2 h，記錄結(jié)果。

2　結(jié)　果

2.1形態(tài)經(jīng)染色觀察，10株菌均為革蘭氏陰性小桿菌。

2.2生化特性10株菌的生化特性均符合沙門氏菌的特性。

2.3培養(yǎng)特性10株菌在普通肉湯中的生長均為一致混濁，在普通瓊脂平板上均生長為光滑濕潤、微隆起、半透明的圓整菌落。

2.4變異檢查經(jīng)平板凝集試驗，10株菌與1∶500吖啶黃溶液和生理鹽水均不發(fā)生凝集。

2.5PCR檢測用根據(jù)沙門氏菌invA基因合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，10株菌均可擴(kuò)增出395 bp的特異性條帶，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

M：Marker Ⅱ；1：陰性對照：大腸桿菌；2：79207株；3：79201株；4：532株；5：531株；6：530株；7：529株；8：528株；9：527株；10：526株；11：523株M: Marker Ⅱ; 1: Negative control: E.coli; 2: CVCC79207 strain; 3: CVCC79201 strain; 4: CVCC532 strain; 5:CVCC531 strain; 6: CVCC530 strain; 7: CVCC529 strain; 8: CVCC528 strain; 9: CVCC527 strain; 10: CVCC526 strain; 11: CVCC523 strain圖1　10株菌invA PCR產(chǎn)物的電泳Fig 1　Electrophoresis of invA PCR products from 10 strains

2.6血清學(xué)特性經(jīng)平板凝集試驗，CVCC523、526、527、528、79201株菌的血清型為沙門氏菌O9、O123，為標(biāo)準(zhǔn)型雞白痢沙門氏菌；CVCC529、530、531、532、79207株菌的血清型為沙門氏菌O9、O122，為變異型雞白痢沙門氏菌。

2.7抗原性鑒定經(jīng)抗原性鑒定，CVCC523、526、527、528、529、530、531、532、79201、79207株菌制備的抗原與WHO標(biāo)準(zhǔn)實驗室提供的Anti-S.Pullorum Serum(S)及Anti-S.Pullorum Serum(V)國際標(biāo)準(zhǔn)品的強(qiáng)陽性血清和弱陽性血清均能發(fā)生不同程度的凝集反應(yīng)，但標(biāo)準(zhǔn)型菌株中的CVCC79201株及變異型菌株中的CVCC79207株制備的抗原與國際標(biāo)準(zhǔn)品Anti-S.Pullorum Serum(S)及Anti-S.Pullorum Serum(V)的凝集效價均高于其它抗原，效價測定結(jié)果見表2。平板凝集反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)：++++表示出現(xiàn)明顯的顆粒狀或片狀凝集，液體完全透明，即100%凝集；+++表示出現(xiàn)明顯的顆粒狀或片狀凝集，但液體微現(xiàn)混濁，即75%凝集；++表示出現(xiàn)均勻一致的凝集顆粒，液體中等混濁，即50%凝集；+表示出現(xiàn)細(xì)微顆粒，液體混濁不透明，即25%凝集；-表示未出現(xiàn)凝集，液體完全混濁不透明，即無凝集。當(dāng)50 μL抗原與50 μL含0.5%苯酚生理鹽水無凝集(-)時試驗成立。

表2　10株菌的抗原性鑒定結(jié)果Tab 2　Antigenic characteristics of 10 strains

經(jīng)形態(tài)、生化特性、培養(yǎng)特性、變異檢查、PCR檢測結(jié)果表明，CVCC523、526、527、528、529、530、531、532、79201、79207均為沙門氏菌。根據(jù)血清學(xué)特性、抗原性鑒定結(jié)果，CVCC79201株及CVCC79207株分別符合雞白痢沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)型菌株及變異型菌株的特性，且抗原效價最為理想。

2.8免疫原性免疫CVCC79201株制備的標(biāo)準(zhǔn)型抗原的6只家兔血清試管凝集效價均高于Anti-S.Pullorum Serum(S)國際標(biāo)準(zhǔn)品血清效價，免疫CVCC79207株制備的變異型抗原的6只家兔血清試管凝集效價均高于Anti-S.Pullorum Serum(V)國際標(biāo)準(zhǔn)品血清效價，見表3、表4。試管凝集反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)：++++表示抗原呈堅實凝塊或呈細(xì)沙粒樣均勻鋪于孔底，且孔底不可見抗原沉積，即100%凝集；+++表示抗原均勻鋪于孔底，邊緣可有卷曲，且孔底可見微量抗原沉積，即75%凝集；++表示抗原沉積于孔底，可形成扣狀或環(huán)狀，孔底沉積的抗原明顯少于生理鹽水對照，且沉積的抗原四周有明顯凝集顆粒，即50%凝集；+表示抗原沉積于孔底，可形成扣狀或環(huán)狀，孔底沉積的抗原略小于生理鹽水對照，且沉積的抗原的四周有少量凝集顆粒，即25%凝集；-表示抗原沉積于孔底，邊緣光滑整齊，且不可見凝集顆粒者，即無凝集。判定時應(yīng)按血清最終稀釋度計算，如第一管中血清稀釋倍數(shù)為1∶400，其加入等量抗原后最終稀釋度為1∶800。當(dāng)抗原對照無凝集(-)時試驗成立，以出現(xiàn)不低于"++"凝集的最高血清最終稀釋度判定為血清效價。

可見，CVCC79201株及CVCC79207株均具備較好的免疫原性，故選用標(biāo)準(zhǔn)型雞白痢沙門氏菌CVCC79201株作為制備雞白痢沙門氏菌陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)型)的生產(chǎn)菌株，選用變異型雞白痢沙門氏菌CVCC79207株作為制備雞白痢沙門氏菌陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品(變異型)的生產(chǎn)菌株。

表3　抗雞白痢沙門氏菌血清(標(biāo)準(zhǔn)型)效價測定結(jié)果Tab 3　Potency of Anti-S.Pullorum Serum(S)

表4　抗雞白痢沙門氏菌血清(變異型)效價測定結(jié)果Tab 4　Potency of Anti-S.Pullorum Serum(V)

3　討　論

根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》二〇一五年版[9]規(guī)定，雞白痢、雞傷寒多價染色平板凝集試驗陽性血清診斷試劑制備方法中要求使用雞白痢沙門氏菌陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)定。但是，雞白痢沙門氏菌陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品尚未形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化的制備規(guī)程。課題組按照《中華人民共和國獸藥典》二〇一五年版及《獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇年版相關(guān)要求，開展雞白痢沙門氏菌陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品的研制工作。生產(chǎn)用菌株是制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最主要的原材料，菌株自身的特性直接關(guān)系到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量，因此選定生產(chǎn)用菌種是研制雞白痢沙門氏菌陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品的首要工作。

英國威橋國際生物標(biāo)準(zhǔn)品實驗室(NIBSC)是WHO的一個國際標(biāo)準(zhǔn)品供應(yīng)中心實驗室。美國國家獸醫(yī)服務(wù)實驗室(NVSL)和瑞典國家獸醫(yī)研究所(SVA)是分別隸屬于美國農(nóng)業(yè)部和瑞典農(nóng)業(yè)部領(lǐng)導(dǎo)的動物疫病診斷官方權(quán)威機(jī)構(gòu)，均是國家獸醫(yī)參考實驗室。10株備選菌株多數(shù)是中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心從此三個實驗室引進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，背景清晰、毒力強(qiáng)、免疫原性穩(wěn)定，適宜用作制備陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品的候選菌株。

CVCC79201株及CVCC79207株菌完全符合雞白痢沙門氏菌的特性，而且具備良好的抗原性及免疫原性，可以作為制備雞白痢沙門氏菌陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)型)及雞白痢沙門氏菌陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品(變異型)的生產(chǎn)用菌株。標(biāo)準(zhǔn)型雞白痢沙門氏菌CVCC79201株抗原制備的抗血清效價均不低于1∶12800，變異型雞白痢沙門氏菌CVCC79207株抗原制備的抗血清效價均不低于1∶6400，均高于標(biāo)準(zhǔn)型及變異型雞白痢沙門氏菌陽性血清國際標(biāo)準(zhǔn)品1∶1600的血清效價，這不僅保證了用此兩株菌制備的國家標(biāo)準(zhǔn)血清含有不低于國際標(biāo)準(zhǔn)血清的活性物質(zhì)，而且可獲得較高的產(chǎn)量。制備出的雞白痢沙門氏菌陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品將作為實物標(biāo)尺用于雞白痢沙門氏菌抗原參考品、診斷試劑以及雞白痢沙門氏菌陽性血清診斷試劑的效價標(biāo)定，減少不同廠家及同一廠家不同批次產(chǎn)品間差異，使種雞場雞白痢抗體檢測結(jié)果更準(zhǔn)確，從而促進(jìn)雞白痢凈化工作的開展。

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