疫苗穩(wěn)定性方法研究進展

高帆 李克雷 吳星 徐苗 梁爭論

102629北京，中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所（高帆、李克雷、吳星、徐苗、梁爭論），北京民海生物科技有限公司（李克雷）

疫苗是以病原微生物或其組成成分、代謝產(chǎn)物作為免疫原，能夠誘導特定的主動保護性免疫，用于預防、治療人類相應疾病的生物制品。疫苗穩(wěn)定性是疫苗在效期內(nèi)保持理化、微生物和生物學特性的能力。為保證疫苗質(zhì)量，需對疫苗生產(chǎn)中間產(chǎn)物、原液、成品及運輸、儲存直至效期末的全疫苗生命周期進行穩(wěn)定性研究。疫苗的效力隨儲存時間的延長及儲存條件的變化而逐漸下降。根據(jù)疫苗組成成分的生物活性及理化性質(zhì)的不同，疫苗的穩(wěn)定性特點也存在很大差異。疫苗效力在不同儲存條件下的下降曲線是制訂疫苗效期、確定疫苗儲運條件的主要依據(jù)。根據(jù)對熱和凍結(jié)穩(wěn)定性的差異，疫苗可分為熱敏感性疫苗和凍結(jié)敏感性疫苗。前者主要包括減毒活疫苗，如口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗（OPV），凍干乙型腦炎減毒活疫苗等；后者主要為含鋁佐劑滅活及重組病毒樣顆粒（VLP）疫苗，如甲肝滅活疫苗和重組乙肝疫苗等。因此設計完善的穩(wěn)定性研究方案，在研發(fā)階段、臨床試驗階段以及上市后有效評價疫苗的穩(wěn)定性，是全面了解研究疫苗特性，完成上市審批以及保證上市后疫苗安全有效的基礎。

世界衛(wèi)生組織（WHO）于1989年首次頒布“疫苗穩(wěn)定性” 文件（WHO／EPI／GEN／89.08）［1］，并在1998 年進行了修訂（WHO／GPV／98.07）［2］，2006 年頒布了“疫苗溫度敏感性”文件［3］，明確指出需關注凍結(jié)對疫苗質(zhì)量的影響。在同年頒布的《疫苗穩(wěn)定性評價指南》［4］中提出需按照不同疫苗的特點設計穩(wěn)定性研究參數(shù)；在疫苗研發(fā)、臨床試驗、上市后監(jiān)測等不同階段均需進行穩(wěn)定性評價；提出應重視穩(wěn)定性研究設計、選擇適當統(tǒng)計方法并進行合理的數(shù)據(jù)分析。為推動疫苗在冷鏈難以推廣國家和地區(qū)的應用，2012年WHO頒布了疫苗溫度控制鏈（CTC）指南［5］。2013年為評估擴大計劃免疫疫苗穩(wěn)定性，并考慮符合批準儲存條件的可行性，WHO頒布了擴展控制溫度條件（ECTC）指導原則，為脫冷鏈狀態(tài)下疫苗的穩(wěn)定性評價提供了指南［6］。

中國藥典（2015版）三部新增的人用疫苗總論中，首次對疫苗穩(wěn)定性評價進行了規(guī)定，并對疫苗貯運提出了要求［7］。國家藥品審評中心（CDE）頒布了《生物制品穩(wěn)定性研究技術指導原則》，對生物制品原液、成品或中間產(chǎn)物等的穩(wěn)定性研究設計、結(jié)果分析等進行了明確規(guī)范［8］。2017年國家衛(wèi)生和計劃生育委員會和食品藥品監(jiān)管總局頒布了《疫苗運輸和儲存管理規(guī)范》［9］，保證疫苗在運輸過程中的穩(wěn)定性。同年CDE年頒布了《生物制品上市后變更研究技術指導原則（征求意見稿）》，對變更進行的相關穩(wěn)定性研究提出了具體要求［10］。

1 研究目標

穩(wěn)定性評價是疫苗質(zhì)量和安全性監(jiān)管的重要部分；穩(wěn)定性研究是產(chǎn)品質(zhì)量標準制訂的基礎，可用于合理選擇產(chǎn)品生產(chǎn)工藝、制劑處方及包裝材料，是貫穿于整個藥品研發(fā)階段和支持藥品上市及上市后的研究。穩(wěn)定性研究目標在疫苗各個生命周期中有所不同［3］，分別為：（1）研發(fā)階段：確定疫苗有效期和儲存條件，并支持批準上市。包括研究前期應對疫苗中間品、原液、成品等階段各制劑處方組分的生物活性、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)完整性進行監(jiān)測。研究后期開展與器皿封閉性、完整性相關的參數(shù)研究等；（2）上市后階段：研究上市疫苗與臨床疫苗的一致性，確保上市疫苗的安全性和有效性，同時應對1批或多批疫苗進行長期穩(wěn)定性監(jiān)測；（3）通過闡明不同工藝制造的產(chǎn)品可比性支持工藝變更［4］，要求采用變更后工藝生產(chǎn)至少3批疫苗，與現(xiàn)有工藝生產(chǎn)的至少3批疫苗在不少于3個溫度點的基礎上進行比較研究。為了節(jié)約時間和避免無菌監(jiān)測的假陽性結(jié)果，溫度和時間的選擇應根據(jù)特定疫苗的穩(wěn)定性而定。加速穩(wěn)定性研究的方案應按照疫苗特性變化的溫度和時間而設計，并且通過檢測初始時間和最終時間時疫苗穩(wěn)定性參數(shù)，計算疫苗在各溫度條件下的降解率。通過比較不同工藝同一溫度下疫苗的降解率，評價新工藝的可行性。另外，熱加速穩(wěn)定性可在疫苗早期研發(fā)階段進行，為確定有效期提供數(shù)據(jù)支持，也可協(xié)助評估疫苗在工藝變更后的穩(wěn)定性，但不可用于預測疫苗的實時、真實狀態(tài)的穩(wěn)定性。

2 研究設計

開展穩(wěn)定性研究需要科學的方案設計，合理設定檢測批次、樣本數(shù)量、頻次和時間間隔。目前應用于藥品及疫苗穩(wěn)定性評價常用的時間點為3、6、9、12和18個月，但其后每6個月作為檢測的時間點不一定適合所有疫苗，應依據(jù)所研究疫苗的特性選擇適當?shù)臋z測時間點；檢測參數(shù)應選擇與臨床相關的、敏感的、可表征疫苗免疫原性或療效的指標；疫苗穩(wěn)定性研究過程中，不但需要考慮蛋白、多糖、脂質(zhì)等疫苗的活性成分，還需同時關注疫苗的佐劑、稀釋劑等制劑組分以及包裝瓶、膠塞等包裝材料的影響；在數(shù)據(jù)分析時應選擇適宜的統(tǒng)計學分析方法；可通過穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)外推定義有效期。此外，由于生物學檢測的固有變異性，標準物質(zhì)的制備和使用對檢測的準確性和可靠性至關重要。

3 檢測指標和方法

檢測指標應能表征疫苗的免疫原性或療效，以及與經(jīng)臨床試驗證明的效力或安全性之間的聯(lián)系。疫苗效價是反映疫苗質(zhì)量的關鍵指標，也是用于考察疫苗穩(wěn)定性或降解程度的重要指標。對于大多數(shù)疫苗，效價指標可反映穩(wěn)定性（降解）對疫苗的免疫原性和保護效果產(chǎn)生的影響。根據(jù)疫苗特性的不同，效價檢測方法也各不相同，包括體內(nèi)效力或體外效力檢測方法，應與相應疫苗批簽發(fā)放行的效價檢測方法一致。但體內(nèi)和體外效力試驗的缺點在于其往往受到多種生物變化因素的影響。除了效價，抗原含量和特定毒性也可反應疫苗的活性，可借助特異抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）得到定量檢測結(jié)果。其它檢測參數(shù)還包括組胺致敏試驗（百日咳疫苗）、游離多糖水平、佐劑解吸、佐劑聚集等。

疫苗效價的檢測方法依據(jù)疫苗的品種，以及各企業(yè)產(chǎn)品的特點有所不同（詳見藥典各論及附錄）。病毒滴度半數(shù)細胞感染劑量（CCID50）的檢測可用于直接研究減毒活疫苗中間品和／或成品的穩(wěn)定性，如麻疹／腮腺炎／風疹（麻腮風）疫苗、OPV疫苗、凍干甲肝減毒活疫苗和流感減毒活疫苗等；對于多數(shù)滅活疫苗，效價只能用于成品穩(wěn)定性的檢測，如脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗（IPV）、腸道病毒71型（EV-A71）滅活疫苗等；由于體外相對效力檢測方法具有準確定量、重復性好和符合3R原則等優(yōu)點，在得到穩(wěn)定的體內(nèi)效力和體外效力相關關系后，可采用體外相對效力檢測方法代替體內(nèi)法，如甲肝滅活疫苗和乙肝疫苗；抗原檢測是依據(jù)免疫學原理，通過標記抗體以及單抗結(jié)合等方法（如ELISA法），評價疫苗抗原結(jié)構(gòu)的完整性。對于肺炎多糖疫苗和結(jié)合多糖疫苗，可通過游離糖檢測方法準確反映疫苗穩(wěn)定性。

鋁佐劑具有增強免疫效果的作用，如果在外界環(huán)境壓力作用下發(fā)生解聚或聚集，可引起疫苗效力不可逆的下降［11］。WHO建立了SHAKE TEST方法用于評價疫苗凍結(jié)后質(zhì)量評價。該方法通過比較凍結(jié)前后疫苗沉降率的差異，了解疫苗是否受到冷凍的損傷［12］。另外，近年來采用儀器法和免疫學方法評價疫苗穩(wěn)定性的報道增多。儀器法主要檢測疫苗抗原的分子大小和結(jié)構(gòu)，如掃描電鏡法、質(zhì)譜法、流式細胞術等均可用于觀察鋁佐劑疫苗的聚集程度；而免疫學方法則是通過標記抗體以及單抗結(jié)合等方法評價疫苗抗原結(jié)構(gòu)的完整性。

Estey等［13］采用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF）結(jié)合肽圖的檢測方法，評價佐劑結(jié)合的肉毒桿菌三價疫苗rBoNT（Hc）蛋白抗原的化學完整性。研究表明在長期儲存條件下，鋁鹽佐劑可影響蛋白的化學穩(wěn)定性和／或化學降解路徑。Feinstein等［14］為了解沙眼衣原體外膜蛋白nMOMP在穩(wěn)定劑Amphipols中的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，應用多種光譜技術鑒別其二級（圓二色）、三級和四級結(jié)構(gòu)（免疫組化和凝膠電泳），以及聚集狀態(tài)（光散射）。通過核磁共振檢測15N標記的nMOMP蛋白，在Amphipols中可檢測到nMOMP暴露的外環(huán)結(jié)構(gòu)，表明Amphipols可提高膜蛋白為組分的疫苗穩(wěn)定性。 Stergaard 等［15］通過單抗標記 Gardasil? 、Silgard?和Cervarix?3種凍結(jié)前后HPV疫苗，流式細胞術分析結(jié)果顯示不同的HPV疫苗具有不同的熒光顆粒峰。凍結(jié)后的HPV疫苗經(jīng)檸檬酸／磷酸鹽緩沖液解離后發(fā)現(xiàn)抗原降解為較小的顆粒，證實該方法可用于鑒別佐劑凍結(jié)對HPV疫苗質(zhì)量的影響。Ye等［16］應用柯薩奇病毒A組16型（CA16）抗原實心（F）和空心（E）顆粒的單抗，建立了評價CA16顆粒熱穩(wěn)定性的ELISA方法。感染了CA16的細胞培養(yǎng)上清中含有成熟的F顆粒、E顆粒和變性顆粒。56℃加熱1 min后F顆粒失去活性，變性顆粒和E顆粒含量上升，提示F顆?？赡苻D(zhuǎn)變?yōu)樽冃灶w粒或E顆粒。

4 上市疫苗的穩(wěn)定性研究

4.1 WHO對上市疫苗穩(wěn)定性的分析報告 為了解疫苗的穩(wěn)定性，WHO在2006年的指南文件中對近20種疫苗包括白喉／百日咳／破傷風疫苗（白百破疫苗）、乙肝疫苗、多糖和多糖結(jié)合疫苗、卡介苗、麻腮風疫苗、黃熱病疫苗、OPV和IPV等，以及8種其它疫苗包括口服輪狀病毒疫苗、乙型腦炎疫苗、傷寒疫苗、霍亂疫苗、甲肝滅活疫苗、狂犬病毒疫苗、流感病毒疫苗和水痘疫苗等的熱敏感性、凍結(jié)敏感性和不同溫度下的穩(wěn)定性進行了歸納總結(jié)。其中12種疫苗為凍結(jié)敏感性疫苗，包括破傷風／白喉疫苗（單價及聯(lián)合疫苗）、乙肝疫苗、百日咳疫苗、IPV疫苗、肺炎多糖疫苗、肺炎結(jié)合疫苗、甲肝滅活疫苗、傷寒霍亂滅活疫苗凍結(jié)后可影響疫苗質(zhì)量，流感和水痘減毒活疫苗可冷凍保存，但溶解后不能重新凍結(jié)［3］。2015年，WHO依據(jù)疫苗的熱敏感性由高到低排列將疫苗分為6組，其中A組為OPV，B組為流感疫苗，C組包括IPV、凍干麻風或麻風二聯(lián)或麻風腮三聯(lián)疫苗；D組包括霍亂、百白破、麻疹、風疹、輪狀、黃熱等疫苗；E組包括BCG、HPV疫苗、破傷風等，F(xiàn)組包括乙肝疫苗、凍干流感嗜血桿菌疫苗（Hib）、流腦疫苗等［17］。

4.2 新研發(fā)上市疫苗的穩(wěn)定性

4.2.1 HPV 疫苗：Shank-Retzlaff等［18］應用體外相對效力（IVRP）和示差掃描量熱法（DSC）方法，評價默克公司Gardasil?疫苗的熱穩(wěn)定性。疫苗樣本置于4℃到42℃，檢測不同時間點的IVRP，結(jié)果表明Gardasil?具有較好的穩(wěn)定性。疫苗在25℃時半衰期預計大于130個月；37℃時，半衰期為18個月；42℃時約為3個月。對3批疫苗在64℃條件下放置40 min后檢測IVRP和ED50，結(jié)果顯示熱加速疫苗與4℃對照疫苗IVRP蛋白比值分別為：0.50～0.67，0.95～1.18；ED50分別為 0.52 ～0.77，0.10 ～0.13。顯示熱處理導致IVRP下降約50%，ED50升高4～7倍。應用DSC評價在溫度快速升高條件下蛋白變性的過程，發(fā)現(xiàn)四種HPV單價成分的DSC特性不同，提示氨基酸結(jié)構(gòu)細微的改變可顯著影響與穩(wěn)定L1蛋白有關的分子間的聯(lián)系，并與VLP裝配有關。該研究還認為，VLP疫苗相對較穩(wěn)定，同時通過比較液相疫苗和佐劑疫苗熱處理后的IVRP，認為該疫苗的鋁佐劑有助于疫苗抗原保持穩(wěn)定。

4.2.2 戊型肝炎（HE）疫苗：Zhang 等［19］應用小鼠體內(nèi)效力和體外抗原方法評價12批2～8℃條件下儲存24個月的預充注射器HE疫苗（Hecolin?）的穩(wěn)定性；采用分析超速離心法、高效體積排阻色譜法和透射電子顯微鏡評估佐劑中解離的P239 VLP顆粒特性；應用DSC對吸附抗原的熱及構(gòu)象穩(wěn)定性進行評估；應用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和銀染，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LCMS）和MALDI-TOF方法考察解離抗原蛋白的完整性；應用表位表面等離子共振（SPR）檢測法和基于單克隆抗體夾心ELISA法測定中和抗體結(jié)合活性和疫苗的抗原性。結(jié)果顯示預充HE疫苗2～8℃儲存24個月抗原結(jié)構(gòu)和功能特性未發(fā)生改變，疫苗具有較好的穩(wěn)定性。

4.2.3 口服輪狀病毒疫苗：Naik等［20］對印度SIIPL公司研發(fā)的口服輪狀病毒疫苗進行了穩(wěn)定性評價。該疫苗為減毒活疫苗，含G1，G2，G3，G4和G5等5個血清型，以蔗糖-甘氨酸為保護劑。疫苗可在25℃條件下保存36個月，37℃和40℃條件下保存18個月，可短暫暴露于55℃條件下。并證實該疫苗在-20℃冷凍至42℃環(huán)境溫度均耐受。該疫苗被認為是首個經(jīng)實驗室和臨床試驗驗證的熱穩(wěn)定疫苗［21］。

5 小結(jié)

疫苗穩(wěn)定性研究是保證疫苗安全有效的基礎。我國疫苗產(chǎn)能居世界首位，疫苗質(zhì)量達到國際水平，且近年來有多種新型疫苗成功上市，但關于疫苗穩(wěn)定性研究的報道較少。迫切需要開展疫苗穩(wěn)定性相關研究工作。在穩(wěn)定性研究方案設計時，應依據(jù)研究目標的不同進行科學、周密的設計，選擇適宜的監(jiān)測方法和指標。在疫苗研發(fā)階段，應充分考慮疫苗穩(wěn)定性對其質(zhì)量和應用的影響，包括疫苗的劑型和保護劑，以及疫苗接種可能面臨的瓶頸。對已上市的疫苗制品，需考慮在保證冷鏈儲運的前提下進行有效的穩(wěn)定性監(jiān)測，保證疫苗的安全有效。

利益沖突無