ELISA聯(lián)合NAT技術(shù)在獻血者血液篩查和輸血殘余風(fēng)險分析中的應(yīng)用

徐利強 李建華 倪修文 孫亞云 吳瑾惠 毛惠娜

314000嘉興市中心血站

輸血是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染途徑之一［1］。我國采供血機構(gòu)現(xiàn)主要通過2種不同產(chǎn)家酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒檢測獻血者血液HBsAg判斷是否存在HBV感染，有效降低了輸血HBV感染的發(fā)生率。但獻血人群中存在一定比例的窗口期（WP）感染和隱匿性感染（OBI）HBV感染者，其HBsAg檢測呈陰性，此部分血液輸血存在HBV感染風(fēng)險［2-3］。核酸擴增檢測技術(shù)（NAT）是近年在獻血者血液篩查中開展的病毒核酸檢測方法［4］。本研究用ELISA聯(lián)合NAT技術(shù)對獻血者進行血液檢測，并對HBsAg-／HBV DNA＋進行HBV DNA定量和血清學(xué)分析，旨在探討屏蔽HBsAg-且NAT單反應(yīng)樣本對預(yù)防經(jīng)輸血傳播HBV的意義。

1 材料與方法

1.1 血標(biāo)本來源 2015年1月至2015年12月嘉興市中心血站按 《獻血者健康檢查要求》（GB18467-2011）經(jīng) ALT、HB、HBsAg和 TP 聯(lián)合金標(biāo)試劑條初篩合格，采集45 551份獻血者血液樣本，同步留取兩份血液樣本各5 ml（EDTA抗凝）。26 101份和19 450份來自男性和女性，年齡18～60歲。

1.2 OBI和WP確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn) OBI確認(rèn)需要滿足下面兩個條件：①血液標(biāo)本血液篩查和補充鑒別試驗后確定病毒類型為HBsAg-／HBV DNA＋；②血液標(biāo)本首次檢測出乙肝表面標(biāo)志物或乙肝三系結(jié)果全陰，在追蹤回溯時其血清學(xué)乙肝表面標(biāo)志物不發(fā)生明顯變化。WP確認(rèn)需要滿足下面幾個條件：①血液標(biāo)本血液篩查和補充鑒別試驗后確定病毒類型為HBsAg-／HBV DNA＋；②血液標(biāo)本首次檢測乙肝三系血清學(xué)結(jié)果全陰，在追蹤回溯時其HBsAg轉(zhuǎn)陽，以及其他標(biāo)志物也陸續(xù)出現(xiàn)。

1.3 HBsAg和HBV-DNA定性檢測 對初篩為HBsAg陰性的血標(biāo)本采用2種不同的酶免疫試劑盒（北京萬泰、廈門新創(chuàng)、上?？迫A和意大利索靈生產(chǎn)）酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測HBsAg選出HBsAg-樣本。采用美國諾華檢測系統(tǒng)（Procleix Tigris）進行三聯(lián)熒光病毒單人份核酸擴增檢測技術(shù)（NAT）檢測，對有反應(yīng)的標(biāo)本再進行核酸鑒別試驗來檢測病毒類型，以確定HBV DNA是否為陽性（HBV DNA＋）。上述檢測獲得HBsAg-／HBV DNA＋樣本。

1.4 乙肝兩對半檢測 所有HBsAg-／HBV DNA＋樣本 ELISA檢測血清標(biāo)志物抗-HBs（HBsAb）、HBeAg、抗-HBe（HBeAb）和抗-HBc（HBcAb）（試劑盒購自上海榮盛）。乙肝兩對半檢測結(jié)果均陰性的HBV DNA＋獻血者，多為HBV感染窗口期，進一步跟蹤隨訪確定結(jié)果。

1.5 HBV病毒載量測定 采用實時熒光-PCR（RT-PCR）進行 HBV DNA定量，檢測儀器為 ABI 7500實時熒光PCR儀，試劑盒購自廣州中山達安基因股份有限公司，檢測下限為20 IU／ml。按說明書提示提取研究對象的HBV DNA，選用北京康徹斯坦低值和高值為HBV室內(nèi)質(zhì)控品。PCR參數(shù)：93℃2 min；93 ℃ 45 s、55 ℃ 60 s，10 個循環(huán)；93 ℃ 30 s、55℃ 45 s，30個循環(huán)至反應(yīng)結(jié)束。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理，對分類變量資料采用用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OBI分布 45 551份獻血者樣本中，44份HBsAg-／HBV-DNA＋，其中3份乙肝兩對半檢測結(jié)果均為陰性，作窗口期處理，按窗口期進行跟蹤隨訪，隨訪結(jié)果2例出現(xiàn)血清學(xué)標(biāo)志物轉(zhuǎn)，另1例血清學(xué)標(biāo)志物幾乎無明顯變化，根據(jù)OBI和WP確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，確認(rèn)OBI 42例，WP2例。42份獻血者確認(rèn)OBI，檢出率為0.90‰，33例 OBI為男性 OBI檢出率1.26‰（33／26101），9 例女性 OBI檢出率 0.46‰（9／19 450）不同性別獻血人群OBI檢出率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝7.77，P ＜0.01）。 15例 OBI來自首次獻血者檢出率0.63‰（15／23 732），27例OBI來自重復(fù)獻血者檢出率1.24‰（27／21819），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝4.59，0.01＜P＜0.05）。3組年齡組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝20.91，P＜0.01），以41～60歲年齡組獻血者 OBI檢出率最高1.84‰，明顯高于其他組（χ2＝16.37和5.92，P＜0.05）為比例最高。 見表1。

表1 總獻血者篩查人數(shù)與隱匿性乙肝（OBI）人群一般資料的分布特征Tab.1 Distribution characteristics of the general data of screening for total blood donors and occult hepatitis B infection （OBI） population

2.2 HBsAg-／HBV-DNA＋樣本HBV DNA定量檢測結(jié)果 42份OBI樣本HBV DNA濃度范圍＜20～1.82 ×103IU／ml，中位數(shù) 32.6 IU／ml，HBV DNA 濃度＜20 IU／ml的 32份占 OBI樣本 76.2%，HBV DNA濃度范圍為20～100 IU／ml的8份占OBI樣本19.0%，另有2份 HBV DNA濃度 ＞100 IU／ml占OBI樣本4.8%。2份WP樣本HBV DNA分別為61.5 IU／ml和 24.1IU／ml。

表2 HBsAg-／HBV-DNA＋樣本血清學(xué)檢測結(jié)果Tab.2 HBsAg-／HBV-DNA ＋ sample serological test results

2.3 HBsAg-／HBV-DNA＋樣本血清學(xué)檢測結(jié)果見表2。44份NAT單反應(yīng)陽性樣本中2份來自WP獻血者，42份來自O(shè)BI獻血者。OBI獻血者中5項血清學(xué)檢測指標(biāo)全部陰性（模式-1）1份（2.3%）；模式-2除HBsAb陽性外，其余4項血清學(xué)指標(biāo)陰性共2份（4.8%）；模式-3為指標(biāo)HBcAb單項陽性共 4份占9.5%；模式-4為 HBeAb和HBcAb同時陽性共8份占19.0%；模式-5為HBsAb和HBcAb同時陽性共22份占52.4%（為本研究最常見血清學(xué)模式）；模式-6為 HBsAb、HBeAb和HBcAb同時陽性共5份占11.9%。5項血清學(xué)檢測結(jié)果HBcAb陽性最多39例占92.9%，其中30份（76.9%）HBV DNA 定量 ＜20 IU／ml（HBV DNA 確認(rèn)陰性），9份（23.1%）HBV DNA定量≥20 IU／ml確認(rèn)陽性。HBeAb和 HBcAb同時陽性13份占29.5%，其中11份（84.6%）HBV DNA定量 ＜20 IU ／ml。

3 討論

HBV感染呈全球流行，我國人群HBsAg攜帶率為7.18%，HBV感染的主要方式是通過血液傳播，因此對獻血者血液進行HBV篩查和HBV感染殘余風(fēng)險檢測仍是保證輸血安全的重要環(huán)節(jié)［5］。文獻報道ELISA檢測血清HBsAg結(jié)果呈陰性導(dǎo)致獻血者存在HBV感染漏檢可能，常見的有OBI和WP兩種特殊的HBV感染狀態(tài)［2-3］。隨著核酸檢測技術(shù)的廣泛應(yīng)用，《2015版血站技術(shù)操作規(guī)程》推薦用ELISA和NAT聯(lián)合檢測獻血者血液，具有更好的靈敏度的NAT用于獻血者血液篩查，旨在利用NAT提高低水平的HBV DNA的OBI人群的檢測效率。本研究用ELISA和NAT聯(lián)合檢測45 551份經(jīng)過初篩的獻血者樣本，3份疑似WP按規(guī)定進行跟蹤隨訪，隨訪結(jié)果2例出現(xiàn)血清學(xué)標(biāo)志物轉(zhuǎn)陽，另1例血清學(xué)標(biāo)志物幾乎無明顯變化，最終確認(rèn)分別有2份和42份為 WP和 OBI。OBI檢出率 1∶1 085（0.92‰）與中國臺灣1∶1 022 接近［6］，高于西安 1∶1 628［7］、大連 1∶2 293［8］、深圳 1∶3031 和亞洲東南亞地區(qū)的報道［9］，但低于福建 1∶569［10］、遠(yuǎn)低于西非加納城市人口的1：67［11］。 與上述研究一致，不同性別、年齡和獻血次數(shù)與OBI檢出率的有統(tǒng)計學(xué)差異。本研究用的RT-PCR試劑盒檢測下限為20 IU／ml，結(jié)果42例 OBI獻血者血液中 32份 HBV DNA濃度＜20IU／ml、8份HBV DNA濃度范圍在20～100 IU／ml，而2份 WP血清 HBV DNA濃度分別是61.48 IU／ml和 24.10IU／ml，OBI和 WP 獻血者血液病毒載量都非常低，提示利用NAT技術(shù)可有效檢出獻血者血清中HBV-DNA，極大地降低了輸血感染 HBV 的風(fēng)險［12］。

NAT技術(shù)應(yīng)用HBsAg-獻血者血液HBV核酸檢測可有效降低輸血感染HBV的風(fēng)險，主要原因有：①NAT為定性檢測有較高靈敏度，本研究用的RTPCR定量試劑盒檢測下限為20 IU／ml，結(jié)果30份OBI獻血者中HBV DNA定量＜20 IU／ml、8份HBV DNA濃度范圍在20～100 IU／ml，2份WP血清HBV DNA 濃度分別是61.48 IU／ml和24.10IU／ml，40 份低拷貝血液用定性NAT檢測HBV DNA均能有效檢出。②本研究中有1例疑似窗口獻血者跟蹤結(jié)果血清標(biāo)志物沒有變化可能是OBI的S區(qū)基因突變導(dǎo)致“a”決定簇（124-147AA）和主要親水區(qū)（MHR，99-169AA）氨基酸的改變，影響HBsAg表達，以及感染者機體細(xì)胞免疫和體液免疫引起HBV囊膜蛋白改變，所有綜合效應(yīng)導(dǎo)致機體對HBV處于免疫耐受狀態(tài)，核酸病毒低拷貝復(fù)制，免疫標(biāo)志物蛋白不能正常表達和分泌，因此所有血清學(xué)指標(biāo)均陰性，但NAT仍能有效檢出其病毒核酸。③我們檢測到2例HBsAb陽性而其余4項陰性樣本，提示這些獻血者機體通過天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的協(xié)調(diào)作用清除HBV病毒，但NAT陽性也表明OBI獻血者免疫功能受到抑制或免疫低下不能有效清除HBV，處于慢性感染狀態(tài)，此類獻血者血液中仍殘留病毒，存在輸血感染的可能性。④另外HBcAb是既往感染標(biāo)志，可認(rèn)為其為OBI血清學(xué)一種重要特征，有很好的指導(dǎo)價值。國外低流行區(qū)有利用HBcAb和HBsAb定量來綜合判斷血液的保留還是淘汰。我國在正常人群中HBcAb陽性率也接近50%，所以用HBcAb作為血篩一個指標(biāo)勢必會誤淘汰部分獻血者會導(dǎo)致浪費血源。本研究OBI獻血者39份HBcAb陽性，且血清HBV DNA病毒載量多數(shù)小于20 IU／ml，而NAT仍能有效檢出。

綜上所述，無論HBV DNA定量是否高于檢測下限，NAT反應(yīng)性標(biāo)本均與HBV感染具有較高的相關(guān)性，ELISA和NAT聯(lián)合檢測比2種不同ELISA試劑盒檢測獻血者血液更能有效檢出獻血者血液中HBV，可進一步縮短病毒感染的窗口期，極大地降低了經(jīng)血傳播疾病的殘余風(fēng)險，保障了受血者輸血安全性。

利益沖突 無