細胞焦亡的分子機制及其在病毒感染中的作用

張克恭 王建 張野 黃長形

710038西安，空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院傳染科

細胞焦亡（pyroptosis）是細胞程序性死亡的一種方式。與凋亡不同的是，細胞焦亡伴隨著炎癥反應(yīng)，在形態(tài)學(xué)上同時具有壞死和凋亡的特征。細胞焦亡的發(fā)生首先由模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別病原相關(guān)分子模式（pathogenassociated molecular pattern，PAMPs）和危險相關(guān)分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMPs），而后促進炎癥小體的轉(zhuǎn)錄和表達。細胞焦亡分為經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑。半胱天冬氨酸蛋白酶（caspases）是細胞焦亡中起關(guān)鍵作用的蛋白酶，經(jīng)典途徑由半胱天冬氨酸蛋白酶1（caspase-1）介導(dǎo)，而非經(jīng)典途徑中由Caspase-4／5／11介導(dǎo)。Caspases可以誘導(dǎo)gasdermin-D（GSDMD）的活化和炎癥因子白介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）和 IL-18 的分泌，引起細胞腫脹、溶解和炎癥反應(yīng)［1-6］。

1 細胞焦亡的形態(tài)學(xué)特征

細胞焦亡形態(tài)學(xué)上同時具有細胞凋亡和細胞壞死性死亡的特征。一方面，發(fā)生焦亡的細胞會有核固縮和DNA的破壞，而細胞核在形態(tài)上會保持完整性［7］，無核碎裂表現(xiàn)。胞質(zhì)內(nèi)細胞器也保持完整，但其功能何時喪失仍不清楚，有實驗表明，發(fā)生焦亡的骨髓來源巨噬細胞，在細胞膜穿孔形成1分鐘內(nèi)，線粒體就停止了活動［8］。焦亡細胞在最終溶解之前，會形成焦亡小體，焦亡小體直徑約為1～5μm，游離的焦亡小體可以被專職的吞噬細胞吞噬，或者作為細胞間傳遞物質(zhì)和信息的載體［9］。另一方面，發(fā)生焦亡時，細胞膜的完整性會遭到破壞，GSDMD在質(zhì)膜形成的穿孔，會打破胞膜兩側(cè)的滲透平衡及導(dǎo)致炎癥因子的釋放，細胞體積增大最終溶解，細胞內(nèi)容物釋放到外界，并引起炎癥反應(yīng)［10-11］。

2 細胞焦亡的分子機制

2.1 細胞焦亡的第一步是炎癥小體的活化 在細胞遭遇感染或免疫反應(yīng)時，PRR識別 PAMPs或DAMPs，促進炎癥小體的轉(zhuǎn)錄和裝配。炎癥小體是胞質(zhì)內(nèi)的多聚蛋白體，由炎癥小體啟動傳感器（NLRP1，NLRP3，NLRC4，AIM2，pyrin等）和參與炎癥反應(yīng)的Caspases構(gòu)成，有的還包括配體蛋白凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）［12］。 經(jīng)典炎癥小體大部分屬于 NOD樣受體（nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor，NLRs）家族。 NLRs家族包含3個共同結(jié)構(gòu)域，C端富含亮氨酸結(jié)構(gòu)（leucine-rich repeats-LRR），中間為核苷結(jié)合域（NOD／NACHT），N 端為Caspase募集域（caspase activation and recruitment domain-CARD）或膿素域（pyrin domains-PYD），各結(jié)構(gòu)域行使不同的功能，LRR負責(zé)配體識別和自抑制作用，能識別其他炎癥受體或微生物配體；NACHT消耗ATP激活信號復(fù)合體，與核苷酸rNTP結(jié)合并調(diào)節(jié)寡聚反應(yīng)；CARD／PYD調(diào)節(jié)同型蛋白之間的交互作用，有調(diào)節(jié)信號通路的作用。另一種焦亡相關(guān)炎癥小體AIM2為非NLRs蛋白，有一個膿素域和DNA結(jié)合HIN-200域，HIN200結(jié)構(gòu)可識別dsDNA。不同炎癥小體應(yīng)對不同的刺激性質(zhì)：NLRP3能被許多激動劑激活，如ATP、穿孔毒素、晶體化合物、核酸、透明質(zhì)酸、以及真菌、細菌、病毒等病原體；NLRP4識別胞內(nèi)細菌鞭毛蛋白、3型分泌系統(tǒng)元件；NLRP1識別炭疽致死毒素、胞壁酰二肽；AIM2識別胞質(zhì)雙鏈 DNA［10-11，13-14］。

炎癥小體的活化還需要ASC的參與，ASC結(jié)構(gòu)包含CARD和PYD，是炎癥小體和Caspases連接的橋梁［14］，炎癥小體通過ASC與Caspases相互作用，活化Caspases，主要是Caspase-1，最終形成鏈?zhǔn)綇?fù)合物或者球形復(fù)合物［7，15］。

2.2 Caspase-1／4／5／11 是介導(dǎo)細胞焦亡的重要物質(zhì) Caspases是進化上保守的胞內(nèi)酶，與細胞死亡和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，定位于胞質(zhì)和核質(zhì)［15］，各Caspases參與不同的生化過程，凋亡相關(guān)的有Caspase-2／3／6／7／8／9／10；焦亡相關(guān)的有人 Caspase-1／4／5 和鼠 Caspases 1／11，被 列 入 炎癥 相 關(guān)Caspases亞族。細胞焦亡分兩種途徑：經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑。經(jīng)典途徑由Caspase-1介導(dǎo)，Caspase-1以前體的形式存在于胞質(zhì)中，炎癥小體是Caspase-1活化的場所，CARD募集Caspase-1前體，Caspase-1前體二聚化，而后發(fā)生解朊反應(yīng)，這是一個自催化的過程，產(chǎn)生p10 a和p20的亞單位，最終成為有活性的Caspase-1。NLRs或AIM2活化Caspase-1需要ASC的參與，另一種炎癥小體NLRC4不依賴ASC，直接募集Caspase-1前體并催化Caspase-1活化［11，16-17］。 Caspase-1 活化后可進一步激活細胞焦亡的效應(yīng)蛋白GSDMD以及炎癥因子的成熟和釋放。

細胞焦亡的非經(jīng)典途徑在人類由Caspase-4／5介導(dǎo)，在小鼠由Caspase-11介導(dǎo)。這一途徑識別的PAMPs主要是脂多糖（LPS），Caspase-11直接與LPS的脂質(zhì)A結(jié)合，尤其是六酰脂質(zhì)A，在此過程中，Caspase-11本身就是PRR，在應(yīng)對革蘭陰性菌的感染中發(fā)揮重要作用［13，18］。 人類 Caspase-4／5 有相同的功能。細胞焦亡是一個復(fù)雜的生化過程，各信號通路并非是相互孤立的，經(jīng)典與非經(jīng)典途徑會有交叉，如Caspase-11可以促進NLRP3的活化，進而導(dǎo)致Caspase-1的活化和炎癥因子的釋放［18］，炎癥小體還可以通過 Caspase-4／5／11 活化 Caspase-1［19］。此外，近來又發(fā)現(xiàn)其他Caspases也可能參與細胞焦亡［20］。因此，對于細胞焦亡過程中Caspases的活化通路及不同Caspases相互作用仍需要進一步的研究?？傊雇鱿嚓P(guān)Caspases是介導(dǎo)細胞焦亡的關(guān)鍵酶類，它活化之后能夠水解焦亡的執(zhí)行蛋白GSDMD，引起細胞穿孔，腫脹，溶解。

2.3 GSDMD是細胞焦亡的執(zhí)行者 GSDMD屬于Gasdermin蛋白家族，在許多細胞如巨噬細胞，上皮細胞等都有表達。Gasdermin蛋白進化上很保守，各成員有45%序列同源，主要在 N端。人類有GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、DFNA5 和DFNB59，小鼠沒有 GSDMB，但有 3種 GSDMAs（GSDMA1-3），4 種 GSDMCs （GSDMC1-4）［13，21］。GSDMD目前研究最透徹。GSDMD約由480個氨基酸組成，N端是功能區(qū)域，能在胞膜上形成穿孔，也叫PFD結(jié)構(gòu)域 （Pore-forming domain），PFD的中心結(jié)構(gòu)為延伸的β折疊，GSDMD的C端是一個α螺旋組成的袋狀結(jié)構(gòu)，對N端有抑制作用，因此也叫RD結(jié)構(gòu)域（repressor domain），GSDMD處于未活化狀態(tài)時，PFD和RD結(jié)合在一起，掩蓋各自約30%的表面。執(zhí)行焦亡時，GSDMD一個保守的谷氨酸殘基被Caspase-1或Caspase-11水解成GSDMD-N和GSDMD-C，GSDMD-N從GSDMD-C的抑制下解放出來，GSDMD-N對磷脂有親和性，尤其磷脂酰肌醇磷酸鹽，細胞膜胞質(zhì)側(cè)富含此類磷脂，GSDMD-N結(jié)合到細胞膜上，形成一個16單體環(huán)狀聚合物，在細胞膜上形成穿孔，內(nèi)徑12～14 nm，也有研究顯示為21 nm，穿孔破壞了細胞膜的完整性，尤其是破壞了鈉鉀平衡，鈉離子大量內(nèi)流，細胞滲透性吸水，體積變大，穿孔數(shù)量不多時，細胞會啟動補償機制，通過K＋、Cl-、有機滲透物等維持水平衡，或通過胞膜融合修補穿孔。穿孔數(shù)量過多時，細胞充滿液體呈氣球樣，質(zhì)膜從細胞骨架脫離，最終細胞破裂溶解，死亡。由于GSDMD-N高親和力基團在細胞膜胞質(zhì)側(cè)，因此GSDMD-N不會對周圍細胞造成損傷。此外，細菌細胞壁含有心磷脂，GSDMD-N能與之結(jié)合并發(fā)揮穿孔功能，具有直接殺菌作用［16，22-23］能直接殺死大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，芽孢桿菌等［24］。Gasdermin蛋白家族除了DFNB59，都有相同的N端結(jié)構(gòu)域，都可能具有穿孔活性［25］，這需要進一步的研究。

細胞發(fā)生焦亡時加入細胞溶解抑制劑后，細胞未發(fā)生溶解，但依然存在細胞運動和線粒體活動的停止和細胞腫脹，表明發(fā)生焦亡時，細胞死亡和細胞溶解是獨立的，死亡在溶解之前。抑制溶解也并不能保護細胞免于焦亡，但可以推遲炎癥的發(fā)生。當(dāng)抑制GSDMD時，在相同刺激下，細胞發(fā)生凋亡［26］。說明 GSDMD是細胞焦亡所必須的，通過檢測GSDMD可以反映相關(guān)Caspases的活化和焦亡的發(fā)生［27］。

2.4 細胞焦亡與炎癥反應(yīng) 細胞焦亡一個重要的特征是伴隨著炎癥的發(fā)生，這需要炎癥因子參與。活化的Caspase-1能促進IL-1β和IL-18的成熟和分泌。IL-1β在宿主防御和啟動保護性炎癥中發(fā)揮重要作用。它的前體被Caspase-1水解而變?yōu)榛钚孕问?，IL-1無信號肽，不經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體分泌。細胞溶解之前，IL-1β即可經(jīng)GSDMD形成的穿孔分泌，可能會促進周圍細胞IL-1β前體的生成以及募集更多的免疫細胞。細胞溶解之后，炎癥因子和大分子物質(zhì)都會釋放，引起炎癥反應(yīng)［20，28-29］。 非經(jīng)典途徑中，Caspase-11直接調(diào)控IL-1α的分泌，并通過NLRP3-ASC-Caspase-1 間接促進 IL-1β 的分泌［11］。

3 細胞焦亡在病毒感染發(fā)病中的作用

細胞焦亡是一種伴隨炎癥反應(yīng)的程序性死亡方式。在病毒感染發(fā)病的過程中，細胞焦亡起著很重要的作用。

3.1 急性病毒感染 研究表明，細胞焦亡在腸道病毒71（enterovirus 71，EV-A71）感染早期就被啟動，EV-A71病毒誘導(dǎo)Caspase-1的活化，繼而被感染細胞的 IL-1β和 IL-18的表達和分泌明顯增加，Caspase-1抑制劑可使鼠腦中EV-A71病毒的復(fù)制顯著下 降［30］。 與 此 相 似， 在 柯 薩 奇 病 毒 B3（Coxsackievirus B3，CVB3）感染的宮頸癌細胞中，IL-18和NLRP3表達增強。在CVB3感染的小鼠中，Caspase-1抑制劑能夠減輕癥狀以及減少病毒復(fù)制。此外，IL-1β的釋放還能促進 Caspase-1的表達，形成正反饋，在EV-A71和CVB3的急性感染期細胞焦亡能促進病毒的釋放和傳播，導(dǎo)致更多細胞的感染，這一階段細胞焦亡是有害的。

登革病毒（dengue virus，DENV）主要侵犯巨噬細胞，在DENV-2感染中，病毒會引起巨噬細胞分泌IL-1β并發(fā)生焦亡，這個過程受 Caspase-1和Caspase-4的調(diào)節(jié)［10］。在Theiler氏小鼠腦脊髓炎病毒感染SJL／J小鼠中，脊髓細胞大量發(fā)生細胞焦亡，被感染小鼠的Caspase-1、-11基因表達上調(diào)。感染過程中，細胞焦亡導(dǎo)致過多的細胞因子釋放，從而加重了炎癥反應(yīng)和細胞毒性［30］。

3.2 慢性病毒感染 細胞焦亡也參與慢性病毒感染過程，如人類免疫缺陷病毒（HIV），在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的 HIV患者中，治療無效組 NLRP3和Caspase-1的表達明顯上調(diào)，二者在HIV感染持續(xù)免疫激活中起作用，Caspase-1表達上調(diào)，CD4 T細胞發(fā)生細胞焦亡，數(shù)量減少［31］。在HIV-1感染患者的次級淋巴組織中，流產(chǎn)感染的CD4＋T細胞會發(fā)生焦亡，而在外周血中，CD14＋＋CD16-單個核細胞發(fā)生細胞焦亡后，會將ASC釋放入血，ASC可能對HIV-1引起的炎癥反應(yīng)和免疫激活有促進作用［32］。

4 小結(jié)

細胞焦亡作為一種程序性死亡形式，對于生物的正常的生理功能是非常重要的，也是機體固有免疫的重要組成部分，對于清除受損細胞和抵御感染等方面都有重要的作用。當(dāng)發(fā)生過度的細胞焦亡時，也會造成較強的病理性炎癥反應(yīng)。對于細胞焦亡的發(fā)生，信號通路及關(guān)鍵分子，還需要更深入的研究，相信這可以為了解相關(guān)疾病發(fā)病機制，提供新的思路，為疾病的治療提供新的靶點。

利益沖突 無