反流性食管炎相關(guān)功能蛋白表達(dá)研究進(jìn)展

賽紅梅，唐艷萍，李蕾

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）是指胃、十二指腸內(nèi)容物反流入食管，進(jìn)而引起反酸、燒心、胸骨后不適，嚴(yán)重時可引起咳嗽等一系列臨床癥狀的疾病。臨床上根據(jù)內(nèi)鏡及病理檢查結(jié)果將GERD分為非糜爛性反流病（non-erosive reflux disease，NERD）、糜 爛 性 食 管 炎（erosive esophagitis，EE）和 Barrett食管（Barrett esophagus，BE）3種類型。其中將內(nèi)鏡下食管黏膜有損傷、炎癥等表現(xiàn)的GERD稱為糜爛性食管炎，也被稱為RE。隨著現(xiàn)代診療技術(shù)的進(jìn)步及社會環(huán)境的變化，RE的發(fā)病率呈上升趨勢。究其病因，目前考慮與食管下括約肌松弛、胃及十二指腸內(nèi)容物對食管黏膜的刺激以及食管黏膜屏障受損等因素有關(guān)［1］。近年來，多數(shù)學(xué)者從分子水平入手，結(jié)合RE致病的相關(guān)因素及機制，探討不同的信號通路及蛋白在食管黏膜中的表達(dá)。其中包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、緊密連接蛋白（tight junction protein，TJ）、成束蛋白（fascin）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、蛋白 酶 激 活 受 體-2（protease-activated receptor-2，PAR-2）、瞬時受體電位陽離子通道亞家族V成員1（transient receptor potential cation channel subfamily V member 1，TRPV1）和谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶（GSTs）等。這些功能蛋白在RE的發(fā)生及進(jìn)展中處于不斷變化的狀態(tài)，因此對研究RE的發(fā)生機制有一定的幫助。本文將最新研究中上述蛋白的表達(dá)及意義作一綜述。

1 RE相關(guān)蛋白

1.1 iNOS 一氧化氮合成酶（NOS）從L-精氨酸中產(chǎn)生，是一氧化氮（NO）的關(guān)鍵限速酶，在胃腸道內(nèi)分布比較廣泛，包括結(jié)構(gòu)型一氧化氮合成酶（cNOS）和iNOS［2］。iNOS在靜息細(xì)胞中不表達(dá)，但經(jīng)過某些免疫刺激后可誘導(dǎo)產(chǎn)生［3］。cNOS被誘導(dǎo)可產(chǎn)生低濃度且持續(xù)時間較短的NO；而iNOS一旦被誘導(dǎo)，短時間內(nèi)即可持續(xù)產(chǎn)生大量的NO［4］。

食管下括約肌在預(yù)防胃內(nèi)容物反流入食管起著至關(guān)重要的作用。食管組織內(nèi)iNOS的表達(dá)及分布決定了NO對食管下括約肌收縮及舒張功能的影響。生理量的NO具有保護食管黏膜、正常調(diào)節(jié)括約肌的作用，但當(dāng)受到某些病毒產(chǎn)物、細(xì)胞因子的侵襲，甚至細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變時，即可誘導(dǎo)iNOS產(chǎn)生大量的NO［5-6］。大量NO促使細(xì)胞內(nèi)鳥苷酸活化酶激活，胞內(nèi)鈣離子外流，食管下段平滑肌松弛，從而使食管下段靜息壓與胃內(nèi)壓差減小，胃內(nèi)容物、胃酸反流至食管，刺激食管黏膜，造成RE發(fā)生的可能［7］。此外，大量的NO本身也可以作為一種炎性介質(zhì)誘導(dǎo)食管黏膜發(fā)生炎癥反應(yīng)。

1.2 TJ 細(xì)胞間連接由緊密連接、黏附連接、縫隙連接和橋粒等組成。緊密連接是細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)中最重要的一種膜蛋白復(fù)合體，位于靠近頂端的細(xì)胞側(cè)面，呈連續(xù)串珠狀，連接相鄰的細(xì)胞［8］。TJ由occludin蛋白、胞質(zhì)緊密黏連蛋白（zonula occludens，ZOs）、claudin 蛋白、連 接 黏 附分子（junctional adhesion molecule，JAM）等結(jié)構(gòu)蛋白和各類連接蛋白共同組成［9］。TJ是維持上皮機械屏障功能最重要的結(jié)構(gòu)，而食管黏膜的防御功能主要由上皮屏障完成［9］，因此TJ在食管黏膜抵御胃酸、胃蛋白酶等強刺激中有一定的保護作用。但TJ在某些病理產(chǎn)物、缺氧環(huán)境及炎性因子的刺激下異常表達(dá)或者異常分布，導(dǎo)致細(xì)胞之間形成再分配、TJ復(fù)合物破壞，黏膜屏障開放，對反流物的防御功能下降［10］。已有研究表明，白細(xì)胞介素（IL）-6可以誘導(dǎo)Claudin-2的表達(dá)，增加TJ的通透性，同時IL-6也可誘導(dǎo)TJ其他蛋白改變平滑肌細(xì)胞的運動活性，導(dǎo)致細(xì)胞間隙增寬，黏膜屏障受損［10-11］。

當(dāng)食管黏膜上皮屏障開放，防御功能受損時，即使生理性反流，也會對食管黏膜造成進(jìn)一步損傷。此外，黏膜下的末梢神經(jīng)分布廣泛，上皮屏障的開放導(dǎo)致反流物刺激食管，即出現(xiàn)反酸、燒心、胸骨后疼痛等典型的GERD癥狀［10］。從TJ在食管黏膜的表達(dá)機制來看，其對NERD的發(fā)病更有研究價值。

1.3 成束蛋白（fascin） 細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用依賴于細(xì)胞突起的結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞附著、細(xì)胞外基質(zhì)的遷移、細(xì)胞與細(xì)胞間的通訊等。細(xì)胞突起一般分為兩大類：一類是形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，即局部的指狀結(jié)構(gòu)；另一類是質(zhì)膜的延伸。所有細(xì)胞突起的一個關(guān)鍵要求是需要一個剛性的細(xì)胞骨架來支持質(zhì)膜的局部延伸。這種剛性骨架是一種以肌動蛋白為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的蛋白重組，而Fascin蛋白則是骨架重組中突起結(jié)構(gòu)（天線偽足）的重要組成部分［12-14］。這種重組后的結(jié)合蛋白通過增加細(xì)胞膜突起，改變細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附等途徑激活細(xì)胞運動功能［13］，在細(xì)胞遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。

Fascin蛋白是在進(jìn)化中相對保守的一種交聯(lián)蛋白，位于細(xì)胞質(zhì)張力纖維、微束及細(xì)胞膜皺襞中，主要控制肌動蛋白聚集、排列等［12］。Fascin蛋白主要參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，在同時包括食管腺癌（esophageal cancer，EA）的各種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)［15］，但關(guān)于Fascin蛋白在炎癥性疾病中表達(dá)意義的研究較少。史麗芳等［16］通過檢測臨床確診的RE、BE 不伴有腸化（BE1）、BE 伴腸化（BE2）、BE 伴不典型增生（BE3）、EA患者及同期健康對照食管黏膜組織中和血清中Fascin的含量，發(fā)現(xiàn)從正常食管向食管癌發(fā)展的過程中，食管組織和血清中Fascin蛋白的含量呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，提示Fascin蛋白可以成為GERD動態(tài)發(fā)展中的檢測指標(biāo)之一。但其逐漸增高的確切作用及機制尚不清楚，還需大量的動物實驗和臨床研究進(jìn)一步證實。

1.4 HIF-1α HIF-1是一種異源二聚體，是由氧調(diào)節(jié)亞基HIF-1α和結(jié)構(gòu)型的HIF-1β亞基組成。HIF-1α是細(xì)胞感應(yīng)缺氧和炎癥反應(yīng)的中心蛋白，也是細(xì)胞最早感受缺氧刺激的因子之一［17-18］。HIF-1α在細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)，在正常條件下，基于蛋白酶對HIF-1α蛋白的降解，HIF-1α的濃度呈低水平狀態(tài)；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)缺氧時，蛋白的降解因缺氧而被抑制，導(dǎo)致HIF-1α濃度增高。HIF-1α與HIF-1β結(jié)合后形成蛋白復(fù)合物HIF-1，從而發(fā)揮其生物學(xué)活性?；罨腍IF-1與靶基因上的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄［19-20］。而與HIF-1結(jié)合的靶基因中同時包括參與保護細(xì)胞和組織免受低氧水平損害的相關(guān)基因以及炎性基因，如COX-2、IL-6、iNOS等。因此，HIF-1α也被認(rèn)為是炎癥信號的核心因素［20］。

丁光榮等［21］通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在反流性食管炎中的表達(dá)明顯高于正常食管黏膜，而且在RE至EA的發(fā)展過程中始終存在，表達(dá)水平呈現(xiàn)逐漸增高趨勢。結(jié)合HIF-1α的相關(guān)機制，考慮細(xì)胞缺氧始于RE階段，并隨著RE炎癥的進(jìn)展，細(xì)胞缺氧不斷加重，HIF-1α在組織中的表達(dá)水平不斷增高［22］。而HIF-1α高表達(dá)可激活各種炎性因子，進(jìn)一步誘導(dǎo)食管括約肌收縮及舒張功能障礙、食管黏膜屏障開放等。

1.5 PCNA PCNA是一種由帶有中心孔的閉合環(huán)形成的三聚體，其中包圍著雙鏈DNA。PCNA蛋白是真核生物中DNA復(fù)制的主要輔助因子，在DNA復(fù)制、修復(fù)、重組中起重要作用。在原核生物中，PCNA被認(rèn)為是DNA聚合酶β亞基的同源基因，而在真核生物中被稱為DNA復(fù)合酶δ和ε的滑動鉗，其與DNA復(fù)合酶相互作用，完成岡崎片段的延伸，并組織各種成分用于DNA復(fù)制、染色質(zhì)重塑、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期過程。PCNA的不同功能可能受其與結(jié)合蛋白相互作用的調(diào)節(jié)，大部分PCNA結(jié)合蛋白都會有一個保守的與PCNA相互作用的肽基序（PCNA interacting peptide，PIP），一般位于結(jié)合蛋白的C端或者N端。其結(jié)合過程為：PCNA蛋白中的域間連接環(huán)、中心環(huán)以及C-末端形成疏水槽，PIP基序形成一個310螺旋體，并進(jìn)入疏水槽內(nèi)，與疏水槽相結(jié)合而發(fā)揮相應(yīng)作用。PCNA在細(xì)胞周期的表達(dá)水平變化與細(xì)胞增殖或轉(zhuǎn)化有關(guān)。PCNA表達(dá)異常可作為許多增殖性疾病的標(biāo)志［23-24］。

反流性食管炎的組織學(xué)表現(xiàn)即食管鱗狀上皮細(xì)胞的增生，而PCNA的表達(dá)與增生程度有關(guān)。無論是大鼠實驗［25］還是臨床觀察［26］，均顯示 PCNA 蛋白在RE的進(jìn)展中表達(dá)水平不斷增高，因此PCNA指數(shù)可反映食管上皮細(xì)胞的增殖狀態(tài)，以期能夠監(jiān)測食管黏膜的分化程度，對RE患者的輔助診斷及預(yù)后具有很高的價值。

1.6 COX-2 COX被分為兩個異構(gòu)型，即構(gòu)成型的COX-1和誘導(dǎo)型的COX-2。COX-2是一種膜結(jié)合蛋白，是催化花生四烯酸生成前列腺素的限速酶［27］。花生四烯酸是COX-1和COX-2的共同底物，COX-1在不需要任何刺激因素的情況下可生成生理性的PGs，而COX-2需細(xì)胞因子和其他炎性介質(zhì)的誘導(dǎo)，合成僅存在于炎性細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等中的前列腺素（prostaglandin，PG）［28-29］。COX-2 介導(dǎo)各種疾病發(fā)生的機制包括抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)血管生成和破壞細(xì)胞黏附等［27］。

Taddei等［30］納入了 33例胃食管反流病患者，通過內(nèi)鏡及病理檢查對非糜爛性食管炎、反流性食管炎及Barrett食管患者進(jìn)行分類，并獲取食管活檢，采用蛋白印跡分析法對不同類型組COX-2蛋白進(jìn)行分級，結(jié)果顯示在正常食管組織向RE甚至BE過渡的過程中，COX-2表達(dá)逐漸增加。同時有臨床資料表明，COX-2的表達(dá)水平隨著上皮化生-異型增生-腺癌序列的增加而增加，其在BE中表達(dá)的陽性率為75%，低度異型增生中為83%，而在高度異型增生及食管腺癌組織中100%表達(dá)［31］。雖然COX-2在癌細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，但其不是誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞的調(diào)控蛋白［32］。正常食管上皮細(xì)胞中COX-2呈陰性表達(dá)，只有當(dāng)胃酸、膽汁酸等胃內(nèi)容物反流入食管對其造成長期刺激時，才誘導(dǎo)食管組織COX-2表達(dá)，將花生四烯酸代謝成為各種前列腺素產(chǎn)物，參與食管產(chǎn)生炎癥的過程，加重黏膜損傷。此外，Yang等［6］發(fā)現(xiàn) COX-2還可以延緩胃排空，增加胃內(nèi)壓，促進(jìn)胃內(nèi)容物反流入食管。

1.7 PAR-2 蛋白酶激活受體（protease-activated receptors，PARs）是 G 蛋白偶聯(lián)受體（G proteincoupled receptors，GPCRs）的家族成員。PARs 中PAR-1、PAR-3、PAR-4 主要由凝血酶激活，PAR-2則主要由胰蛋白酶和類胰蛋白酶激活。PARs有一個獨特的激活機制，就是受體的胞外N-末端結(jié)構(gòu)域的蛋白裂解［33-34］。胃腸道中的PARs主要由PAR-1和PAR-2參與，被認(rèn)為是胃腸疾病發(fā)病機制的關(guān)鍵分子。PAR-2對胃腸功能調(diào)節(jié)主要有兩點：外分泌的調(diào)節(jié)作用（腮腺唾液淀粉酶和黏液蛋白的分泌）和對平滑肌運動的調(diào)節(jié)作用。PAR-2對食管、胃及十二指腸平滑肌的運動都有調(diào)節(jié)作用。在食管環(huán)形平滑肌中，PAR-2受胰蛋白酶濃度的影響起到雙向運動調(diào)節(jié)作用，而在胃及十二指腸中主要以單向收縮為主［34-35］。同時，酸暴露誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放的類胰蛋白酶、胃及十二指腸中的胰蛋白酶等激活PAR-2，活化的PAR-2介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、IL-8、IL-6等因子表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及內(nèi)皮細(xì)胞增殖［36］。Kim 等［37］通過臨床觀察到，在非胃食管反流病-NERD-RE的患者中，食管黏膜PAR-2的含量逐漸增高。因此，PAR-2表達(dá)通路的上調(diào)在反流性食管炎患者和具有明顯反流癥狀（反酸、燒心等）的NERD患者的病情進(jìn)展中有重要的意義。

1.8 TRPV1 TRPV1是一種非選擇性陽離子通道，主要參與傷害性刺激的檢測和傳導(dǎo)。在結(jié)構(gòu)上，TRPV1是一個同源四聚體，對稱地圍繞于裸露的中心孔周圍，其中每一個亞基由6個跨膜螺旋體組成，每個膜蛋白的C-末端和N-末端均在膜內(nèi)［38-39］。TRPV1是辣椒素（capsaicin，CAPS）的作用靶點，因此也被稱為辣椒素受體。TRPV1的電鏡結(jié)構(gòu)提供了CAPS和樹脂毒素（resiniferatoxin，RTX）的大體特征，CAPS和RTX可以激活TRPV1通道，增強通道對陽離子的通透性，導(dǎo)致通道脫敏而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用［38］。但目前研究更多的是TRPV1的致痛及致炎作用，TRPV1是化學(xué)感受器，可以受各種香料衍生物質(zhì)刺激，包括辣椒素、胡椒堿、姜辣素和烯丙基異硫氰酸酯等［39］。TRPV1也可以被炎癥和疼痛介質(zhì)廣泛激活，如溫度（＞43℃）、外部的pH、緩激肽、乙醇和花生四烯酸代謝物等［38］。

Kim等［37］同時對非胃食管反流病、NERD和RE患者食管遠(yuǎn)端黏膜TRPV1的含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示RE組TRPV1含量明顯高于對照組，推斷炎癥介質(zhì)的參與造成了TRPV1在食管組織中表達(dá)上調(diào)。此外，Matsumoto等［40］對 TRPV1 神經(jīng)纖維在 RE 模型小鼠食管組織內(nèi)的分布以及變化做了研究，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組小鼠相比，RE模型小鼠中TRPV1神經(jīng)纖維的數(shù)量沒有變化，但它們的免疫反應(yīng)強度有所增加，而且外源性辣椒素對RE模型小鼠電刺激收縮的抑制作用較假手術(shù)組顯著增強。提示食管組織內(nèi)的TRPV1可能是外源性的，主要是脊髓和迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)內(nèi)的TRPV1神經(jīng)纖維投射于食管的黏膜下層和肌層所形成。同時，TRPV1神經(jīng)纖維中含有降鈣素基因相關(guān)肽、P物質(zhì)、一氧化氮和乙酰膽堿。因此，酸反流介導(dǎo)TRPV1激活對食管有一定的松弛作用。

1.9 GSTs GSTs是一組超家族蛋白酶，表達(dá)于人體所有組織中，具有解毒、抗氧化、代謝調(diào)節(jié)等多種功能［41］。GSTs具備將谷胱甘肽（glutathione，GSH）與親電子物質(zhì)結(jié)合并促進(jìn)親電子物質(zhì)降解清除的功能，同時也參與白三烯、前列腺素等炎性介質(zhì)的內(nèi)源性代謝［42］。目前關(guān)于GSTs的研究、參與腫瘤的細(xì)胞代謝及抗腫瘤藥物的研發(fā)等相關(guān)方面已經(jīng)相對成熟，但很少有研究報道GSTs在炎癥性疾病中的表達(dá)。目前RE的確切機制尚不明確，但不除外免疫介導(dǎo)、氧化應(yīng)激等，GSTs有保護細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的作用［43］。GSTs的功能多樣，是否與RE的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，還需進(jìn)一步研究探討。

2 小結(jié)

通過研究RE的機制，不同的蛋白表達(dá)的意義有所不同，iNOS過表達(dá)可引起食管括約肌松弛、TJ是上皮屏障的主要蛋白，而多數(shù)蛋白在從正常食管向反流性食管炎甚至食管癌病程進(jìn)展中呈現(xiàn)逐漸增高的現(xiàn)象。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為在GERD中，NERD是RE的輕型，但臨床中對酸敏感、24 h pH監(jiān)測陰性的GERD患者診斷存在一定困難，可以考慮研究上述蛋白在GERD進(jìn)展中含量的變化，為診斷酸敏感的GERD提供依據(jù)。同時這種含量變化對今后食管癌早期發(fā)現(xiàn)和靶向治療有一定幫助。目前在RE的發(fā)生發(fā)展過程中與其相關(guān)的蛋白表達(dá)是研究熱點，但RE食管黏膜中是否存在特異性蛋白，還需進(jìn)一步探討。

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