鼠曲草花中黃酮的提取及抗氧化活性研究

張德勝+康照金+尤雙梅+馮亞娟+劉品華

摘要 鼠曲草是一年生草本植物，在我國均有分布，民間清明前后采食。本文檢測了鼠曲草莖葉及花中總黃酮含量，對比了提取方法?？傸S酮用醋酸鉛沉淀、柱層析純化。結(jié)果表明，鼠曲草莖葉及花中的黃酮含量分別為7.37、38.14 mg/g；最佳提取條件為乙醇濃度40%、料液比1∶40，溫度70 ℃，時間2 h；黃酮（A）的含量最多，還原能力和清除DPPH自由基能力高于蘆丁，有明顯的抗豬油氧化能力，但抗氧化持續(xù)性不及BHT。黃酮（B）的抗氧化活性與蘆丁相當(dāng)。

關(guān)鍵詞 鼠曲草；花；提??；總黃酮；抗氧化活性；過氧化值

中圖分類號 TS201.2 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）24-0237-04

Study on Extraction and Antioxidant Activity of Flavonoids from Flower of Gnaphalium affine D. Don

ZHANG De-sheng KANG Zhao-jin YOU Shuang-mei XIA Wan-qiu FENG Ya-juan LIU Pin-hua

（College of Chemistry and Environmental Science，Qujing Normal University，Qujing Yunnan 655011）

Abstract Gnaphalium affine D.Don is an annual herb，which distributes widely in China and is often fed in Tomb-Sweeping Day.This paper tested the content of total flavonoids in stem，leaves and flowers of Gnaphalium affine D.Don，and compared the extraction methods.Total flavonoids were precipitated with lead acetate and purified by column chromatography.The results showed that the content of flavonoids in the stem and leaves，flowers of Gnaphalium affine D.Don were 7.37 mg/g and 38.14 mg/g，respectively.The optimum extraction conditions were as following，ethanol concentration was 40%，solid-liquid ratio was 1∶40，temperature was 70 ℃，time was 2 h.The content of flavonoids（A）was highest，reducing ability and DPPH free radical scavenging ability were higher than that of rutin，which had obvious anti-lard oxidation ability，but the persistence of antioxidation was not as good as BHT. Flavonoids（B）had similar antioxidant activity to rutin.

Key words Gnaphalium affine D.Don；flower；extraction；total flavonoid；antioxidant activity；peroxidation value

鼠曲草（Gnaphalium affine D.Don），菊科，簇生，一年生草本，生于海拔1 600～2 700 m的田埂、荒地、路旁，尤以稻田最常見。清明前民間有采集嫩尖食用的習(xí)慣。莖葉入藥，化痰止咳、清熱利濕，活血降壓，是治氣喘和支氣管炎以及非傳染性潰瘍、創(chuàng)傷的常見用藥，全草含胡蘿卜素、抗壞血酸、硫胺素、核黃素、花中木犀草素4′-β-D-葡萄糖苷、鼠曲草素、斛皮素-5-甲醚，有鎮(zhèn)咳、抑菌的作用[1-2]?，F(xiàn)有研究表明，鼠曲草屬植物具有多種生物活性，除了醫(yī)藥價值，在營養(yǎng)保健、生物農(nóng)藥、化妝品等方面也有一定的應(yīng)用價值。鼠曲草資源豐富，藥食兩用，是一種極具開發(fā)利用潛質(zhì)的生物資源[3]。因此，本文研究了鼠曲草花中黃酮的提取方法及抗氧化活性，以期為深加工和綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠曲草及鼠曲草花（云南曲靖采摘）；豬油（購自曲靖一超市新鮮肥豬膘，實驗室火煉法提?。?，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）（食品級，鄭州超凡有限公司）；蘆丁（化學(xué)對照品，中國藥品生物制品檢定所）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（日本原裝進口，AR）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（廣州市化學(xué)試劑玻璃儀器批發(fā)部，AR）；水楊酸、焦性沒食子酸等試劑均為分析純。

1.2 儀器

分析天平（AL204-IC，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；紫外分光光度計（TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；離心機（4 000 r/min，常州國華電器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1100，上海愛朗儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（29SN-DP-501，天津試驗儀器廠）。

1.3 研究方法

1.3.1 原料的預(yù)處理。鼠曲草莖葉及花除棄雜質(zhì)，洗凈，65 ℃烘干粉碎后80 ℃烘至恒重，放入干燥器中備用。endprint

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密稱取經(jīng)120 ℃減壓真空干燥至恒重的蘆丁對照品50 mg，置于50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，獲得蘆丁儲備液。取蘆丁儲備液10 mL置于50 mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，獲得蘆丁使用液。取蘆丁使用液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL（質(zhì)量分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg），分別置于50 mL容量瓶中。加95%乙醇至總體積為15 mL，依次加入100 g/L硝酸鋁溶液1 mL、9.8 g/L醋酸鉀溶液1 mL，搖勻，加水至刻度，搖勻，靜置1 h。以未加蘆丁使用液為空白對照，用1 cm比色皿于415 nm處測定吸光度。以蘆丁質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程，y=0.644 4x-0.001 7，R2=0.999 9。

1.3.3 莖葉及花中總黃酮含量的檢測。分別準(zhǔn)確稱取恒重的莖葉及花1 g于50 mL容量瓶中，加入60%乙醇30 mL，70 ℃水浴回流提取2 h，取出冷卻至室溫，用60%乙醇定容至刻度，搖均，濾紙過濾，棄前1/3濾液，取1 mL濾液于50 mL容量瓶中，按1.3.2中方法顯色，在415 nm處測定吸光度，由回歸方程計算總黃酮含量。

1.3.4 鼠曲草花中黃酮提取條件的考察。具體包括以下內(nèi)容。

（1）乙醇濃度對黃酮提取的影響。準(zhǔn)確稱取10 g鼠曲草花于250 mL容量瓶中，按1∶20的料液比分別加入濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇200 mL，70 ℃恒溫水浴提取2 h[4]，取出冷卻至室溫，用對應(yīng)濃度乙醇定容至刻度。濾紙過濾，按1.3.3中方法檢測總黃酮含量。由此確定提取的最佳乙醇濃度。

（2）時間對黃酮提取的影響。準(zhǔn)確稱取10 g鼠曲草花于250 mL容量瓶中，按1∶20的料液比加入40%乙醇 200 mL，于70 ℃恒溫水浴提取30、60、90、120、150 min，取出冷卻至室溫，用40%乙醇定容至刻度。濾紙過濾，按1.3.3中方法檢測總黃酮含量。由此確定提取的最佳時間。

（3）溫度對黃酮提取的影響。準(zhǔn)確稱取10 g鼠曲草花于250 mL容量瓶中，按1∶20的料液比加入40%乙醇200 mL，分別于55、60、65、70、75、80 ℃恒溫水浴提取2 h，取出冷卻至室溫，用40%乙醇定容至刻度。濾紙過濾，按1.3.3中方法檢測總黃酮含量。由此確定提取的最佳溫度。

（4）料液比對黃酮提取的影響。按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（m/v）的料液比準(zhǔn)確稱取鼠曲草花于250 mL容量瓶中加入40%乙醇，于70 ℃水浴提取2 h，取出冷卻至室溫，用40%乙醇定容至刻度。濾紙過濾，按1.3.3中方法檢測總黃酮含量。由此確定提取的最佳料液比。

（5）堿液對黃酮提取的影響。參考鼠曲草花中黃酮含量及酚羥基數(shù)量確定考察方案：準(zhǔn)確稱取10 g鼠曲草花于250 mL容量瓶中，按1∶40的料液比分別加入15%Na2CO3、5%NaOH、飽和Ca（OH）2 200 mL于70 ℃恒溫水浴提取2 h，取出冷卻至室溫，用對應(yīng)堿液定容至刻度。濾紙過濾，棄前1/3濾液，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為4～5[5]。按1.3.3中方法檢測總黃酮含量。由此確定提取的最佳堿液。

（6）纖維素酶對黃酮提取的影響。稱取0.200 0 g纖維素酶于250 mL錐形瓶中，精確稱取鼠曲草花5 g，加入95 mL 水。調(diào)節(jié)pH≈5，45 ℃水浴中磁力攪拌[6]，水解24 h，取出加熱沸騰15 min使酶滅活，在80 ℃烘箱中烘干，再轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中加入40%乙醇200 mL，70 ℃恒溫水浴提取2 h，取出冷卻至室溫后用40%乙醇定容到250 mL。濾紙過濾，按1.3.3中方法檢測總黃酮含量，計算提取率。

（7）菠蘿蛋白酶對黃酮提取的影響。稱取5.600 0 g菠蘿蛋白酶于250 mL燒杯中，精確稱取鼠曲草花5 g，加水95 mL。調(diào)節(jié)pH≈7，45 ℃水浴中磁力攪拌[7-10]，水解5 h，后續(xù)步驟同纖維素酶的方法。

（8）木瓜蛋白酶對黃酮提取的影響。稱取1.000 0 g木瓜蛋白酶于250 mL燒杯中，精確稱取鼠曲草花5 g，加入95 mL水[8-10]。調(diào)節(jié)pH≈6，60 ℃水浴中磁力攪拌，水解3 h，后續(xù)步驟同纖維素酶的方法。

（9）淀粉酶對黃酮提取的影響。稱取0.600 0 g淀粉酶于250 mL燒杯中，精確稱取鼠曲草花5 g，加入95 mL水[11]。調(diào)節(jié)pH≈6，45 ℃水浴中磁力攪拌，水解2 h，后續(xù)步驟同纖維素酶的方法。

1.3.5 鼠曲草花中總黃酮的分離。浸提液中滴加10%醋酸鉛至無沉淀，離心分離得沉淀物（說明含有鄰二酚羥基或兼有3-羥基，4-酮基或5-羥基，4-酮基的化合物），清液滴加10%堿式醋酸鉛至無沉淀，離心分離得沉淀物（說明含有一般酚類化合物）[12]。在沉淀物中分別加入一定量乙醇使其分散，并用85%硫酸調(diào)節(jié)pH值為5～6，離心分離。清液減壓濃縮制樣。用硅膠柱分離，先用石油醚∶乙酸乙酯=6∶4（v/v）洗脫除盡葉綠素，用75%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮制樣。用聚酰胺柱分離，蒸餾水洗脫至無色，收集75%乙醇洗脫液，旋干后用適量40%乙醇溶解得醋酸鉛沉淀黃酮（A）和堿性醋酸鉛沉淀黃酮（B），供抗氧化試驗及抗豬油氧化使用。

1.3.6 還原能力的測定。將黃酮（A）、黃酮（B）、蘆丁配制成0.302 mg/mL供測試使用。取蘆丁溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL分別于15 mL離心管中，補充水至0.5 mL（試樣的質(zhì)量濃度為0、60.4、120.8、181.2、241.6、302.0 μg/mL），不加鐵氰化鉀溶液的為對應(yīng)空白樣。分別加入pH=6.6，0.2 mol/L磷酸緩沖溶液2.50 mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.50 mL，混合均勻，于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min后快速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.50 mL，混合均勻。取清液2.50 mL于試管中，加入2.50 mL蒸餾水，再加入0.1%三氯化鐵溶液0.50 mL，混合均勻，于室溫下靜置10 min，700 nm測定吸光度。黃酮（A）、黃酮（B）方法同蘆丁。endprint

1.3.7 清除DPPH試驗。將黃酮（A）、黃酮（B）、蘆丁配制成60.4 μg/mL供測試使用。取蘆丁溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于15 mL離心管中，補充乙醇至總體積為2 mL，然后加入0.22 mmol/L的DPPH溶液2.00 mL（試樣的質(zhì)量濃度為1.51、3.02、4.53、6.04、7.55、9.06 μg/mL），于室溫暗處放置反應(yīng)30 min，517 nm測得的吸光度為A1，以2.00 mL無水乙醇代替樣液測得的吸光度為A2，以2.00 mL乙醇代替DPPH溶液測得的吸光值為A3（空白）。黃酮（A）、黃酮（B）方法同蘆丁。試樣對DPPH的清除率：

清除率（%）=×100

1.3.8 黃酮（A）的抗油脂氧化的試驗。具體有以下方面內(nèi)容。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。參照GB/T 5009.37適當(dāng)改動，用二氯甲烷代替三氯甲烷繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別精密量取10.0 μg/mL鐵標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL（相當(dāng)于0，2.0，5.0，10.0，20.0，30.0，40.0 μg）于干燥的10 mL比色管中，用二氯甲烷+甲醇（7+3）混合溶劑稀釋至刻度，混勻。加1滴（約0.05 mL）硫氰酸鉀溶液（300 g/L），搖勻。室溫下準(zhǔn)確放置5 min后，1 cm比色皿，以二氯甲烷+甲醇（7+3）混合溶劑為參比，500 nm測吸光度值，各點吸光度值減去零管吸光度值后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以鐵標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得回歸方程：y=0.037 4x-0.011 6，R2=0.999 3。

（2）烘箱誘導(dǎo)法抗豬油氧化試驗。取豬油20 g于培養(yǎng)皿中。試驗組、對照組分別加入乙酸乙酯配制的濃度為1.51 mg/mL黃酮（A）及BHT溶液2.7 mL（折合為4.0 mg），空白組加入乙酸乙酯2.7 mL。攪拌均勻，水浴加熱除去乙酸乙酯。然后將各組培養(yǎng)皿置于（65±1）℃的烘箱誘導(dǎo)氧化，每隔48 h取樣，參照GB/T 5009.37方法測定其過氧化值[13-15]。同時比較了POV抑制率的大小[16-17]，計算公式如下：

POV抑制率（%）=■×100

2 結(jié)果與分析

試驗得知鼠曲草花中黃酮含量為3.814%；莖葉中黃酮含量為0.737%?；ㄖ械狞S酮含量約為莖葉的5倍，為此主要針對花中的黃酮進行研究。醋酸鉛沉淀分離得總黃酮約為85%，堿式醋酸鉛沉淀得總黃酮約為15%，說明鼠曲草花中黃酮主要含有鄰二酚羥基兼有3-羥基、4-酮基或5-羥基、4-酮基的黃酮類化合物，也含有部分一般酚類黃酮化合物。

2.1 乙醇濃度對提取率的影響

由圖1可知，40%乙醇提取效果最佳，提取率達到3.81%，30%、50%乙醇提取效果基本相當(dāng)。黃酮苷是由黃酮苷元與糖基構(gòu)成，黃酮苷元極性較小，糖基極性較大。根據(jù)“相似相溶”原則，黃酮苷易溶于中等或中等偏上極性的溶劑中。因為水分子之間具有較高的結(jié)合能，能很好地溶解與水分子具有強烈相互作用的物質(zhì)，所以黃酮苷元在水中的溶解度較低。對于乙醇水溶液，由于引入了羥基，乙醇分子之間不僅彼此以氫鍵相結(jié)合，而且與水分子也形成氫鍵，降低了水的極性，故黃酮苷元的溶解度增加。乙醇濃度超過40%時極性相對偏低，黃酮苷的溶解度也降低。另外乙醇濃度越高，細胞蛋白質(zhì)越易變性凝固，不利于乙醇向細胞內(nèi)滲透，影響了提取率[18]。從乙醇濃度對提取率的影響表明鼠曲草花中黃酮以含糖基構(gòu)成為主。

2.2 時間對提取率的影響

提取開始時易溶于溶劑的成分以轉(zhuǎn)移到溶劑為主，隨著時間的延長，溶劑中溶解成分濃度增加，從溶劑中轉(zhuǎn)移到被提取物的量逐漸增加，最后形成溶出與吸附平衡。由圖2可知，120 min以后提取率趨于穩(wěn)定，此時黃酮的提取率為3.81%。

2.3 溫度對提取率的影響

溫度越高越有利于黃酮的提取，但同時雜質(zhì)溶出量也相應(yīng)增大，同時對溫度敏感的活性成分易被破壞。由圖3可知，隨溫度的升高，總黃酮提取率呈增加趨勢，溫度從55 ℃到75 ℃提取率增加了約0.5%。70 ℃與75 ℃基本相當(dāng)，故70～75 ℃是較合理的選擇，此時黃酮的提取率為3.7%～3.8%。

2.4 料液比對提取效果的影響

由于黃酮的提取率隨料液比的減小而升高，但溶劑用量大提取的成本也增加。由圖4可知，從單次的料液比效果看，1∶30較1∶20有明顯提高，1∶40時總黃酮的提取率達到最大值，為3.81%。故1∶40為最佳料液比。

2.5 堿液對黃酮提取率的影響

黃酮類化合物分子中多含有酚羥基，顯酸性，故可用堿性溶液提取。黃酮中酚羥基的酸性越弱，要求的堿性越強，才能生成鹽，提高在水中的溶解度。堿液提取時，所用堿的濃度不宜過高，以免在強堿條件下加熱破壞黃酮類化合物的母核[19]。由圖5可知，飽和氫氧化鈣濃度約為0.16%，提取效果高于其他2種堿液。氫氧化鈉、碳酸鈉提取率低可能是因為堿性過強破壞黃酮結(jié)構(gòu)或因堿性弱、濃度過大所導(dǎo)致。堿液提取效果明顯低于40%乙醇的情況說明羥基在乙醇中的溶解度影響大于生成鹽在水中溶解度的影響。

2.6 酶水解對黃酮提取率的影響

由圖6可知，木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解提取總黃酮的效果明顯高于淀粉酶和纖維素酶水解的提取率。說明蛋白質(zhì)的存在會影響黃酮擴散進入提取液。原因可能是，在乙醇的作用下蛋白質(zhì)發(fā)生變性包裹了黃酮，阻滯了乙醇的擴散，還可能是因蛋白質(zhì)中氨基與酚羥基的結(jié)合影響了提取效果。比較水解條件，采用木瓜蛋白酶預(yù)處理后提取鼠曲草花中黃酮更加合理。

2.7 還原能力的測定

通過測定還原能力的大小可以用來證實抗氧化活性的大小[20]。由表1可知，鼠曲草花中黃酮（A）的還原能力大于對照樣蘆丁，且隨濃度的增加還原能力明顯增強。黃酮（B）與蘆丁基本相當(dāng)。蘆丁為5-羥基，4-酮基，3位鍵接糖，含有鄰二酚羥基類黃酮。黃酮（A）為中性醋酸鉛沉淀分離所得黃酮，還原能力大于蘆丁說明黃酮（A）可能在3位含有羥基。而黃酮（B）為一般酚羥基黃酮，不含鄰二酚羥基，但還原能力與蘆丁相當(dāng)，可能3-羥基對還原能力貢獻較大。endprint

2.8 清除DPPH自由基的測定

DPPH自由基在可見光區(qū)的最大吸收峰為517 nm，其乙醇溶液呈深紫色，當(dāng)自由基清除劑存在時由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用分光光度法進行定量分析來檢測自由基消除情況，從而評價某種物質(zhì)的抗氧化能力?？寡趸芰τ们宄时硎?，清除率越大，其抗氧化能力越強[21-22]。由表2可知，黃酮（A）對DPPH自由基的清除能力明顯高于蘆丁，黃酮（B）低于蘆丁。清除DPPH自由基能力與還原能力的表現(xiàn)一致。

2.9 黃酮（A）抗油脂氧化研究

用清除DPPH自由基能力的大小衡量抗油脂的氧化能力是較合理的[17]，為此對黃酮（A）進行了抗豬油氧化效果的研究。由表3可知，黃酮（A）對油脂有明顯的抗氧化作用，312 h內(nèi)過氧化值基本保持不變，且與對照品BHT基本相當(dāng)。但到達336 h后黃酮（A）抗氧化能力逐漸下降，隨著時間的延長POV抑制率值快速下降，說明黃酮（A）抗氧化的持續(xù)效果不及BHT。

3 討論與結(jié)論

試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼠曲草黃酮主要存在于花中，是莖葉的5倍以上，以鄰二酚羥基兼有3-羥基、4-酮基或5-羥基、4-酮基的黃酮類化合物為主要成分?；ㄖ悬S酮的最佳提取條件為乙醇濃度40%、提取溫度70 ℃、料液比1∶40、提取時間2 h，得率為3.81%。文獻[23-24]報道的鼠曲草總黃酮得率分別為4.63%和0.2%，與本文研究結(jié)果不相同，原因是原料品種不同，且文獻中沒有把莖葉和花分開。但報道顯示采用微波或超聲波輔助是提高提取效果的一種方法。

試驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，黃酮（A）表現(xiàn)出較強的還原能力和清除DPPH自由基的能力，在抗豬油氧化試驗中的持續(xù)效果雖不及BHT，但可通過增加黃酮（A）使用量彌補持續(xù)性的不足。文獻[25-27]報道了鼠曲草用乙醇（80%、75%）、甲醇（70%）提取物（含總酚和總黃酮）的抗大豆油脂氧化及還原能力、清除DPPH自由基的能力，與本文研究的結(jié)論基本一致。研究表明，鼠曲草特別是花在醫(yī)用和保健功能方面有較好的功效，在食品加工方面也有開發(fā)潛能。

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