高效液相色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC—ICP—MS）技術(shù)應(yīng)用于人工養(yǎng)殖富硒海帶中硒的研究

呂昭瑋+胡亞漉

實驗前的準備和實驗測定

實驗器材和試劑準確。（1）實驗儀器與試劑： 1100型液相色譜儀、7500型電感式耦合等離子體質(zhì)譜儀以及通過PEEK管連接高效色譜柱和ICP-MS霧化器等，色譜自動進樣器。一級水（Milli-Q水，電阻率為18.25MΩ）用來作為全部的標準溶液和樣品制備用水，色譜純硝酸、色譜純甲醇、分析純Tris以及過氧化氫，分析純主要包括鹽酸、檸檬酸、乙醇銨、氫氧化鈉以及己烷磺酸鈉等物質(zhì)。

（2）標準物質(zhì)：硒標準品有高純度甲基硒代半胱氨酸、高純度硒代蛋氨酸以及分析純亞硒酸鈉。配置得到1mg/L的硒混合標準儲備溶液，將其保存以便后期進行實驗的過程中使用，混合儲備溶保存在冷藏4℃的溫度下。生物標準物質(zhì)，茶葉。

（3）標準溶液：混合元素標準溶液的準備，需要Fe，K，Mg，Na，Ca等溶液分別1000g/L以及Ag，Tl，Co，As，Cd，Mn，Cr，V，Al，Pb，Ni，Zn，Cu等溶液分別100mg/L。以為1%的HNO3進行稀釋，得到100mg/L和20μg/L的STD1和 STD2。另外一種溶液，Hg標準溶液的配備，利用2%的HNO3為介質(zhì)，分別配置1μg/L和2μg/L的Hg，分別記作STD3和STD4。調(diào)諧溶液采用Li，Tl，Ce，Y，Co等濃度分別為10μg/L的混合溶液。另外，采用In，Tb，Ge，Sc，Bi，Y和Li濃度分別為10mg/L的混合溶液稀釋得到1mg/L內(nèi)標溶液。

（4）最后準備富硒前后海帶的兩組樣品，進行研究實驗。

樣品準備。在選擇富硒海帶時，需要針對海帶的質(zhì)量進行篩選，選擇質(zhì)量比較好，生長環(huán)境較好的海帶，選擇的海帶需要保障質(zhì)量，保障一定時間內(nèi)運回實驗室，并且將其放置于海水中，以保持其質(zhì)量和其中含有的成分，放置的方式足以好選擇掛繩法，在其中添加一定量的Na2SeO3，硒的濃度保障在10mg/L，添加一定濃度的氮磷營養(yǎng)鹽，氮的濃度要保持在300μg/L，磷的濃度保持在30μg/L。同時保持一定的光照強度，水中的鹽度需要在4%，溫度在恒溫2℃，用氧氣泵向水中充氧，每兩天換一次水，一共在實驗室水中養(yǎng)殖10天。同時做一組空白對照，不添加硒，其他條件一樣。最后用一級水將海帶洗干凈，在85℃的溫度下將其烘干，冷卻，樣品經(jīng)過粉碎均勻后，干燥保存。

樣品硒形態(tài)的測定準備。本次試驗采用蛋白酶，0.1mol/L HCl，20mmol/L乙酸銨這三種提取液，分別稱取上述樣品1g，各加入提取液20mL，搖勻，超聲提取30min，轉(zhuǎn)速9000r/min離心2min，取上層澄清液體過膜，0.45μm，于2mL進樣瓶待用。

樣品的總硒測定準備。樣品利用微波消解法消化，分別取兩組處理好的海帶干粉樣品三份樣品，每份0.5g，將樣品放置在消解罐中，各加8mL硝酸，加蓋，放入微波消解儀消解，溫度升溫程序為120-150-180℃，功率為1600w，消解后趕酸至2～4mL酸液，再進行放置冷卻后，向容器中加入1mL的H2O2，用一級水多次沖洗消解罐轉(zhuǎn)移樣品，將其定容在25mL，然后測定硒的總含量，同時進行空白對照，不稱取樣品。利用茶葉參考標準物質(zhì)做質(zhì)控，與此同時，對77Se，78 Se，82Se三種物質(zhì)的硒同位素進行測定。

研究實驗結(jié)果與分析

海帶脅迫硒培養(yǎng)前后其中各種元素含量的變化和硒含量的變化情況。根據(jù)上述的STD3和STD4、混標STD1和STD2為準，做標準曲線，用Li、Bi、Tb、In、Se、Ge、Y各1μg/L的混合溶液作為內(nèi)標進行測定，測出結(jié)果每種元素具有良好的相關(guān)線性，標準值測定的結(jié)果和參考物質(zhì)茶葉的各元素測定結(jié)果基本一致，證明實驗的結(jié)果具有一定的可靠性。海帶（以干基計）空白對照組含硒量為0.281μg/g，經(jīng)過人工富集培養(yǎng)的海帶硒的濃度達到900μg/g。海帶中的其他元素能夠在硒的富集作用下產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，并且其中集中元素的濃度會有一定程度的增加。

三種硒形態(tài)的色譜系統(tǒng)分離情況比較分析。

在上圖中，A采用第一種色譜系統(tǒng)（C8色譜柱，流動相為檸檬酸和甲醇，流速0.5mL/min）下，第一出峰是亞硒酸鈉，其次是甲基硒代胱氨酸，最后一是硒代蛋氨酸。B第二種色譜系統(tǒng)（C8色譜柱，流動相為水-甲醇，流速1.0mL/min）下，其中分離度比較大的是硒代蛋氨酸和甲基硒代半胱氨酸。最后一種C色譜系統(tǒng)（C18色譜柱，流動相為乙酸銨-甲醇，流速1.0mL/min）下，三個峰能夠在較短時間內(nèi)出峰完全，同時峰信號強度較強并且峰的形態(tài)比價尖銳。綜上，第三種系統(tǒng)的效果較優(yōu)。

RP-HPLC-ICPMS分離法進行海帶樣品硒形態(tài)的測定。硒狀態(tài)的研究與分析在一定程度上受到提取溶液的影響，利用超聲提取的方式處理樣品，這樣能夠在一定程度上提高效率，以下是按照圖1中的第三種色譜系統(tǒng)進行分離，圖2的ABC分別為用HCL，的乙酸銨溶液以及蛋白酶提取溶液萃取硒形態(tài)的出峰圖，進行分離比較。以HCL萃取亞硒酸鈉、硒代蛋氨酸和硒甲基半胱氨酸，效果最佳。

根據(jù)上述圖1和圖2可以得知，在利用離子對試劑進行反相液相色譜分離實驗中，提高樣品分離的效率不需要柱前衍生化，其中采用上述提取液與流動相結(jié)合C18柱的色譜系統(tǒng)進行提取分離，分離效果比較理想，同時保留的時間比較長，峰形也尖銳不拖尾。

進行人工有目的性的養(yǎng)殖海帶使其富硒，在提高總硒的同時，本實驗也證明有機硒含量也有所提高，而有機硒具有很高的保健價值與防癌作用，結(jié)合我國國情，是我國的保健食品行業(yè)發(fā)展不可或缺的重要部分。其中本次用到的高效液相色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在用于人工養(yǎng)殖富硒海帶中研究總硒及硒形態(tài)中起到關(guān)鍵作用，利用這項技術(shù)能夠保障實驗結(jié)果的準確性，同時能夠保障實驗?zāi)芨咝释瓿?，在一定程度上降低時間成本。因此，需要加強對這項試驗技術(shù)的研究與運用，為未來海帶硒形態(tài)研究實驗打下堅實的基礎(chǔ)。endprint