高效陰離子交換色譜—脈沖安培檢測(cè)法用于重組人促紅素中唾液酸的含量測(cè)定

李響 于雷 范文紅

[摘要] 目的 建立高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法（HPAEC-PAD）測(cè)定重組人促紅素（rhEPO）中唾液酸含量的方法。 方法 將rhEPO樣品用5 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）換液后，調(diào)整濃度到0.33 mg/mL，取20 μL樣品溶液加入10 mU/μL的神經(jīng)氨酸酶20 μL，37℃孵育1 h后，加入0.04 mmol/L的尤羅索尼克酸（KDN）內(nèi)標(biāo)物50 μL，再加入70 μL超純水，混勻后分析測(cè)定。采用CarboPac PA1分析柱，CarboPac PA100保護(hù)柱，流動(dòng)相為150 mmol/L氫氧化鈉與125 mmol/L乙酸鈉混合溶液，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，等度洗脫，數(shù)據(jù)采集時(shí)間15 min。根據(jù)唾液酸峰面積與KDN內(nèi)標(biāo)峰面積的比值與含量的量效關(guān)系，計(jì)算樣品中的唾液酸含量。 結(jié)果 唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.0015～0.0075 μg/mL范圍內(nèi)與唾液酸峰面積與KDN內(nèi)標(biāo)峰面積的比值呈良好的線性關(guān)系，R2 > 0.99；重復(fù)性RSD < 4%；（低、中、高濃度）樣品回收率分別為94.9%、94.3%、96.7%。用建立的HPAEC-PAD法測(cè)定了6批rhEPO中唾液酸含量，與間苯二酚測(cè)定法測(cè)定結(jié)果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.7488）。 結(jié)論 本研究建立了rhEPO中唾液酸含量測(cè)定的HPAEC-PAD方法，該方法線性、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，適用于rhEPO的唾液酸含量的常規(guī)測(cè)定。

[關(guān)鍵詞] 高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法；重組人促紅素；唾液酸；含量

[中圖分類(lèi)號(hào)] R917 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）09（c）-0102-04

[Abstract] Objective To develop a high-performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection （HPAEC-PAD） method to determine the content of sialic acid in recombinant human erythropoietin （rhEPO）. Methods The rhEPO samples were prepared by changing rhEPO bulks to 5 mmol/L phosphate buffer （pH 7.0）， and adjusted to 0.33 mg/mL. Taking 20 μL sample solution， and then 20 μL of 10 mU/μL neuraminidase was added， followed by incubation at 37℃ for 1 h. Finally， 50 μL 0.04 mmol/L ketodeoxynonulosonic acid （KDN） and 70 μL milli-Q water were added and mixed thoroughly followed by detection. CarboPac PA1 separation column and CarboPac PA100 guard column were used， with mobile phase being mixture of 150 mmol/L sodium hydroxide solution and 125 mmol/L sodium acetate solution， column temperature being 30℃， flow rate being 1.0 mL/min， and the data acquisition time being 15 min with isocratic elution. The sialic acid content was calculated based on the dose-effect relation of the ratio of peak area of sialic acid to KDN and the content of sialic acid. Results The concentrations of sialic acid standard solutions and the ratios of peak area of sialic acid to KDN showed a good linearity relationship between 0.0015 and 0.0075 μg/mL with R2 being higher than 0.99， the repeatability RSD was below 4%. The recovery rates of samples at low， medium and high concentration were 94.9%， 94.3% and 96.7%， respectively. Six batches of rhEPO were tested by the developed HPAEC-PAD method and the results had no significant differences compared with the results of resorcinol method （P = 0.7488）. Conclusion This research has successfully established the HPAEC-PAD method to determine the content of sialic acid in rhEPO， with good linearity， repeatability and robustness， which can be used in routine determination of sialic acid in rhEPO.

[Key words] High-performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection； Recombinant human erythropoietin； Sialic acid； Content

重組人促紅素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）是利用基因重組技術(shù)將人的EPO基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)的一種高度糖基化的蛋白質(zhì)，具有促進(jìn)紅細(xì)胞生成的作用，主要用于治療慢性腎功能衰竭產(chǎn)生的貧血[1-3]。rhEPO有165個(gè)氨基酸，3個(gè)N糖和1個(gè)O糖位點(diǎn)[4]，糖鏈含量可達(dá)40%。高度且不均一的糖基化會(huì)影響促紅素體內(nèi)活性[5-7]，這種不均一很大程度上是由糖鏈末端的N-乙酰神經(jīng)氨酸，即唾液酸化引起的，唾液酸化程度的高低直接影響著促紅素蛋白的體內(nèi)半衰期，與rhEPO的生物學(xué)體內(nèi)活性息息相關(guān)，是重要的質(zhì)控指標(biāo)[8-9]。

《中國(guó)藥典》2015年版三部對(duì)促紅素唾液酸含量的測(cè)定采用間苯二酚法[9-12]，所用有機(jī)化學(xué)試劑較多，操作步驟繁瑣，目前已有研究建立液相色譜用于測(cè)定唾液酸含量[13-17]。由于唾液酸無(wú)紫外吸收峰，液相色譜多采用熒光試劑衍生化的方法進(jìn)行間接測(cè)定。本研究采用脈沖積分安培檢測(cè)器，通過(guò)檢測(cè)工作電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的電流變化，建立了高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法（high-performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD），該方法不需要對(duì)唾液酸進(jìn)行衍生化處理，可直接分離測(cè)定rhEPO的唾液酸含量[18-19]。

1 儀器與試劑

主要儀器：離子色譜系統(tǒng)（thermo，ICS-5000+SP）；積分安培檢測(cè)器（thermo）；UV分光光度計(jì)（beckman，R-500）；離心機(jī)（eppendorf，centrifuge5424，離心半徑5 cm）；色譜柱（thermo，CarboPac PA-100 guard column，CarboPac PA-1，CarboPac PA-100）；10 kD超濾離心管（millipore）。

主要試劑：N-乙酰神經(jīng)氨酸（sigma，SLBM6684V）；尤羅索尼克酸（ketodeoxynonulosonic acid，KDN）（Worthington，5-SYQ-138-1）；神經(jīng)氨酸酶（newengland，0151408）；50%氫氧化鈉溶液（thermo，MKCC0616）；乙酸鈉（sigma，043K0111）；磷酸氫二鈉（國(guó)產(chǎn)分析純，20160219）；磷酸一氫鈉（國(guó)產(chǎn)分析純，20170810）。

2 方法與結(jié)果

2.1 rhEPO樣品的處理

取rhEPO樣品200 μL至10 kD超濾離心管中，加入5 mmol/L的磷酸鹽（pH 7.2）緩沖液200 μL，13 000 r/min，離心10 min，重復(fù)3次，調(diào)整濃度到0.33 mg/mL，此為酶切用樣品。取酶切用樣品20 μL，加入10 mU/μL的神經(jīng)氨酸酶20 μL，混勻后，于37℃孵育1 h后，加入0.04 mmol/L的KDN內(nèi)標(biāo)物50 μL，再加入超純水70 μL，混勻后備用，此為供試樣。

2.2 空白對(duì)照的制備

取5 mmol/L的磷酸鹽緩沖液20 μL，加入10 mU/μL的神經(jīng)氨酸酶20 μL，混勻后，如“2.1”方法處理備用，此為空白對(duì)照品。

2.3 唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱(chēng)取24 mg唾液酸，用超純水定容到5 mL，取適量該溶液用超純水稀釋4倍得到唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品母液，濃度為1.2 mg/mL，將唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品母液稀釋到12 μg/mL，此為標(biāo)準(zhǔn)品工作液，依次取標(biāo)準(zhǔn)品工作液20、40、60、80、100 μL，分別加入濃度為0.04 mmol/L的KDN內(nèi)標(biāo)物50 μL，再分別依次加入90、70、50、30、10 μL的超純水，混勻備用，此為唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。含量依次為0.0015、0.003、0.0045、0.006、0.0075 μg/μL。

2.4 唾液酸內(nèi)控品的制備

取標(biāo)準(zhǔn)品工作液50 μL，加入0.04 mmol/L的KDN內(nèi)標(biāo)物50 μL，再加入60 μL的超純水，混勻備用，此為唾液酸內(nèi)控品，含量0.003 75 μg/μL。

2.5 HPAEC-PAD法

HPAEC-PAD法流動(dòng)相為150 mmol/L氫氧化鈉與125 mmol/L乙酸鈉混合溶液。電位參數(shù)設(shè)置：0～0.20 s，+0.10 V；0.20～0.40 s，+0.10 V；0.41～0.42 s，-2.00 V；0.43 s，+0.60 V；0.44～0.50 s，-0.10 V，積分安培信號(hào)采集區(qū)間為0.20～0.40 s。進(jìn)樣量20 μL，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，等度洗脫，數(shù)據(jù)采集時(shí)間15 min。根據(jù)唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與KDN內(nèi)標(biāo)峰面積的比值與含量的量效關(guān)系，計(jì)算樣品中的唾液酸含量。

2.6 間苯二酚法

參照《中國(guó)藥典》2015版三部附錄3102[12]進(jìn)行。

2.7 線性關(guān)系考察

唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。以唾液酸峰面積與內(nèi)標(biāo)KDN峰面積比為縱坐標(biāo)，唾液酸含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y = 119.73x + 0.0137，R2 = 0.9987。標(biāo)準(zhǔn)品含量梯度在范圍0.0015～0.0075 μg/μL內(nèi)，線性良好。

2.8 重復(fù)性與穩(wěn)定性

取1批rhEPO樣品相隔12 h測(cè)定2次，每次重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定結(jié)果匯總見(jiàn)表1。每次試驗(yàn)測(cè)得的唾液酸含量RSD值均<5%，且2次測(cè)定結(jié)果間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.3013）。表明該方法精密度高，重復(fù)性好，12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率考察

取1批rhEPO樣品按“2.1”條件處理后，與唾液酸內(nèi)控品按照8∶2（低）、5∶5（中）、2∶8（高）的體積比混合進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣3次，考察回收率情況，回收率均值在94%～97%之間，表明該方法準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表2。

2.10 rhEPO原液唾液酸含量的測(cè)定

取6批rhEPO原液，按“2.1”條件處理樣品，采用建立的HPAEC-PAD法測(cè)定唾液酸含量，同時(shí)采用間苯二酚法測(cè)定，離子色譜實(shí)驗(yàn)圖譜見(jiàn)圖2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，兩種方法測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.7488）。

3 討論

本研究采用陰離子交換色譜，測(cè)定了6家不同企業(yè)生產(chǎn)的rhEPO原液的唾液酸含量，流動(dòng)相選擇氫氧化鈉和醋酸鈉的水溶液。其中氫氧化鈉提供洗脫離子OH-，而且流動(dòng)性的堿性pH條件也是唾液酸在金電極表面進(jìn)行氧化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)脈沖積分安培檢測(cè)的必要條件。

脈沖積分安培檢測(cè)器對(duì)糖類(lèi)分析測(cè)定時(shí)，多選擇用金電極[20]，本研究采用金工作電極、Ag/AgCl參比電極。在pH 12～13溶液中，在金工作電極和Ag/AgCl參比電極之間施加一個(gè)較高的電位，唾液酸在金電極表面被氧化，而如果電位過(guò)高時(shí)，金電極本身形成表面氧化層，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)響應(yīng)值逐漸降低。電位的設(shè)置主要分為短的延遲區(qū)（E1），用于減小基線漂移，電流積分區(qū)（E2），為唾液酸和電極表面被氧化的正電位，一般應(yīng)不低于0.05 V。受金電極氧化的限制，E2不宜太高，否則背景和噪音將增加，本實(shí)驗(yàn)選擇0.1 V。在積分完畢后，將電位降至清洗電位區(qū)（E3）（-2 V），對(duì)電極進(jìn)行還原，阻止金電極被過(guò)度氧化，然后迅速升高電位至活化電位區(qū)（E4）（+0.6 V），再立即回到初始電位E1，整個(gè)積分周期為0.5 s。經(jīng)過(guò)對(duì)檢測(cè)唾液酸的施加電位的優(yōu)化，克服了基線漂移，降低了背景噪音。

本研究建立了rhEPO的唾液酸含量測(cè)定的離子色譜方法，方法線性，重復(fù)性，穩(wěn)定性良好，可用于rhEPO的唾液酸含量分析測(cè)定。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Biggar P，Kim GH. Treatment of renal anemia：Erythropoiesis stimulating agents and beyond [J]. Kidney Res Clin Pract，2017，36（3）：209-223.

[2] Elliott S，Tomita D，Endre Z. Erythropoiesis stimulating agents and reno-protection：a meta-analysis [J]. BMC Nephrol，2017，18（1）：14-18.

[3] Stebbings R，F(xiàn)indlay L，Edwards C，et al. "Cytokine storm" in the Phase Ⅰ trial of monoclonal antibody TGN1412：better understanding the causes to improve preclinical testing of immunotherapeutics [J]. J Immunol，2007，179（5）：3325-3331.

[4] Jiang J，Tian F，Cai Y，et al. Site-specific qualitative and

quantitative analysis of the N- and O-glycoforms in recombinant human erythropoietin [J]. Anal Bioanal Chem，2014，406（25）：6265-6274.

[5] 王麗，周勇，王軍志.成像毛細(xì)管等電聚焦技術(shù)分析重組人促紅素異質(zhì)性[J].藥物分析雜志，2014，34（6）：1049-1056.

[6] 周勇，邵寶珠，YUEN Chun-ting，等.重組人促紅素糖指紋圖譜分析技術(shù)研究[J].藥物分析雜志，2012，32（4）：587-591.

[7] 劉穎慰，周祥山，劉海峰，等.胞外唾液酸酶造成工程中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞株所產(chǎn)人源重組促紅素唾液酸含量降低[J].生物工程學(xué)報(bào)，2012，28（12）：1492-1499.

[8] 魏冬旭，江連洲，王辰，等.唾液酸生物活性及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品與營(yíng)養(yǎng)，2011，17（7）：64-68.

[9] 李響，陶磊，韓春梅，等.重組人促紅素理化對(duì)照品的質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].藥物分析雜志，2017，37（6）：1117-1126.

[10] Yanagihara S，Taniguchi Y，Hosono M，et al. Measurement of sialic acid content is insufficient to assess bioactivity of recombinant human erythropoietin [J]. Biol Pharm Bull，2010，33（9）：1596-1599.

[11] 張賢達(dá)，雷敏，馬莉，等.靜注人免疫球蛋白唾液酸含量測(cè)定方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2016，29（4）：420-424.

[12] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].三部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[13] 賴(lài)源發(fā)，胡佳，王鋆萍，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定冰糖燕窩中的唾液酸[J].中國(guó)食品添加劑，2015（4）：185-189.

[14] 郭守東，?；?，楊娜娜，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)人血漿及脂蛋白唾液酸的含量[J].色譜，2014，32（11）：1197-1200.

[15] 王蕾，李曉東.高效液相色譜法檢測(cè)嬰兒配方奶粉中唾液酸[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2013，41（5）：52-55.

[16] Chemmalil L，Suravajjala S，See K，et al. A novel approach for quantitation of nonderivatized sialic acid in protein therapeutics using hydrophilic interaction chromatographic separation and nano quantity analyte detection [J]. J Pharm Sci，2015，104（1）：15-24.

[17] Kitajima K，Varki N，Sato C. Advanced Technologies in Sialic Acid and Sialoglycoconjugate Analysis [J]. Top Curr Chem，2015，367（8）：75-103.

[18] Mechelke M，Herlet J，Benz JP，et al. HPAEC-PAD for oligosaccharide analysis-novel insights into analyte sensitivity and response stability [J]. Anal Bioanal Chem，2017， 409（30）：7169-7181.

[19] Spicer SE，Adams J，Thomas DS，et al. Novel rapid method for the characterisation of polymeric sugars from macroalgae [J]. J Appl Phycol，2017，29（3）：1507-1513.

[20] 于泓，牟世芬.離子色譜中的安培檢測(cè)方法及其應(yīng)用[J].化學(xué)通報(bào)，2007，1（7）：483-488.

（收稿日期：2018-04-02 本文編輯：張瑜杰）