黃芩苷通過抗氧化對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH—SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

吳宜艷 韓楊 李玲玉

[摘要] 目的 探討黃芩苷通過抗氧化對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。 方法 將SH-SY5Y細(xì)胞按照培養(yǎng)方法的不同分成五組：對(duì)照組（正常培養(yǎng)基），模型組（200 μmol/L H2O2），低、中、高劑量黃芩苷組（先用50、100、200 μmol/L藥物保護(hù)，然后用H2O2損傷）。采用MTT法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞的存活率，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞的硫氧還蛋白（Trx）表達(dá)，采用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、脂質(zhì)氧化丙二醛（MDA）的含量。 結(jié)果 模型組吸光度與細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組（P < 0.01），與模型組比較，不同劑量黃芩苷組吸光度與細(xì)胞存活率均不同程度升高，其中，低、中劑量黃芩苷組與模型組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。與對(duì)照組比較，模型組MDA升高，Trx、SOD和GSH-Px降低（P < 0.01）。與模型組比較，低、中劑量黃芩苷組MDA降低，Trx、SOD及GSH-Px升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 黃芩苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抗氧化作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 黃芩苷；抗氧化作用；神經(jīng)損傷；保護(hù)作用

[中圖分類號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）09（c）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the protective effects of baicalin on damaged SH-SY5Y cells induced by H2O2 through antioxygenation. Methods According to the different culture methods， SH-SY5Y cells were divided into five groups： control group （normal culture media）， model group （200 μmol/L H2O2）， low， medium， high dose of baicalin groups （protected by 50， 100， 200 μmol/L baicalin first， then damaged by H2O2）. The survival rate of the SH-SY5Y cells were determined by MTT. The expression of thioredoxin protein （Trx） in cells was detected by Western blot. The contents of superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px） and lipid oxidative malonaldehyde （MDA） were detected by kits. Results The absorbancy and cell survival rate in the model group were significantly lower than those of control group （P < 0.01）. Compared with model group， the absorbancy and cell survival rate of different doses of baicalin groups were all increased to different degrees， among which， there were highly statistically significant differences of low， medium doses of baicalin groups cpmpared with model group （P < 0.01）. Compared with control group， the MDA of model group increased significantly， while the Trx， SOD and GSH-Px decreased significantly （P < 0.01）. Compared with model group， the MDA of low， medium doses of baicalin groups decreased， while the Trx， SOD and GSH-Px increased， there were statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Baicalin has protective effects on the damaged SH-SY5Y cells induced by H2O2， the mechanism may be related to antioxidation.

[Key words] Baicalin； Antioxygenation； Nerve injury； Protective effect

氧化應(yīng)激是引起神經(jīng)損傷的原因之一，氧化代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）等合成的增加，會(huì)進(jìn)一步加重神經(jīng)元功能的損傷[1-2]。SH-SY5Y細(xì)胞源自人成神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH系，此細(xì)胞能夠表達(dá)神經(jīng)元所特有的酪氨酸羥化酶、多巴胺、多巴胺-β羥化酶和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體[3]，因此它常作為多巴胺能細(xì)胞模型，用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病及作用機(jī)制方面的研究[4-7]。H2O2是重要的活性氧之一，在活性氧的作用下，組織細(xì)胞會(huì)因脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生許多脂自由基活性氧，使類脂中的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致組織細(xì)胞受損。研究表明黃芩苷能通過血腦屏障進(jìn)入大腦等中樞神經(jīng)系統(tǒng)[8]并且能保護(hù)神經(jīng)元，降低神經(jīng)功能損傷[9]，但是黃芩苷保護(hù)神經(jīng)損傷的機(jī)制不明。本研究建立了H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型，檢測(cè)黃芩苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷后硫氧還蛋白（Trx）的表達(dá)，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）及MDA的含量變化的影響，以研究黃芩苷對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

IX70-142倒置式生物顯微鏡（日本奧林巴斯）；MCO-17AIC二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋）；MDL550酶標(biāo)定量測(cè)定儀（美國(guó)伯樂公司BIO-RAD）。黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715-200212）；SH-SY5Y細(xì)胞株（上海銳聰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；人Trx抗體（兔多克隆抗體，Abcam公司，貨號(hào)：ab26320）；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清（Hyclone公司，貨號(hào)：SH30023.01B和SH30084）；青霉素和鏈霉素（Gibco公司，貨號(hào)：15140-122）；苯甲基磺酰氟（PMSF，Sigma公司，貨號(hào)：p-7626）；SOD、GSH-Px、MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20141211）。

1.2 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)及分組

細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于含有10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，放置于含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天換液1次，每6～7天傳代1次，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分成五組：對(duì)照組，模型組，低、中、高劑量黃芩苷組。

1.3 藥物配制

黃芩苷貯備液：將黃芩苷對(duì)照品用無菌二甲基亞砜（DMSO）溶解并配制成10 mmoL/L的溶液；30%H2O2貯備液：將H2O2用滅菌三蒸水配制成10 mmoL/L的溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后4℃冰箱保存?zhèn)溆?。上述兩種貯備液臨用時(shí)均以DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。單去污劑：1 mol/L Tris·HCl（pH 8.0）2.5 mL，NaCl 0.438 g，曲拉通X-100 0.5 mL，加去離子水至50 mL，4℃保存?zhèn)溆谩ＥR用前取2.87 mL PMSF加入50 mL單去污劑中混勻即可用于細(xì)胞裂解提取蛋白。

1.4 MTT法檢測(cè)黃芩苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞以1×104個(gè)的密度接種至96孔板中，空白孔和對(duì)照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組用含有200 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基培養(yǎng)，低、中、高劑量黃芩苷組分別加入終濃度為50、100、200 μmol/L的黃芩苷預(yù)培養(yǎng)24 h，再加入終濃度為200 μmol/L的H2O2繼續(xù)作用24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液30 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入DMSO 200 μL，充分震蕩10 min后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD）/（對(duì)照組OD-空白組OD），以觀察黃芩苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y保護(hù)情況。

1.5 Western blot法檢測(cè)黃芩苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞Trx蛋白表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SH-SY5Y細(xì)胞，以2×105個(gè)的密度接種至6孔板中，于單層細(xì)胞貼壁并融合至約80%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。低、中、高劑量黃芩苷組預(yù)先加入上述不同濃度的黃芩苷溶液作用24 h后，除對(duì)照組外，其余各組均加入H2O2并使其終濃度為200 μmol/L，再作用24 h后，于各組6孔板內(nèi)加入500 μL裂解液（含PMSF），用研磨棒在冰上充分研磨組織，然后冰浴10 min，旋渦混合儀上震動(dòng)30 s，并在離心半徑為10 cm的離心機(jī)上，4℃ 12 000 r/min離心15 min，提取總蛋白。SDS-PAGE凝膠使用10%丙烯酰胺分離膠和5%丙烯酰胺濃縮膠。取樣品100 ng點(diǎn)樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，用BSA封閉1 h。用BSA配制的Trx抗體4℃過夜孵育。第2天用PBST洗3遍，每次10 min，然后用TBS配制的二抗Goat Anti-Rabbit IgG室溫孵育1.5 h，TBS洗3遍，每次10 min，DAB顯影，拍照。

1.6 分光光度法檢測(cè)各組細(xì)胞MDA、SOD和GSH-P指標(biāo)

低、中、高劑量黃芩苷組預(yù)先加入上述不同濃度的黃芩苷溶液作用24 h后，除對(duì)照組外，其余各組均加入H2O2并使其終濃度為200 μmol/L，再作用24 h后，于各組6孔板內(nèi)加入500 μL裂解液（含PMSF），用研磨棒在冰上充分研磨組織，然后冰浴10 min，加入適量冷裂解液，研磨勻漿，并在離心半徑為10 cm的離心機(jī)上，以3000 r/min離心10 min后取上清液，按試劑盒說明書，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定各組細(xì)胞MDA、SOD和GSH-P含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graph Pad Prism 5.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組比較采用One Way ANOVA檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量黃芩苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

模型組吸光度與細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），與模型組比較，低、中、高劑量黃芩苷組細(xì)胞的吸光度與細(xì)胞存活率均不同程度升高，但高劑量黃芩苷組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），而低、中劑量黃芩苷組與模型組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 不同劑量黃芩苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞Trx表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組Trx表達(dá)下調(diào)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；與模型組比較，不同劑量黃芩苷預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，Trx表達(dá)均不同程度升高，但是高劑量黃芩苷組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），而低、中劑量黃芩苷組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01、P < 0.05）。見圖1。

2.3 不同劑量黃芩苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的SH-SYSY細(xì)胞SOD、GSH-Px、MDA表達(dá)影響

與對(duì)照組比較，模型組MDA升高，SOD和GSH-Px降低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；不同劑量黃芩苷預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，高劑量黃芩苷組MDA、SOD和GSH-Px與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），低、中劑量黃芩苷組與模型組比較，MDA降低，SOD、GSH-Px升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

3 討論

隨著世界人口老齡化加劇，阿爾茨海默?。ˋD）發(fā)病率不斷升高，神經(jīng)損傷問題日趨嚴(yán)重。AD是一種退行性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為認(rèn)知能力下降、漸進(jìn)性記憶力減退，是最常見的一種老年癡呆。國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直在探討其發(fā)病機(jī)制，但AD病因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚[10]。

氧化應(yīng)激在神經(jīng)損傷等疾病的發(fā)生、發(fā)展中起促進(jìn)作用，可用于其病情及預(yù)后的評(píng)估。MDA是常見的氧化應(yīng)激標(biāo)志物之一，MDA可在人體內(nèi)自然形成，參與機(jī)體的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生極大毒性損害。根據(jù)機(jī)體內(nèi)MDA水平可判斷生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的情況，從而推測(cè)自由基對(duì)神經(jīng)組織的損傷情況。SOD可反映機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力，是一種含有金屬元素的活性蛋白酶，具有高度專一性，SOD活性水平降低與神經(jīng)組織受損直接相關(guān)[11]。GSH-Px是谷胱甘肽系統(tǒng)中一種重要的酶，它能調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原平衡，它在降低過氧化氫或氧化型脂質(zhì)的水平中起到重要作用[12]。文獻(xiàn)報(bào)道，神經(jīng)損傷組織中MDA水平較高而SOD、GSH-Px明顯降低[11-12]。

Trx是一種分子量12 kD的小分子蛋白質(zhì)，具有氧化還原活性[13]，廣泛存在于生物體組織中，也是腦內(nèi)一種重要的抗氧化蛋白。研究表明，Trx參與機(jī)體的氧化還原反應(yīng)，調(diào)節(jié)一些重要轉(zhuǎn)錄因子的活性和抑制細(xì)胞凋亡[14-16]。SH-SY5Y細(xì)胞常用于神經(jīng)損傷方面的研究，H2O2作用于細(xì)胞使細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致組織細(xì)胞受損，是常用的細(xì)胞損傷模型[17]。

研究表明黃芩苷能直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用[18-21]。本研究建立了H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型，H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷后MDA明顯增加，SOD、GSH-Px明顯降低，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[11-12]。本研究結(jié)果提示低、中劑量黃芩苷能夠逆轉(zhuǎn)H2O2的損傷情況，增加SH-SY5Y細(xì)胞存活率，對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。同時(shí)提示，黃芩苷能夠降低損傷細(xì)胞的MDA水平從而減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，增加SOD和GSH-Px活性，說明中低劑量黃芩苷能增加損傷細(xì)胞的氧自由基清除能力及調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原平衡能力。中低劑量黃芩苷增加了Trx蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步提示黃芩苷通過調(diào)節(jié)Trx來增強(qiáng)細(xì)胞調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)的能力。但是本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量黃芩苷組作用不明顯，可能是因?yàn)辄S芩苷濃度過高反而有細(xì)胞毒性，具體情況有待進(jìn)一步研究?？傊?，適量的黃芩苷可以通過抗氧化對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

黃芩苷具有很強(qiáng)的藥理活性，其抗氧化作用既對(duì)各種因素引起的腦損傷神經(jīng)元細(xì)胞有明顯保護(hù)作用，又能通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)。綜上所述，黃芩苷是通過參與調(diào)節(jié)Trx蛋白的氧化還原系統(tǒng)和細(xì)胞凋亡途徑，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用，本研究結(jié)果與以往的報(bào)道一致[18-19]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Son JW，Choi H，Yoo A，et al. Activation of the phosphatidylinositol 3-kinase pathway plays important roles in reduction of cerebral infarction by cilnidipine [J]. J Neurochem，2015，135（1）：186-193.

[2] Qu ZS，Zhang QD，Li L. Impact of low-dose urokinase in peritoneal dialysis on serum oxidative stress，nitric oxide and endothelin in cerebral infarction complicated with uremia [J]. Int J Clin Exp Med，2015，8（1）：1333-1341.

[3] Moore DJ，West AB，Dawson VL，et al. Molecular pathophysioligy of Parkinson′s disease [J]. Annu Rev Neurosci，2005，28：57-87.

[4] Sun ZW，Zhang L，Zhu SJ，et al. Excitotoxicity effects of glutamate on human neuroblastoma SH-SY5Y cells via oxidative damage [J]. Neurosci Bull，2010，26（1）：8-16.

[5] Nakaso K，Ito S，Nakashima K. Caffeine activates the PI3K/Akt pathway and prevents apoptotic cell death in a Parkinson′s disease model of SH-SY5Y cells [J]. Neurosci Lett，2008，432（2）：146-150.

[6] Lopes FM，Schr？觟dera R，da Frota ML Jr，et al. Comparison between proliferative and neuron-like SH-SY5Y cells as an in vitro model for Parkinson disease studies [J]. Brain Res，2010，1337：85-94.

[7] 余涓，胡桂芳，翁繩美，等.13-甲基十四烷酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2010，15（6）：622-626.

[8] 張陸軍，邢東明，王偉，等.靜脈注射黃芩總苷后黃芩苷在大鼠血漿及大腦皮層的藥物動(dòng)力學(xué)比較[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2005，21（6）：765-766.

[9] 李敏，曹慧，王斌，等.基于AQP-4、GFAP的黃芩苷、梔子苷配伍抗腦缺血大鼠神經(jīng)功能損傷的研究[J].中藥藥理與臨床2017，33（2）：56-59.

[10] 李筱筱，魏芬芬，孫雅煊，等.胰島素信號(hào)通路參與阿爾茲海默癥發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].生命的化學(xué)，2017， 37（3）：386-390.

[11] 匡濤，劉旭，朱家偉，等.腦出血患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶和氧化-抗氧化因子的動(dòng)態(tài)變化研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2016，45（32）：4558-4561.

[12] Lappalainen Z，Lappalainen J，Oksala NK，et al. Diabetes impairs exercise training-associated thioredoxin response and glutathione status in rat brain [J]. J Appl Physiol（1985），2009，106（2）：461-467.

[13] Tonissen KF，Di Trapani G. Thioredoxin system inhibitors as mediators of apoptosis for cancer therapy [J]. Mol Nutr Food Res，2009，53（1）：87-103.

[14] Calabrese V，Guagliano E，Sapienza M，et al. Redox regulation of cellular stress response in aging and neurodegenerative disorders：role of vitagenes [J]. Neurochem Res，2007，32（4/5）：757-773.

[15] Joshi MB，Ivanov D，Philippova M，et al. A requirement for Thiore-doxin in redox-sensitive modulation of T-cadherin expression in endothelial cells [J]. Biochem J，2008，416（2）：271-280.

[16] Kabe Y，Ando K，Hirao S，et al. Redox regulation of NF-kappaB activation：distinct redox regulation between the cytoplasm and the nucleus [J]. Antioxid Redox Signal，2005， 7（3/4）：395-403.

[17] 鄭俊超，暢洪昇，馬素亞，等.天絲飲中多糖成分對(duì)H2O2損傷SH-SY-5Y的保護(hù)作用對(duì)比研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（8）：3717-3720.

[18] 陳宇瓊，孫東岳，吳恒芳，等.黃芪甲苷改善過氧化氫誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的研究[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2017，37（8）：949-954.

[19] 顏明，趙冰海，張春雷，等.黃芩苷通過硫氧還原蛋白介導(dǎo)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32（10）：1278-1281.

[20] 徐妍，嚴(yán)旺，蔡雅衛(wèi)，等.異鉤藤堿通過mTOR非依賴性途徑誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬發(fā)生[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2016，54（17）：28-34.

[21] 顏明，劉潔婷，李洪志，等.黃芩苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其對(duì)Trx表達(dá)的影響[J].中國(guó)生化藥物雜志，2012，33（5）：574-577.

（收稿日期：2017-11-30 本文編輯：張瑜杰）