RP—HPLC法測定中藥鎮(zhèn)痛合劑中梔子苷含量

秦學玲 楊璐璐 任李玥

摘要：目的 建立RP-HPLC法測定中藥鎮(zhèn)痛合劑中梔子苷的含量。方法 色譜柱為INersil C18 色譜柱（4.6 mm×200 mm，5μm），流動相：乙腈—0.1%磷酸—四氫吷喃（10∶ 90∶ 0.8），流速為1.0 mL/min，檢測波長為238 nm，柱溫為35 ℃。結果 梔子苷的進樣量在0.1324-1.324μg（R=0.9999）范圍內呈良好的線性關系；平均回收率為99.74%，RSD=為0.53%（n=6）。結論 該方法快速簡便，結果準確可靠，可用于中藥鎮(zhèn)痛合劑中梔子苷的含量測定；為中藥鎮(zhèn)痛合劑的質量控制提供科學的依據(jù)。

關鍵詞：中藥鎮(zhèn)痛合劑；梔子苷；高效液相色譜法；含量測定

中圖分類號：R927.2 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2018）11-0079-02

中藥鎮(zhèn)痛合劑是由成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院研制，由梔子、洋金花等藥材提取精制成的中藥制劑，具有鎮(zhèn)痛消腫、活血化瘀、涼血止血的功效，用于跌打損傷、韌帶拉傷所致的腫痛及出血等。梔子為方中君藥，本身具有清熱解毒，涼血利濕，瀉火除煩，消腫止痛的功效[3]?，F(xiàn)代研究表明，梔子中含有以梔子苷為主的多種有效成分，梔子苷具有明顯的鎮(zhèn)痛、消腫和一定抗炎的作用，為梔子抗炎鎮(zhèn)痛消腫的有效成分[1-2]。并且梔子苷是梔子中含量測定的法定指標成分[3]。中藥鎮(zhèn)痛合劑是院內研發(fā)制劑，目前尚未建立有效的含量測定方法。因此，本文采用RP-HPLC測定中藥鎮(zhèn)痛合劑中梔子的主要有效成分梔子苷的含量[3-4]，為全面評價中藥鎮(zhèn)痛合劑的質量提供了簡便快速、準確可靠的方法，為進一步開發(fā)使用中藥鎮(zhèn)痛合劑提供質量基礎。

1 儀器與試藥

儀器：島津LC一6AD高效液相色譜儀；島津SPD一20A紫外檢測器（日本Shimadzu）；分析天平（Sarturius CPA 225D，十萬分之一）；分析天平（梅特勒AE240，萬分之一）；UF 15SFD型超聲波（功率300W，頻率60kHz）。

試藥：中藥鎮(zhèn)痛合劑（批號：20170612、20170613、20170614）樣品由成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院提供；梔子苷對照品（批號：110749-2012714）由中國食品藥品檢定研究院提供；陰性樣品為自制；甲醇為色譜純；實驗用水為雙蒸水；其他試劑均為分析純。

2 溶液制備

2.1 對照品溶液 精密稱取梔子苷對照品0.01324 g，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含梔子苷0.2648 mg的對照品溶液。

2.2 供試品溶液 精密量取中藥鎮(zhèn)痛合劑1 mL，置于具塞錐形瓶中，置水浴上蒸干，精密加入90%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，加熱回流提取20 min，放冷，再稱定重量，用90%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液20 mL，置于50 mL量瓶中，加90%甲醇至刻度，搖勻，再精密量取10 mL，置25 mL量瓶中，加90%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性對照溶液 依照中藥鎮(zhèn)痛合劑的處方制備缺梔子的陰性樣品，按2.2”項下方法制備溶液，既得。

3 色譜條件

色譜柱為INersil C18 色譜柱（4.6 mm×200 mm，5μm），流動相：乙腈—0.1%磷酸—四氫吷喃（10∶ 90∶ 0.8），流速為1.0 mL/min，檢測波長為238 nm，柱溫為35 ℃。進樣量：10μL。

在此色譜條件下，梔子苷對照品，樣品和缺梔子的陰性樣品的分離色譜圖見圖1。

4 線性關系考察

精密吸取 2.1項下的梔子苷對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分別置于20 mL量瓶中，加甲醇定容制成濃度分別為13.24、26.48、52.96、79.44、105.92、132.4 g/mL的系列對照品溶液，分別吸取上述各濃度對照品溶液10μl，注入液相色譜儀，測定峰面積，以進樣量（μg）為橫坐標（X），以測得峰面積為縱坐標（Y），線性回歸，即得梔子苷回歸方程y=3001.7x+29.612（R=0.9999，n=6）線性范圍：0.1324～1.324μg。結果表明梔子苷線性關系良好。

5 精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗

精密吸取“2.1”項下的梔子苷對照品溶液10 μL，平行進樣六次，注入液相色譜儀，以峰面積計算，結果梔子苷RSD 為0.75%。

精密吸取“2.2”項下的供試品溶液，連續(xù)進樣6次，以色譜峰面積計算，結果6 次測得梔子苷的平均含量為18.01 mg/mL，RSD%=0.08，說明重復性良好。

取同一批號樣品（批號：20170612）按上述“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于放置0、3、6、9、12、15、18、24h時，再按“3”項下色譜條件進樣測定，以峰面積計算，梔子苷的RSD（n=8）為0.98%。結果表明室溫條件下，供試品溶液中的梔子苷化合物在24h內穩(wěn)定。

6 加樣回收率試驗

精密稱取梔子苷對照品0.18105 g于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為1.8105 mg/mL的對照品溶液。精密量取此對照品溶液10 mL、分別置于錐形瓶中。取6份，蒸干，備用。精密量取已知含量的同一批（批號：20170612）供試品0.5 mL，6份，分別置于上述錐形瓶中。按“2.2”項下方法制備所需溶液，按含量測定方法操作，測定供試品溶液中各成分的含量，記錄峰面積，計算梔子苷的平均回收率為99.74%，RSD 為0.53%（n=6），結果詳見表1。

7 含量測定

按上述色譜條件，依法測定3批樣品中梔子苷的含量，結果見表2

8 討論

8.1 流動相的選擇[3-6] 流動相的選擇方面我們曾使用了甲醇-水、甲醇-0.2%醋酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%醋酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液等系統(tǒng)進行洗脫，結果存在分離不好。而采用乙腈—0.1%磷酸—四氫吷喃（10∶ 90∶ 0.8），作為流動相，分離效果好，峰形對稱，重現(xiàn)性好，基線較穩(wěn)定。

8.2 樣品的處理方面 （1）提取溶劑我們考察了以甲醇、90%甲醇水溶液，70%甲醇水溶液，40%的甲醇水溶液為提取溶劑，結果90%甲醇提取效果較好，所以采用90%甲醇為提取溶劑；（2）提取方法我們采用了3種提取方式，分別是超聲提取、回流提取、浸漬提取，主要成分的提取結果顯示回流提取效果最佳。故確定采用回流提取。

采用HPLC法測定中藥鎮(zhèn)痛合劑中梔子苷的含量，方法學驗證表明其精密度、穩(wěn)定性、重復性和加樣回收率均能滿足定量測定要求，方法操作簡便，結果可靠。因此，本方法可用于控制中藥鎮(zhèn)痛合劑的質量，對類似處方制劑的質控也有借鑒作用。

參考文獻：

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（收稿日期：2018-06-15）