經(jīng)MEGJ的cAMP傳遞介導(dǎo)Ang2調(diào)節(jié)缺氧大鼠血管平滑肌細(xì)胞低反應(yīng)性*

徐 競(jìng)， 楊光明， 李 濤， 劉良明

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所二室， 創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400042)

嚴(yán)重創(chuàng)傷/休克是40歲以下人群的重要死亡原因，在嚴(yán)重創(chuàng)傷/休克晚期出現(xiàn)的血管低反應(yīng)性，是導(dǎo)致患者對(duì)血管活性物質(zhì)的舒縮反應(yīng)功能降低甚至喪失的重要原因，甚至可導(dǎo)致患者即使接受積極復(fù)蘇仍然無(wú)法維持血壓，很大程度上影響著患者的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸[1-2]。

本實(shí)驗(yàn)室以往研究發(fā)現(xiàn)，失血性休克晚期表達(dá)增高的血管生成素2 (angiopoietin-2，Ang2)對(duì)血管誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表達(dá)和血管舒縮功能的調(diào)節(jié)作用是導(dǎo)致血管低反應(yīng)性發(fā)生的重要機(jī)制[3-4]。然而我們又發(fā)現(xiàn)，盡管Ang2對(duì)血管iNOS表達(dá)和血管低反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)表面特異表達(dá)的Tie2受體，但介導(dǎo)Ang2調(diào)節(jié)作用的iNOS卻大部分由血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，VECs與VSMCs間的縫隙連接，即肌內(nèi)皮縫隙連接(myoendothelial gap junction，MEGJ)介導(dǎo)了缺氧大鼠VSMCs的iNOS的表達(dá)增高和低反應(yīng)性的調(diào)節(jié)， 其中，縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)是參與其中的縫隙連接子亞型調(diào)節(jié)分子，但具體機(jī)制尚不清楚。

基礎(chǔ)研究表明，MEGJ主要以低電阻快速傳遞電信號(hào)的電偶聯(lián)功能以及通透和傳遞小分子物質(zhì)的通道功能，在相鄰的細(xì)胞A和細(xì)胞B之間實(shí)現(xiàn)跨細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和通訊[5]?？p隙連接允許電信號(hào)和分子質(zhì)量低于1 000 Da或直徑小于1.0 nm的離子或小分子物質(zhì)通過(guò)，如H2O和第二信使[Ca2+、肌醇三磷酸(inositol triphosphate，IP3)、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP]等[5]。iNOS的表達(dá)不依賴于鈣離子，與膜電位無(wú)關(guān)[6]，且有文獻(xiàn)報(bào)道，在大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中，cAMP高表達(dá)可誘導(dǎo)iNOS表達(dá)[7]。那么， 失血性休克后Cx43通道開(kāi)放是否可以通過(guò)傳遞第二信使物質(zhì)cAMP，介導(dǎo)內(nèi)皮依賴的Ang2對(duì)VSMCs的iNOS表達(dá)和血管反應(yīng)性的調(diào)節(jié)呢？

本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠VECs和VSMCs雙面共培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行RNA干擾(RNA interfe-rence，RNAi)和缺氧(hypoxia)等處理，后采用Wes-tern blot技術(shù)檢測(cè)VSMCs中iNOS的表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)FITC標(biāo)記的牛血清白蛋白(FITC-labeled bovine se-rum albumin，F(xiàn)ITC-BSA)的熒光透過(guò)率反映VSMCs的收縮反應(yīng)性，采用Alexa Fluor 488-cAMP觀察cAMP跨MEGJ轉(zhuǎn)運(yùn)情況，研究MEGJ介導(dǎo)缺氧VSMCs的iNOS高表達(dá)和低反應(yīng)性的調(diào)節(jié)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

從第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買清潔級(jí)SD大鼠， 雌雄各半，體重200～230 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)為SCXK(渝)2012-0010?？勾笫螃?actin和iNOS抗體、外源性重組Ang2、FITC-BSA、cAMP ELISA試劑盒和cAMP 抑制劑Rp-8-Br-cAMP購(gòu)自Sigma；羊抗兔或抗小鼠IgG的 II 抗購(gòu)自Pierce；Cx43 小干擾RNA(small interfering RNA， siRNA)、Cx40 siRNA及siRNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；Alexa Fluor 488-cAMP和Influx Pinocytic 細(xì)胞加載試劑購(gòu)自Molecular Probes。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1VECs和VSMCs雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)的建立、 RNAi處理和缺氧處理 按照文獻(xiàn)方法，將SD大鼠麻醉后分離腸系膜上動(dòng)脈，分別原代培養(yǎng)VECs和VSMCs[8]，并建立VECs和VSMCs雙面共培養(yǎng)模型[6]：采用Transwell雙面培養(yǎng)皿(Corning，膜孔徑為0.4 μm)，以1×105的密度在膜反面接種VSMCs，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，然后以2×105的密度在膜正面接種VECs，最后將接種好的雙面培養(yǎng)皿置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d， 細(xì)胞融合>90%即可。

RNAi處理時(shí)，采用培養(yǎng)好的VECs和VSMCs雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)，按照siRNA轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書建議的操作步驟，將轉(zhuǎn)染試劑(終濃度0.4 μL/100 μL)分別轉(zhuǎn)染Cx43 siRNA(25 nmol/L)和Cx43 siRNA(50 nmol/L)，在無(wú)抗生素的20%小牛血清DMEM-F12完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d，完成RNAi處理，以陰性對(duì)照(negative cintrol)siRNA作對(duì)照，明確抑制效果。

作缺氧處理時(shí)，將已接種并培養(yǎng)好的雙面培養(yǎng)皿置入缺氧罐，充入缺氧氣體(5% CO2和95 % N2)15 min，然后夾閉平衡10 min，完成“充氣-夾閉”循環(huán)5次后，再做1次充氣15 min，最后按照各實(shí)驗(yàn)組要求夾閉相應(yīng)時(shí)間，即完成缺氧處理。Ang2+缺氧處理組：在缺氧處理前于雙面培養(yǎng)基的VECs面加入外源性重組Ang2， 終濃度為200 μg/L， 后進(jìn)行缺氧處理。

2.2cAMP 轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)，采用熒光標(biāo)記的Alexa Fluor 488-cAMP觀察cAMP的跨MEGJ轉(zhuǎn)運(yùn)[7]：取按實(shí)驗(yàn)分組完成缺氧等處理的雙面培養(yǎng)皿，用Influx Pinocytic 細(xì)胞加載試劑在VECs中加載Alexa Fluor 488-cAMP，濃度125 μmol/L，穩(wěn)定10 min后，取雙面培養(yǎng)皿膜，Leica TCS-SP激光共聚焦顯微鏡沿Z軸進(jìn)行XY平面層掃，掃描間隔0.13 μm。以VECs側(cè)和VSMCs側(cè)XY平面的Alexa Fluor 488-cAMP熒光密度差值定量cAMP的跨MEGJ轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.3VSMCs蛋白提取和iNOS蛋白表達(dá)檢測(cè) 取按實(shí)驗(yàn)組完成缺氧等處理的雙面培養(yǎng)皿，在細(xì)胞裂解液中刮取雙面培養(yǎng)皿膜的下表面細(xì)胞(接種VSMCs)，室溫裂解30 min后，4 °C、 12 000×g離心15 min，即得到VSMCs的蛋白成分。iNOS蛋白表達(dá)檢測(cè)采用常規(guī)Western blot法，以β-actin為內(nèi)參照。

2.4VSMCs收縮反應(yīng)性的測(cè)定 取完成缺氧等處理的雙面培養(yǎng)皿，每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)雙面培養(yǎng)皿，一個(gè)為實(shí)驗(yàn)皿加去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)處理，另一個(gè)為對(duì)照皿不加去甲腎上腺素處理。在雙面培養(yǎng)皿的上腔液中加入10 g/L的FITC-BSA， 然后在下腔液中加入NE或培養(yǎng)基 (實(shí)驗(yàn)皿中加入1×10-9mol/L的NE，對(duì)照皿中加入等體積的培養(yǎng)基)。每間隔15 min從下腔液中抽取等體積(100 μL)培養(yǎng)液，根據(jù)下腔抽取液的熒光值計(jì)算累計(jì)熒光通透率，檢測(cè)VSMCs的收縮反應(yīng)性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行多個(gè)樣本均值的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 缺氧及Ang2處理后單獨(dú)培養(yǎng)和雙面共培養(yǎng)VECs和VSMCs中的cAMP濃度差的變化

在單獨(dú)培養(yǎng)的VECs和VSMCs中，與正常對(duì)照(normal control)組比較， 4 h缺氧及外源性Ang2(200 μg/L)處理30 min后， cAMP濃度均顯著增高；但VECs和VSMCs的水平并不相同，VECs中cAMP的水平顯著高于VSMCs中的水平(P<0.05)，見(jiàn)圖1A。但在雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)中，VECs和VSMCs中cAMP的濃度差明顯降低，且VSMCs中增高的cAMP水平可被Cx43 siRNA (50 nmol/L)顯著抑制(Cx43 siRNA在雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)的VECs側(cè)，缺氧前給藥)(P<0.05)；Cx40 siRNA (25 nmol/L)無(wú)明顯抑制作用，見(jiàn)圖1B。

2 缺氧及Ang2處理后cAMP跨MEGJ轉(zhuǎn)運(yùn)的變化

根據(jù)以往研究，采用Alexa Fluor 488-cAMP 為cAMP轉(zhuǎn)運(yùn)的示蹤劑，觀察cAMP從VECs到VSMCs的跨MEGJ轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)果顯示，在4 h缺氧及Ang2(200 μg/L)處理后，熒光標(biāo)記的cAMP明顯地從VECs轉(zhuǎn)運(yùn)到VSMCs(P<0.05)，且這種轉(zhuǎn)運(yùn)可以被Cx43 siRNA (50 nmol/L；在雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)的VECs側(cè)，缺氧前給藥)顯著抑制(P<0.05)；而Cx40 siRNA (25 nmol/L)無(wú)明顯抑制作用，見(jiàn)圖2。

Figure 1. The change of cAMP level in separately cultured and co-cultured VECs and VSMCs after hypoxia and Ang2 treatment. A: the separately cultured VECs and VSMCs. B: the double-sided co-culture model. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsAng2+4 h hypoxia group;△P<0.05vsVSMCs in the same group.

圖1缺氧及Ang2處理后單獨(dú)培養(yǎng)和雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)VECs和VSMCs中的cAMP濃度差的變化

3 抑制cAMP對(duì)VSMCs的iNOS高表達(dá)和收縮反應(yīng)的影響

缺氧后雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)的VSMCs中iNOS表達(dá)顯著增高，收縮反應(yīng)性顯著降低，并在外源性Ang2(200 μg/L)作用下進(jìn)一步加重； 在雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)的VECs和VSMCs側(cè)分別給予cAMP抑制劑Rp-8-Br-cAMP (100 μmol/L)，均可顯著抑制外源性Ang2作用下缺氧后VSMCs的iNOS表達(dá)增高(P<0.05)，并改善VSMCs的收縮低反應(yīng)性(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 2. The change of cAMP transfer across MEGJ after hypoxia and Ang2 treatment. The scale bar=250 μm. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsAng2+4 h hypoxia group.

圖2缺氧及Ang2處理后cAMP跨MEGJ轉(zhuǎn)運(yùn)的變化

討 論

血管低反應(yīng)性是嚴(yán)重創(chuàng)傷/休克等臨床重癥晚期的重要病理生理改變，Ang2對(duì)血管iNOS表達(dá)和血管舒縮功能的調(diào)節(jié)是導(dǎo)致休克血管低反應(yīng)性發(fā)生的重要機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，MEGJ介導(dǎo)了Ang2對(duì)缺氧大鼠VSMCs的iNOS表達(dá)增高和低反應(yīng)性的調(diào)節(jié)，Cx43是主要的Cx亞型。但Cx43亞型又是通過(guò)何種分子的通透進(jìn)行跨細(xì)胞的信息傳遞？目前仍不清楚。

Cx的亞型很多，在血管系統(tǒng)中表達(dá)有Cx37、 Cx40、 Cx43 和Cx45[9-10]，但本文中只觀察了Cx40和Cx43，主要原因如下：第一，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道， Cx40和Cx43是血管收縮功能相關(guān)的亞型[11-13]，Cx45在血管系統(tǒng)的發(fā)生和成熟中發(fā)揮作用[14]，Cx37在血管的狹窄閉塞中起作用，如動(dòng)脈粥樣硬化等[15-16]；第二，在體內(nèi)[6]和體外[17-18]實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)，VECs和VSMCs之間的MEGJ中只有Cx40和Cx43存在，而沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他Cx亞型。因此， 本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)觀察了Cx40和Cx43的作用，發(fā)現(xiàn)在單獨(dú)培養(yǎng)的VECs和VSMCs中，4 h缺氧及Ang2處理后， cAMP濃度均顯著增高，但在VECs和VSMCs中的水平并不相同，在VECs中的水平顯著高于VSMCs中的水平；但在雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)中，VECs和VSMCs中的cAMP濃度差明顯降低，且VSMCs中增高的cAMP水平可被Cx43 siRNA顯著抑制。在Ang2處理的缺氧后，熒光標(biāo)記的Alexa Fluor 488-cAMP發(fā)生明顯的從VECs到VSMCs的轉(zhuǎn)運(yùn)，且可被Cx43 siRNA顯著抑制。 在雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)的VECs或VSMCs側(cè)給予cAMP抑制劑均可顯著抑制Ang2處理的缺氧后VSMCs中的iNOS高表達(dá)，改善VSMCs的收縮反應(yīng)性，提示缺氧后MEGJ通道可能通過(guò)傳遞第二信使物質(zhì)cAMP，調(diào)節(jié)VSMC中的iNOS表達(dá)和血管舒縮功能。

Figure 3. The effects of cAMP antagonist (Anta) on the iNOS protein expression in VSMCs (A) and the vascular hyporeactivity (B). Mean±SD.n=4.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsAng2+4 h hypo-xia group.

圖3抑制cAMP對(duì)VSMCs的iNOS高表達(dá)和收縮反應(yīng)的影響

我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，缺氧后VECs和VSMCs存在cAMP的濃度差異，并通過(guò)跨MEGJ的轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)VSMCs收縮反應(yīng)調(diào)節(jié)，實(shí)際上在以往的文獻(xiàn)里面也有一致的相關(guān)報(bào)道。例如在家兔髂動(dòng)脈，乙酰膽堿促使cAMP經(jīng)MEGJ進(jìn)入VSMCs富集，從而誘導(dǎo)血管舒張，縫隙連接解偶聯(lián)劑18β-甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)以及連接蛋白模擬抑制肽37,43Gap27可抑制其作用[19]；在兔動(dòng)脈血管，乙酰膽堿誘發(fā)的EDHF型內(nèi)皮依賴的血管舒張反應(yīng)伴隨著增高的cAMP水平，尤其是在VSMCs中，抑制cAMP水解可以增強(qiáng)舒張反應(yīng)，這種舒張反應(yīng)可以被GJ解偶聯(lián)劑18α-GA和連接蛋白特異的Gap27抑制肽所抑制[20]，提示cAMP可透過(guò)MEGJ，參與內(nèi)皮依賴的血管舒縮功能的調(diào)節(jié)。這與我們的研究結(jié)果一致。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)，缺氧后Ang2可能通過(guò)MEGJ的Cx43通道蛋白，促進(jìn)從VECs向偶聯(lián)的VSMCs傳遞cAMP，調(diào)節(jié)VSMCs中的iNOS表達(dá)和血管舒縮功能，從而參與血管低反應(yīng)性的發(fā)生。

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