流感病毒生物傳感器檢測方法研究進(jìn)展

董玲娜，劉 瑛，鄭黎潤，劉 欣

（1. 十堰市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，湖北十堰 442000；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心，湖北十堰 442000）

流感病毒嚴(yán)重威脅動物生產(chǎn)、食物供應(yīng)和人類健康?？焖?、敏感的病原學(xué)早期檢測與診斷不僅利于識別潛在的病原體，而且利于控制傳染病蔓延[1-2]。病原檢測方法除了基于病毒分離培養(yǎng)的細(xì)胞或雞胚培養(yǎng)方法外，還有血凝試驗（HA）、血凝抑制試驗（HI）、中和試驗（NT）和ELISA檢測等血清學(xué)診斷方法。盡管這些傳統(tǒng)方法有效且敏感，但需要大量病毒顆粒、特殊設(shè)備以及復(fù)雜的操作。因此，傳統(tǒng)方法用于現(xiàn)場檢測仍存在困難[3]，迫切需要開發(fā)高靈敏度和選擇性，而且有效、快速的病毒診斷和鑒定方法。

近來，國內(nèi)外學(xué)者將目光聚焦于生物傳感器。其簡單、小型化和潛在的實時分析能力，被認(rèn)為可快速有效實現(xiàn)病毒診斷[4]。本文重點綜述可用于流感病毒診斷的生物傳感器，為開發(fā)便攜式、自動化的生物傳感器提供參考。

1 生物傳感技術(shù)原理與分類

生物傳感器是由固化的生物敏感材料作識別元件（包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物標(biāo)志物），與適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器（如氧電極、光敏管、場效應(yīng)管、壓電晶體等）及信號放大裝置構(gòu)成的分析工具或系統(tǒng)，具有接受器和轉(zhuǎn)換器的功能。生物感受器是其最重要的組成部分，其生化特性保證了生物標(biāo)志物檢測的高靈敏度和選擇性，并且避免了測試樣品中的其他微生物或分子干擾。生物傳感器將生物感受器與被檢測物質(zhì)之間發(fā)生的特定生化作用，通過傳感器轉(zhuǎn)換為可測量信號，對記錄和顯示的許可生物標(biāo)志物進(jìn)行定性和定量分析[5]。

生物傳感器按分子識別元件即敏感材料不同，如酶、微生物個體、細(xì)胞器、動植物組織、抗原和抗體、核酸等細(xì)分為酶傳感器、微生物傳感器、細(xì)胞器傳感器、組織傳感器、免疫傳感器、DNA生物傳感器；按換能器不同，如電化學(xué)電極、半導(dǎo)體、光電轉(zhuǎn)換、熱敏電阻、壓電晶體等細(xì)分為生物電極傳感器、半導(dǎo)體生物傳感器、光生物傳感器、熱生物傳感器、壓電晶體生物傳感器等。

目前，開發(fā)用于病毒等病原體檢測的生物傳感器主要有以下3個目的：（1）用于特異生物標(biāo)志物的確定與檢測分析；（2）提高生物測定方法的穩(wěn)定性，使其適應(yīng)野外和/或復(fù)雜生物樣品的檢測分析；（3）提高檢測的敏感度，以便在動物出現(xiàn)臨床癥狀之前確診，防止病毒等病原體潛在地傳播。

2 流感病毒生物傳感器

盡管生物傳感器種類很多，但是因流感病毒的特殊性，至今只開發(fā)出部分生物感受器用于檢測。

2.1 單一技術(shù)生物傳感器

2.1.1 免疫傳感器 研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒血凝素（HA）表面蛋白能結(jié)合人和禽類細(xì)胞表面的唾液酸-聚糖殘基（α-2,6和α-2,3-唾液酸）。禽類流感病毒表達(dá)的HA能特異性地與腸道上最先表達(dá)的α-2,3-唾液酸結(jié)合。而人類流感病毒表達(dá)的HA更傾向于與人上呼吸道上皮細(xì)胞的α-2,6-唾液酸聚糖結(jié)合。因此，基于唾液酸結(jié)合差異，現(xiàn)已開發(fā)了用于檢測和區(qū)分禽類和人類流感病毒的生物傳感器[6]。大多數(shù)基于抗體的流感病毒傳感器，都采用側(cè)向流動試驗。側(cè)向流動試驗可以檢測復(fù)雜介質(zhì)中特定的流感生物標(biāo)志物。通常，抗體可區(qū)分A型和B型流感病毒，但不能很好地區(qū)分亞型。相反，針對特定流感病毒的特異性RNA/DNA引物，可區(qū)分流感病毒亞型。側(cè)向流動試驗具有簡單、有效、可靠和非標(biāo)記檢測的特征，雖可檢出蛋白質(zhì)，但仍須改進(jìn)，以便在糞便拭子樣品等復(fù)雜基質(zhì)中檢出病毒顆粒[7]。如：用銀納米顆?？煞糯蟊壬盘栠_(dá)1 000倍，用量子點放大的側(cè)向流動試驗，可檢出0.09 ng/mL的最低下限值。最近，基于量子點的側(cè)向流免疫分析系統(tǒng)，可定量檢測A型流感病毒的H5和H9亞型。用量子點放大信號對特異性抗體進(jìn)行修飾，可在紫外燈下定量檢出病毒[7]。

2.1.2 DNA生物傳感器 DNA生物傳感器采用指數(shù)富集配基系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)，可區(qū)分流感病毒的不同血清型。核酸適配體是具有既定3D結(jié)構(gòu)的人工核酸，是一種很好的抗體替代品，生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)時間短，不需要動物宿主。核酸適配體在皮摩爾范圍內(nèi)可呈現(xiàn)很好的結(jié)合親和力[8]。因此，與大多數(shù)抗體為基礎(chǔ)的免疫傳感器相比，DNA生物傳感器的檢測靈敏度更高。目前，已開發(fā)出針對流感病毒各種蛋白的適體。這些適體對H5N1和H1N1等特異的流感病毒亞型表現(xiàn)出特異性的結(jié)合能力。針對量子點黏附的流感病毒產(chǎn)生的適體，可用于病毒顆粒和超微結(jié)構(gòu)標(biāo)記的感染樣本檢測。此外，一些適體可結(jié)合HA蛋白位點，識別宿主細(xì)胞表面唾液酸，減弱病毒感染性，因而可作為潛在抗病毒藥物使用[9]。

2.1.3 壓電晶體生物傳感器 已開發(fā)的糖基固化場效應(yīng)晶體管生物傳感器可檢測并區(qū)分超低濃度的人（H1）和禽（H5）流感病毒[10]。

2.1.4 其他 表面等離子體共振、光波導(dǎo)和石英晶體微平衡等已被用于基于糖基的禽流感病毒檢測。HA能結(jié)合到納米金顆粒包被的唾液酸，以此在沒有任何預(yù)處理或擴(kuò)增步驟的情況下檢測到流感病毒，通過比色能產(chǎn)生與病毒效價成線性比例的特性[11]。

2.2 多種技術(shù)組合生物傳感器

2.2.1 電化學(xué)免疫傳感器 最近，開發(fā)了一種基于特異性抗M1抗體的電化學(xué)免疫傳感器，其可檢出A型流感病毒的所有亞型，靈敏度與經(jīng)典分子方法（80×103～100×103PFU/mL）相似。通過將抗M1單克隆抗體與金納米顆粒偶聯(lián)在石英晶體微平衡分析系統(tǒng)中，可有效檢出更低的病毒（1×103PFU/mL）。通過與金納米顆粒修飾碳納米管結(jié)合的特異性抗M1抗體，建立了一種靈敏的等離子體輔助熒光免疫分析方法[12]。流感病毒與這些混合納米顆粒結(jié)合后，通過添加碲化鎘量子點產(chǎn)生熒光信號，量子點的熒光所致發(fā)光強(qiáng)度隨病毒濃度的變化而變化，檢出限為50 PFU/mL。此外，電化學(xué)免疫傳感器為檢測和定量分析感染細(xì)胞中A型流感病毒PB1-F2蛋白，提供了一個非常靈敏的平臺，其檢出下限可達(dá)0.42 nm PB1-F2[13]。另外，研制的無PCR配對表面等離子體光波生物傳感器可檢出A型流感病毒。

2.2.2 微陣列技術(shù)傳感器 微陣列技術(shù)也常用于監(jiān)測病原體毒力基因或同時篩查多種病原體。大多數(shù)流感微陣列利用一系列引物對流感病毒HA、NA和M1基因進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。耦合DNA微陣列和多重逆轉(zhuǎn)錄酶PCR微陣列，利于流感病毒株的分型分析[14]。最近報道的一種三維DNA流式生物芯片，可用于流感病毒的分型分析；目前開發(fā)了一種專門針對呼吸道病毒檢測和基因分型的基因芯片；針對人群H1N1、H3N2 的A型流感病毒亞型循環(huán)以及高致病性禽流感A/H5N1病毒，建立了基于微陣列的快速鑒別方法[15]。由于微陣列通常經(jīng)由熒光讀出，因此檢測流感病毒的電化學(xué)微陣列具有廣闊潛力。如，12 500多個探針的甲型流感病毒微陣列硅芯片，能很好地進(jìn)行A型流感病毒HA和NA蛋白的鑒定和病毒基因亞型分型[16]。目前，也設(shè)計了基于聚糖的微陣列。在臨床檢測極限（10個斑塊形成單位）之外，利用微陣列，其依然能捕獲并顯示出不同流感病毒毒株的檢測結(jié)果，有利于臨床相關(guān)病毒的診斷。

2.3 生物傳感器的優(yōu)缺點

各種生物傳感器在檢測流感病毒方面，表現(xiàn)出了共同的特征：快速、靈敏、準(zhǔn)確，然而不同方法也有所差別。就靈敏度而言，傳統(tǒng)的免疫生物傳感器檢出濃度要求高，而電化學(xué)免疫傳感器、壓電晶體生物傳感器、DNA生物傳感器等能檢出極低的濃度。就檢測準(zhǔn)確性或分型檢測而言，DNA生物傳感器利用流感病毒特異性RNA/DNA引物，可更好區(qū)分病毒亞型。此外，多種技術(shù)組合也利于病毒亞型檢測。這些方法盡管各具優(yōu)勢，但其共性的問題是大多適用于實驗室診斷，而不利于現(xiàn)場檢測[15]。盡管目前已開發(fā)了PCR、RTQPCR、RT-RPA試劑盒和便攜式機(jī)器的移動診斷箱，但是為有效整合擴(kuò)增和檢測的穩(wěn)定性，提高流感病毒及其亞型的檢測靈敏度，需要將PCR/等溫擴(kuò)增和生物傳感器技術(shù)相組合[11]?？梢姡_發(fā)小型化和自動化的微陣列生物傳感器用于構(gòu)建便攜式流感病毒診斷平臺是當(dāng)前研究熱點[16]。

3 小結(jié)

綜上所述，不同類型的生物傳感器各具優(yōu)勢?；诤怂岬纳飩鞲衅鬟m合于快速靈敏的測試，但存在核酸提取和擴(kuò)增等樣品制備的局限；基于抗體和適體的生物傳感器能具體分析病毒亞型，但這一特征不僅常依賴生物分子的選擇性，而且也取決于它們在傳感器表面上固化后的穩(wěn)定性。盡管這些新技術(shù)仍存在一定缺陷，但它們的廣泛使用及其累積的數(shù)據(jù)將有助于疫病防控，減低公共健康風(fēng)險。