甘肅省永靖縣奶牛布魯氏菌病監(jiān)測(cè)與病原分離鑒定

吳志倉(cāng)1，曹小安2，林學(xué)仕1，張俊文1，張麗蓉1，金淑霞1，王烈花1

（1. 永靖縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅永靖 731600；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046）

布魯氏菌病（以下簡(jiǎn)稱(chēng)布?。┦俏覈?guó)的人乙類(lèi)傳染病、家畜二類(lèi)傳染病，也是世界衛(wèi)生組織（WHO）確認(rèn)的致殘率最高的動(dòng)物源性人獸共患病。畜間布病以牛羊?yàn)橹?，染疫家畜及其產(chǎn)品是人間布病的主要傳染源，牲畜養(yǎng)殖、畜產(chǎn)品加工、動(dòng)物防疫和布病防治工作人員是高危人群。布病不僅危害人體健康，還阻礙畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，嚴(yán)重影響社會(huì)穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1]。

最近幾年，布魯氏菌廣泛流行于我國(guó)大部分地區(qū)，特別是西北地區(qū)。布魯氏菌有多種血清型，其中羊主要感染馬耳他布魯氏菌3型，牛主要感染流產(chǎn)布魯氏菌1型和3型。豬布魯氏菌多在我國(guó)南方一些地區(qū)流行，北方比較少見(jiàn)[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，布病呈全國(guó)擴(kuò)散趨勢(shì)，且流行菌株的特征發(fā)生了一些變化，如羊原來(lái)以馬耳他布魯氏菌1型感染為主，現(xiàn)在轉(zhuǎn)變?yōu)轳R耳他布魯氏菌3型[4-5]。因此，為查明永靖縣奶牛布魯氏菌病流行情況、感染菌種和類(lèi)型，以便為布病防控提供技術(shù)支撐，2013-2017對(duì)永靖縣奶牛進(jìn)行了連續(xù)5年的布病監(jiān)測(cè)，并對(duì)2016年檢出的布病陽(yáng)性牛，采集病料進(jìn)行了病原分離與鑒定。

1 材料與方法

1.1 監(jiān)測(cè)動(dòng)物和樣品采集

對(duì)永靖縣劉家峽鎮(zhèn)、太極鎮(zhèn)、鹽鍋峽鎮(zhèn)、峴塬鎮(zhèn)、三塬鎮(zhèn)和西河鎮(zhèn)6個(gè)川塬區(qū)鄉(xiāng)鎮(zhèn)26個(gè)行政村農(nóng)戶(hù)中飼養(yǎng)的8月齡以上奶牛（懷孕后期奶牛為避免應(yīng)急反應(yīng)引起流產(chǎn)暫不檢測(cè)）進(jìn)行采樣監(jiān)測(cè)。血清樣品采集，按常規(guī)無(wú)菌采血方法，空腹尾頸脈采血置于試管中，然后將試管擺成斜面，置于4 ℃冰箱，5 h后取出，放在室溫下待血清自然析出后收集血清；收集3份疑似感染布魯氏菌奶牛脾臟樣品，-20 ℃冷凍保存?zhèn)錂z。

1.2 試劑

Rnase A酶、Proteinase K和PCR反應(yīng)酶等：購(gòu)自于大連寶生物公司；BBLTM布魯氏菌肉湯培養(yǎng)基和布魯氏菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇添加劑：購(gòu)自于BD公司；SDS、酚-氯仿-異戊醇和引物等：來(lái)自于上海生工。無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 培養(yǎng)基制備

取BBLTM布魯氏菌肉湯 28 g、瓊脂15 g，加入蒸餾水或去離子水900 mL，調(diào)制到pH7.2，然后定容至1 L，攪拌加熱至完全溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，待培養(yǎng)基溫度降至60 ℃左右時(shí)，加入50 mL無(wú)菌馬血清和新配制的布魯氏菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇添加劑，混合均勻后制作布魯氏菌固體培養(yǎng)基平皿，備用。

1.4 血清學(xué)檢測(cè)

采集血清用虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）初篩，對(duì)初篩檢測(cè)出的陽(yáng)性奶牛血樣進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)（SAT）。操作及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，按照《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646-2002）進(jìn)行。

1.5 病原檢測(cè)

1.5.1 病料中基因組提取 取米粒大小脾臟放入離心管中，參照文獻(xiàn)[6]提取總基因組DNA：在離心管中加入 400 μL NET buffer、100 μL 20%的SDS（終濃度3.4%），混勻，95 ℃孵育10 min后，迅速放置于冰上冷卻；在樣品中加入Rnase A酶至終濃度為 75 μg/μL，50 ℃作用 2 h后，加入 proteinase K至終濃度為 325 μg/μL，50 ℃作用 2 h；在消化液中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1），顛倒搖勻2～3次，4 ℃ 7 000 r/min離心10 min；轉(zhuǎn)移上清液于另一離心管中，重復(fù)用酚-氯仿-異戊醇抽提2次后，加入2.5倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，-20 ℃ 沉 淀 30 min，12 000 r/min離 心 10 min，棄取所有液相；用1 mL 70%乙醇漂洗2～3次，12 000 r/min離心2 min；真空或室溫干燥后，將DNA沉淀物用50 μL無(wú)菌雙蒸水溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 PCR檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[6]，用布魯氏菌Nested-PCR 檢測(cè)病料中的細(xì)菌。一擴(kuò)反應(yīng)體系：ExTaq mix 25 μL，BP1和 BP2引物各 1μL，模板4 μL、無(wú)菌雙蒸水 19 μL；二擴(kuò)：ExTaq mix 25 μL，BP3和BP4引物各1μL，一擴(kuò)產(chǎn)物2 μL、無(wú)菌雙蒸水21 μL。一擴(kuò)反應(yīng)條件：95 ℃充分變性5 min，35個(gè)循環(huán)，分別為94 ℃變性1 min，49 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃延伸10 min；二擴(kuò)：20個(gè)循環(huán)，分別為94 ℃變性30 s，51 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，72 ℃延伸 6 min。1.6 細(xì)菌分離

取采集的病料100 mg左右放于1.5 mL離心管，加入500 μL無(wú)菌生理鹽水，用組織破碎儀破碎，5 000 r/min 離心10 min，無(wú)菌條件下將沉淀均勻涂布在選擇性培養(yǎng)基平皿。將涂布好的平板置37 ℃5%～10% CO2溫箱培養(yǎng)，每天觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，記錄生長(zhǎng)菌落數(shù)量、顏色、大小、光滑度等。培養(yǎng)15 d后無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者為陰性。以接種針挑取選擇性培養(yǎng)平板單菌落，劃線接種于固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，置37 ℃ CO2溫箱培養(yǎng)，觀察純培養(yǎng)細(xì)菌在固體和液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)特性。

1.7 分離菌株AMOS-PCR檢測(cè)

AMOS-PCR 體 系：ExTaq mix 25 μL、AMOS-（A1）1 μL、AMOS-（M）1.5 μL、AMOS-（O）1.5 μL、AMOS-（S）1 μL、AMOS-（A2）1 μL、AMOS-（IS711）2 μL、DNA 模板 3 μL、ddH2O 14 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，40 循環(huán)：94 ℃ 1 min，60 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min；最后72 ℃作用10 min。引物見(jiàn)表1。

表1 分離菌株AMOS-PCR檢測(cè)

1.6 分離菌株的omp25基因測(cè)序

為進(jìn)一步鑒定分離菌株，選用該細(xì)菌保守的omp25基因作序列分析。用已知的序列引物擴(kuò)增分離菌落的DNA，獲得omp25基因，將其克隆到pMD18-T載體上，送入測(cè)序公司測(cè)序。方法參照文獻(xiàn)[6]。將測(cè)序結(jié)果與已知公開(kāi)的其它基因組序列用Mega軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)檢測(cè)

2013-2017年永靖縣共檢測(cè)奶牛1 431頭，檢出布魯氏菌病陽(yáng)性奶牛64頭，平均個(gè)體陽(yáng)性率為4.47%；共檢測(cè)奶牛群160個(gè)，檢出布魯氏菌病陽(yáng)性牛群12個(gè)，平均群體陽(yáng)性率為7.50%。其中：2013-2014年檢測(cè)奶牛444頭，未檢出陽(yáng)性牛；2015-2016年檢測(cè)奶牛706頭，檢出陽(yáng)性牛63頭，個(gè)體陽(yáng)性率分別8.92%；2017年檢測(cè)281頭，檢出陽(yáng)性1頭，個(gè)體陽(yáng)性率為0.36%（表2）。對(duì)檢出的陽(yáng)性牛全部進(jìn)行了撲殺和無(wú)害化處理。

2.2 Nested-PCR 檢測(cè)

通過(guò)Nested-PCR 對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3份樣本均為布魯氏菌陽(yáng)性（圖1）。

圖1 Nested-PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.3 細(xì)菌分離鑒定

培養(yǎng)15 d內(nèi)，3份樣本中，只有1份生長(zhǎng)出透明、光滑菌落。

2.4 分離菌株AMOS-PCR檢測(cè)

對(duì)分離獲得的1株細(xì)菌進(jìn)行AMOS-PCR鑒定，結(jié)果擴(kuò)增出流產(chǎn)布魯氏菌特征性條帶（圖2）。

2.5 分離菌株omp25基因測(cè)序與分析

omp25基因測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)結(jié)果表明，分離獲得菌株的omp25基因序列與已經(jīng)公布的基因序列高度一致，為流產(chǎn)布魯氏菌菌株特有序列（圖3、圖4）。

3 討論

圖2 AMOS-PCR鑒定結(jié)果

圖3 omp25基因測(cè)序結(jié)果

圖4 布魯氏菌omp25基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

永靖縣從1971年開(kāi)始采取檢疫、撲殺病畜、免疫注射、治療病人等綜合防治措施防治布病，1983年達(dá)到了“控制區(qū)”標(biāo)準(zhǔn)，1995年達(dá)到了“穩(wěn)定控制區(qū)”標(biāo)準(zhǔn)[5]。 查閱1996-2014年永靖縣奶牛布病監(jiān)測(cè)記錄，發(fā)現(xiàn)該地連續(xù)18年未檢出陽(yáng)性牛。而本次監(jiān)測(cè)在2015-2016年突然檢出63頭陽(yáng)性牛，個(gè)體陽(yáng)性率高達(dá)8.9%。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這些病例主要是輸入性病例，檢測(cè)出的11個(gè)陽(yáng)性奶牛群中，只有3個(gè)是自養(yǎng)牛群，其他全部是從周邊地區(qū)調(diào)入的，表明永靖縣的奶?！奥涞貦z疫”存在漏洞。

2017年永靖縣檢測(cè)奶牛281頭，檢出布魯氏菌病陽(yáng)性1頭，個(gè)體陽(yáng)性率下降到0.36%；檢測(cè)牛群35個(gè)，檢出陽(yáng)性群1個(gè)，群體陽(yáng)性率下降到2.86%，說(shuō)明對(duì)檢出的布病陽(yáng)性牛全部撲殺并進(jìn)行無(wú)害化處理的措施效果明顯。今后，應(yīng)當(dāng)加大監(jiān)測(cè)頻次，每年至少開(kāi)展2次奶牛布病檢測(cè)、1次飼養(yǎng)人員布病檢測(cè)。

最近幾年布病在我國(guó)再次流行，特別是在西北地區(qū)，由馬耳他布魯氏菌引起的羊布病流行嚴(yán)重，局部地區(qū)出現(xiàn)疫情暴發(fā)[7-8]。由于羊布病的廣泛流行，在西部地區(qū)，馬耳他布魯氏菌也成為牛布病的主要病原[9-11]。本研究經(jīng)細(xì)菌分離與鑒定發(fā)現(xiàn)，感染該地奶牛的布魯氏菌為流產(chǎn)布魯氏菌，說(shuō)明永靖縣奶牛布病的感染源仍來(lái)自牛，無(wú)跨種傳播跡象。

4 結(jié)論

本研究對(duì)2013-2017年永靖縣8月齡以上奶牛進(jìn)行了布病監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該地奶牛布病個(gè)體陽(yáng)性率呈現(xiàn)突然上升隨后下降趨勢(shì)，說(shuō)明“檢測(cè)-撲殺”的布病防控措施效果明顯；對(duì)分離出的1株布魯氏菌菌株，通過(guò)AMOS-PCR檢測(cè)和opm25基因測(cè)序分析，鑒定為流產(chǎn)布魯氏菌，說(shuō)明該地奶牛布病感染主要來(lái)源于牛。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，布病陽(yáng)性病例主要是輸入性病例，說(shuō)明需要加強(qiáng)牛只跨區(qū)移動(dòng)的檢疫和監(jiān)管。