犢牛魏氏梭菌的分離鑒定及致病性研究

陳 萌，蘇 波，胡樹賢，劉 朋，程子龍，張建東，劉思當

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安 271000；2. 山東省禹城市畜牧獸醫(yī)局，山東禹城 251200；3. 泰安市畜牧獸醫(yī)局，山東泰安 271000）

魏氏梭菌又稱產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens），是一種廣泛存在于自然環(huán)境中，能夠引發(fā)人和動物相關疾病的重要病原體[1]。該菌也是腸道中的常在菌之一，在一定條件下，可以引起畜禽的氣性壞疽、腸毒血癥、壞死性腸炎、猝死癥，以及人的氣性壞疽和食物中毒等[2-4]。該菌致病作用主要在于它所產(chǎn)生的毒素。目前已發(fā)現(xiàn)的毒素有20種，根據(jù)其產(chǎn)生的致死性毒素α、β、ε和ι，可將其分為A、B、C、D、E 5種毒素型[5]。

2017年1月，山東省某規(guī)?；膛?0～20日齡犢牛出現(xiàn)腹瀉、拉血便等癥狀，并有部分犢牛突然死亡。經(jīng)過尸體剖檢、病理組織學檢查、細菌分離鑒定、PCR及動物致病性試驗等，確診造成該牛場發(fā)病的病原為A型魏氏梭菌。根據(jù)藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)該菌對青霉素等較為敏感，并因此為牛場制定了相應的防治方案，使疫情得以迅速控制，從而降低了牛場經(jīng)濟損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 無菌采集病死犢牛的心、肝、脾、肺、腎、腸道等器官組織及腸內(nèi)容物。對其中一份器官組織于10%福爾馬林溶液固定，另一份立即放冰箱冰凍保存。

1.1.2 實驗材料 引物：上海生工有限公司合成；rTaq酶、DNA Marker DL 2000：購自Takara公司；ddH2O：本實驗室配制；凝膠回收試劑盒：購自BIOMEGA 公司；DNA/RNA提取試劑盒：購自北京全式金生物有限公司；血液瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽培養(yǎng)液：參照獸醫(yī)微生物學實驗指導制作或配制[6]。

1.1.3 試驗動物 健康昆明小鼠：購自泰安市泰邦技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病理學診斷 剖檢病死牛，觀察組織器官的眼觀病理變化；取病料于10%福爾馬林溶液固定，按照常規(guī)方法制作石蠟切片[7]，HE染色，鏡檢組織病理學變化。

1.2.2 細菌分離培養(yǎng) 將無菌采集的肝、肺等組織，分別接種于血液瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)1 d，觀察細菌生長情況及菌落形態(tài)。

1.2.3 染色鏡檢 挑取單個菌落置于載玻片上，分別進行革蘭氏染色、瑞氏染色，鏡檢觀察細菌染色特性及形態(tài)特征。

1.2.4 生化鑒定 取血液瓊脂培養(yǎng)基中分離菌的純培養(yǎng)物，參照文獻[8]，用杜氏小管進行常規(guī)生化試驗。

1.2.5 16SrRNA分子鑒定 設計檢測引物，進行PCR擴增；將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后回收目的基因片段并測序。

1.2.6 主要毒素基因PCR鑒定 根據(jù)魏氏梭菌的5種主要毒素基因序列（CPA、CPB、CPE、ETX、ITXA），設計合成引物進行PCR檢測，并將目的條帶膠回收測序。引物序列信息見表1。

表1 PCR鑒定引物序列信息

1.2.7 藥敏試驗 使用本實驗室自制的藥敏片進行藥敏試驗，按照美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）標準判定。

1.2.8 動物致病性試驗 腸內(nèi)容物毒素致病性試驗：無菌采集病死犢牛腸內(nèi)容物，10 000 r/min離心5 min，取上清，用0.22 μm濾器過濾；取健康小鼠4只，其中2只尾靜脈注射0.3 mL濾液，另外2只注射0.3 mL生理鹽水作為陰性對照，觀察小鼠的情況。分離菌毒力致病性試驗：取健康昆明小鼠9只，隨機分為3組，每組3只。取分離菌的純培養(yǎng)物，分別腹腔注射第1、2組健康小鼠0.1、0.2 mL/只，第3組作為陰性對照，每只注射0.2 mL生理鹽水。接種后分開飼養(yǎng)，24 h內(nèi)觀察小鼠情況。剖檢小鼠，觀察組織器官的病理學變化，并采集心、肝、肺、腎等組織樣品，分離細菌。

2 結果

2.1 剖檢病變及病理組織學檢查

剖檢病死犢牛，可見肺臟尖葉實變（圖1-A），膈葉氣腫；腸系膜淋巴結暗紅色腫大，空腸鼓氣，內(nèi)含暗紅色內(nèi)容物（圖1-B）；盲腸與結腸出血鼓氣（圖1-C、1-D）；直腸黏膜面有較多出血點（圖1-E）；真胃黏膜表面有較多小潰瘍灶（圖1-F）。

圖1 剖檢病變

通過組織病理學觀察，可見肺泡壁增寬，肺泡壁毛細血管充血、出血（圖2-A）；脾臟血管擴張充血（圖2-B）；腸絨毛斷裂，腸黏膜上皮細胞壞死脫落，黏膜固有層和黏膜下層明顯充血、出血、水腫，肌層肌纖維斷裂（圖2-C、2-D、2-E）；胃黏膜上皮細胞壞死脫落（潰瘍面），黏膜固有層大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤（圖2-F）。

圖2 組織病理學觀察

2.2 細菌培養(yǎng)鑒定

經(jīng)血液瓊脂培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)1 d后，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)黑色圓形菌落，有溶血現(xiàn)象。挑菌，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，可見兩端鈍圓、粗大桿菌樣革蘭氏陽性菌。

2.3 生化試驗鑒定

分離菌生化試驗鑒定結果見表2。生化反應結果與《伯杰細菌手冊》對照，各項指標均與所述鑒定標準相符，綜合培養(yǎng)及生化試驗結果，初步判斷所分離菌為魏氏梭菌。

表2 生化試驗鑒定結果

2.3 PCR鑒定

用DNA提取試劑盒，對分離菌提取DNA；以分離菌總DNA為模板，使用設計的16S基因檢測引物進行擴增，得到大于1 000 bp的條帶（目的片段為1 450 bp）；將PCR擴增條帶進行膠回收，連接T載體后進行測序；將得到的序列與BLAST比對，發(fā)現(xiàn)與魏氏梭菌標準株ATCC13124的同源性為97.9%，表明該分離菌為魏氏梭菌。

使用魏氏梭菌的5種主要毒素基因進行PCR擴增，僅有CPA得到一條大于250 bp的條帶（目的條帶為430 bp）；將該PCR產(chǎn)物測序，序列結果與GenBank中發(fā)表的α毒素基因比對，發(fā)現(xiàn)同源性為99%，證實該毒素為魏氏梭菌α毒素。因此，該分離菌為A型魏氏梭菌。具體鑒定結果見圖3。

圖3 16s通用引物及主要毒素基因PCR擴增結果

2.4 藥敏試驗

分離菌對對頭孢噻呋、恩諾沙星、青霉素表現(xiàn)為極敏，對林可霉素表現(xiàn)為高敏，對氟苯尼考、慶大霉素表現(xiàn)為中敏，對新霉素和多西環(huán)素完全耐藥（表3）。

表3 藥敏試驗結果

2.5 動物試驗

2.5.1 腸內(nèi)容物毒素試驗 尾靜脈注射濾液的2只小鼠1 d內(nèi)全部死亡，陰性對照組小鼠存活且無異常，證明腸內(nèi)容物中有毒素存在。

2.5.2 分離菌毒力試驗 腹腔注射分離菌的6只小鼠1 d內(nèi)全部死亡，陰性對照組小鼠全部存活。經(jīng)病理剖檢可見，腹腔注射分離菌組小鼠肺臟充血、出血；腸道鼓氣，腸腔內(nèi)充滿血紅色漿液；肝臟有出血。接種環(huán)無菌穿刺病死小鼠肝臟，血瓊脂平板接種，37 ℃厭氧培養(yǎng)1 d，挑取單菌落于硫乙醇培養(yǎng)液中増菌培養(yǎng)，經(jīng)革蘭氏染色及鑒定，得到與分離株相同的菌株。上述結果表明，分離株對小鼠具有較強的致病性。

3 討論

魏氏梭菌為條件性致病菌，當機體處于嚴重應激狀態(tài)或其他原因造成免疫力下降時，會大量增殖并產(chǎn)生毒素引起疾病[9-10]。近年來該病在規(guī)?；馀?、奶牛場時有發(fā)生，給養(yǎng)牛業(yè)造成了重大危害。魏氏梭菌主要產(chǎn)生α、β、ε和ι 4種毒素，所致疾病通常由一種或多種毒素引起[5，11-12]。各型魏氏梭菌均可產(chǎn)生α毒素。它是魏氏梭菌最重要的致病毒素，也是A型魏氏梭菌最主要的毒力因子[13-14]。α毒素具有細胞毒性、溶血活性、致死性、皮膚壞死性、血小板聚集和增加血管滲透性等特性[15-18]。感染期間，α毒素會干擾免疫反應，導致局部壞死，從而促進魏氏梭菌生長。α毒素也會誘導宿主細胞裂解，為魏氏梭菌生長提供營養(yǎng)，尤其是許多必需氨基酸[12]。

該牛場犢牛發(fā)病于冬季，受寒冷天氣影響，其免疫力下降，導致腸道內(nèi)魏氏梭菌大量增殖，在腸道內(nèi)產(chǎn)生大量的外毒素。這些毒素黏附在腸黏膜上皮層，使腸壁黏膜受損通透性增加，進而毒素（細菌和毒素）進入血液循環(huán)，引起毒血癥（或敗血癥），從而導致犢牛器官衰竭而急性死亡。

對病死犢牛病理剖檢，可見整個腸道鼓氣，嚴重出血，腸腔內(nèi)存在未消化的凝乳塊，病理組織學觀察見胃腸黏膜上皮細胞壞死脫落，甚至形成潰瘍面，黏膜固有層充血出血；經(jīng)細菌分離培養(yǎng)，獲得1株分離菌。該分離株在血瓊脂培養(yǎng)基上形成黑色、圓形菌落，形態(tài)特征及培養(yǎng)特性均與以往報道的魏氏梭菌相符；分離株的生化鑒定結果也與魏氏梭菌的生化特性一致；對16S及毒素基因使用PCR進行檢測，結果呈陽性；綜合以上結果初步確定犢牛死亡是由A型魏氏梭菌感染引起。將分離得到的魏氏梭菌接種小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠在較短時間內(nèi)全部死亡，且從小鼠體內(nèi)分離到相同病原，進一步確定該牛場發(fā)病為魏氏梭菌感染所致。

魏氏梭菌引起的疾病大多迅速致命，往往來不及使用藥物治療，因此預防則顯得尤為重要。加強飼養(yǎng)管理及免疫接種，在一定程度上可有效預防魏氏梭菌病的發(fā)生。魏氏梭菌致病主要由產(chǎn)生的外毒素所致，但各型菌產(chǎn)生的毒素均不相同，因此只能使用多價苗進行接種。目前，常見的疫苗為針對B、C、D型魏氏梭菌預防的多聯(lián)苗（如羊快疫-猝狙-羔羊痢疾-腸毒血癥三聯(lián)四防滅活疫苗），而對于A型魏氏梭菌的預防效果尚未見文獻報道。因此，現(xiàn)在亟需研制針對A型魏氏梭菌的新型疫苗。此次疫情發(fā)病均為犢牛，在初步診斷的基礎上，建議該場及時對未斷奶犢牛接種魏氏梭菌鋁膠疫苗。對于發(fā)病較為緩慢或同舍未發(fā)病的牛，口服青霉素預防，病牛注射頭孢噻呋鈉。另外，注意犢牛舍防風、防寒，加強飼養(yǎng)管理，消除各種應激誘發(fā)因素，同時加強牛舍的衛(wèi)生消毒。通過以上措施，該場疫情得到迅速控制，降低了經(jīng)濟損失。本研究分離鑒定的A型魏氏梭菌為該血清型疫苗與診斷試劑的研發(fā)奠定了物質(zhì)基礎。