農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜蔓枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

任海英，方麗，李崗，茹水江，王漢榮

1 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護與微生物研究所，杭州 310021

2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準研究所，杭州 310021

生物技術(shù)與方法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜蔓枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

任海英1，方麗1，李崗2，茹水江1，王漢榮1

1 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護與微生物研究所，杭州 310021

2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準研究所，杭州 310021

甜瓜蔓枯病是當(dāng)前危害瓜類的主要病害，嚴重影響甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，但是蔓枯病菌Didymella bryoniae病原學(xué)研究還非常落后，關(guān)于該菌功能基因的研究還未見報道。本研究以攜帶潮霉素 B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph) 的pBIG2RHPH2作為轉(zhuǎn)化載體，根癌農(nóng)桿菌C58C1作為轉(zhuǎn)化介體，轉(zhuǎn)化甜瓜蔓枯病菌的強致病菌株DB11。研究發(fā)現(xiàn)，甜瓜蔓枯病菌的最優(yōu)轉(zhuǎn)化體系為：甜瓜蔓枯病菌的分生孢子懸浮液濃度為1×106個孢子/mL，農(nóng)桿菌懸浮液OD600為0.15，共培養(yǎng)時間48 h，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加200 μg/mL乙酰丁香酮，選擇培養(yǎng)基添加100 μg/mL潮霉素B、200 μg/mL頭孢噻肟鈉、200 μg/mL氨芐青霉素和200 μg/mL四環(huán)素。1×105個蔓枯病菌分生孢子可以產(chǎn)生45個左右的轉(zhuǎn)化子，隨機挑取3個轉(zhuǎn)化子進行PCR和RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在不含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基平板上轉(zhuǎn)化子連續(xù)培養(yǎng)5代后，hph基因仍能穩(wěn)定存在和轉(zhuǎn)錄，Southern blotting檢測發(fā)現(xiàn)，T-DNA都是單拷貝插入3個轉(zhuǎn)化子的染色體內(nèi)。本研究建立的甜瓜蔓枯病菌的轉(zhuǎn)化體系將為該病菌的功能基因研究和寄主與病原菌的互作研究提供重要技術(shù)支撐。

甜瓜蔓枯病菌，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，T-DNA插入突變

Abstract:Gummy stem blight, a plant disease caused byDidymella bryoniae,is one of the major diseases in melon. The disease can seriously reduce melon yield and quality. However, little information is available on the genetics and functional genomics of the fungal pathogen. In this study, we developed anAgrobacterium-mediated transformation system forD. bryoniaeby using a universal pathogenic isolate DB11 and theAgrobacterium tumefaciensstrain C58C1 carriing plasmid pBIG2RHPH2 harboring the hygromycin B phosphotransferase gene (hph). Total 45 transformants could be obtained per 1×105spores when 1×106spores per milliliter ofD. bryoniaespore suspension were cocultivated withAgrobacteriumcells atOD600=0.15 for 48 h in the presence of induction medium (pH 5.2) containing acetosyringone at 200 μg/mL and selection medium contained 100 μg/mL of hygromycin B and 200 μg/mL of cefotaxime sodium, ampicillin and tetracycline, respectively. The transformants were stable when grown on PDA medium without hygromycin B for five times and were verified by PCR amplification with thehphprimers and by Southern blot analysis with thehphprobe. The transformation system will be useful for further studies of functional genes inD. bryoniae.

Keywords:Didymella bryoniae,Agrobacteriummediated transformation, T-DNA insertional mutagenesis

甜瓜是我國重要的經(jīng)濟作物，瓜類蔓枯病是當(dāng)前瓜類生產(chǎn)的主要病害，嚴重影響甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，在甜瓜的幼苗期至采收期均可發(fā)生，侵染植株的地上各部，生育前期易發(fā)病，生殖生長盛期最嚴重[1]。無論是在冬春日光溫室，還是早春和秋后大棚栽培均有發(fā)生，其危害程度遠高于甜瓜枯萎病和甜瓜疫病，在生產(chǎn)上若不及早防治，植株死亡率可達 30%～40%，造成嚴重減產(chǎn)，是一種嚴重的全球性真菌病害，侵染黃瓜、西瓜、甜瓜、南瓜和西葫蘆等[2]，對寄主植物造成不同程度的損害。瓜類蔓枯病菌的有性世代是子囊菌瓜黑腐小球殼菌Mycosphaerella melonis(Passerini) Chiu et Walker，無性態(tài)Ascochyta cucumisFautr. et Roum屬半知菌瓜葉單隔胞菌[3]。由于該菌器孢子變異大，學(xué)名迄今仍未統(tǒng)一，有記載的有Didymella bryoniae、Ascochyta cucumis、A. citrullina、A. melonis、A. cucumeris、Phyllosticta citrullina、P. orbicularia、Sphaerella citrullina、S. melonis、Didymella melonis、Didymospaeria melonis等[3]。但是最近幾年的文獻以使用D. bryoniae[1,4-5]學(xué)名的較多。病菌以子囊殼、分生孢子器、菌絲體潛伏在病殘組織上留在土壤中越冬，翌年產(chǎn)生孢子進行初侵染。植物染病后釋放出的分生孢子借風(fēng)雨傳播，進行再侵染。7月中旬氣溫20℃～25℃，潛育期3～5 d，病斑出現(xiàn)4～5 d后，病部即產(chǎn)生小黑粒點。分生孢子在株間傳播距離為6～8 m[3]。甜瓜品種間抗病性差異明顯：一般薄皮脆瓜屬抗病體系，而厚皮甜瓜較感病[3]。蔓枯病菌病原學(xué)研究還比較落后。國內(nèi)外對該病的研究主要集中在菌體培養(yǎng)、產(chǎn)孢、抗性品種篩選、防治藥劑篩選以及基于分子標(biāo)記的分類等[1-8]，關(guān)于該菌的功能基因以及與寄主的互作研究未見報道。建立一種簡單、快速、高效的甜瓜蔓枯病菌轉(zhuǎn)化體系是研究該菌功能基因以及甜瓜-蔓枯病菌互作的必需工具。

傳統(tǒng)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法是采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，這種方法費時費力，效率低下。而根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化最初主要在植物上使用，例如水稻[9]、大豆[10]、高粱[11]等都成功得到農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化株系，后來這種方法在真菌上進行嘗試，效果也比較好[12-13]，一般106個孢子能產(chǎn)生300～500個轉(zhuǎn)化子[14]，105個孢子能產(chǎn)生53個轉(zhuǎn)化子[15]、104個孢子能產(chǎn)生156個轉(zhuǎn)化子[16]。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子在沒有選擇壓力的情況下連續(xù)培養(yǎng)5代，89%～98%轉(zhuǎn)化子有絲分裂穩(wěn)定[15,17-18]。T-DNA單拷貝插入的幾率比較高，而且T-DNA插入位置的旁側(cè)序列很容易通過TAIL-PCR擴增得到[14,19-20]，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的真菌轉(zhuǎn)化子很容易發(fā)生表型以及致病性的突變，而且表型與T-DNA共分離的幾率比較高，這為研究真菌的功能基因提供了可能，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物病原真菌的轉(zhuǎn)化方法現(xiàn)在成為植物病理學(xué)研究的重要技術(shù)手段。

甜瓜蔓枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立是在分子水平上研究病原菌致病機制的前提，同時有效地轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以用來導(dǎo)入有益的外源基因，獲得帶有目的性狀的工程菌，而后者可能直接用于生產(chǎn)實踐，為病害防治提供一種新的辦法。但是，遺傳轉(zhuǎn)化的效率極大地影響著真菌功能基因組學(xué)研究的開展和深入。本研究以一種農(nóng)桿菌C58C1及攜帶潮霉素抗性的質(zhì)粒 pBIG2RHPH2為介導(dǎo)，以強致病力菌株D.bryoniaeDB11為出發(fā)菌株，產(chǎn)生甜瓜蔓枯病菌的T-DNA插入轉(zhuǎn)化子，旨在建立一種簡單、快速、高效的甜瓜蔓枯病菌的轉(zhuǎn)化體系，為甜瓜蔓枯病菌功能基因組的研究打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

甜瓜蔓枯病菌D. bryoniaeDB11，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物病害研究室保存。

根癌農(nóng)桿菌A. tumefaceins菌株 C58C1::pBIG2RHPH2由日本京都府立大學(xué)Kubo教授惠贈，在YEB培養(yǎng)基 (含25 μg/mL新霉素) 上生長48 h備用。

1.2 培養(yǎng)基

YEB培養(yǎng)基：牛肉浸膏 5 g/L，酵母膏 1 g/L，蛋白胨 5 g/L，蔗糖 5 g/L，MgSO4·7H2O 4 g/L，瓊脂15 g/L，pH 7.4，121℃滅菌15 min備用。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 (PDA)：去皮馬鈴薯200 g，加1 L水煮沸20 min，過濾，棄薯塊取濾液，加入葡萄糖20 g，瓊脂15 g，定容至1 L，121℃滅菌15 min備用。

MM培養(yǎng)基：葡萄糖 5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.5 mg/L，CaCl210 mg/L，KCl 0.15 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，NH4Cl 1 g/L，NaH2PO41 g/L，K2HPO43 g/L。

IM培養(yǎng)基：10 mL MM，50%甘油 0.1 mL，1 mol/L脂肪酸甲酯磺酸鹽 (MES) (not pH’d)0.4 mL，篩選濃度的乙酰丁香酮，20%葡萄糖0.1 mL。

1.3 甜瓜蔓枯病菌分生孢子懸浮液的制備

甜瓜蔓枯病菌分生孢子的產(chǎn)生根據(jù)本實驗室以前發(fā)表的方法[21]。使用0.01%的吐溫收集5～7個真菌平板的分生孢子。滅菌的miracoth過濾真菌孢子至50 mL的離心管內(nèi)。5 000 r/min離心10 min，棄上清。10 mL 滅菌的ddH2O重新懸浮孢子，然后5 000 r/min離心10 min，棄上清，1 mL ddH2O懸浮分生孢子，血細胞計數(shù)器觀察孢子濃度。用 ddH2O調(diào)整孢子濃度至1×106個孢子/mL。

1.4 抗生素對供試蔓枯病菌和農(nóng)桿菌的影響測定

1.4.1平板法測定不同濃度潮霉素B對甜瓜蔓枯病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑制

配制含潮霉素 B濃度梯度 (0、25、50、100、150、200和250 μg/mL) 的PDA培養(yǎng)基平板，將上述1.3中制備的孢子懸浮液稀釋1 000倍，取10 μL蔓枯病菌孢子懸浮液的稀釋液均勻涂布平板，每培養(yǎng)皿平均50個分生孢子，28℃培養(yǎng)4 d觀察菌落生長情況。打孔器取同等菌齡和直徑的菌碟放置到平板中心，28℃培養(yǎng)7 d觀察菌落生長情況。每個處理重復(fù)3次。

1.4.2頭孢噻肟鈉、氨芐青霉素和四環(huán)素在IM培養(yǎng)基上對農(nóng)桿菌生長的抑制

配制含200 μg/mL氨芐青霉素+200 μg/mL頭孢噻肟鈉+200 μg/mL四環(huán)素的共培養(yǎng)培養(yǎng)基 (IM) 平板，取10 μL C58C1::pBIG2RHPH2菌液均勻涂布到固體平板上，待培養(yǎng)基吸收菌液后，28℃倒置培養(yǎng)4 d觀察菌落生長情況，沒有任何抗生素的共培養(yǎng)培養(yǎng)基 (IM+AS+瓊脂15 g/L) 的平板培養(yǎng)農(nóng)桿菌作對照。每個處理重復(fù)3次。

1.5 轉(zhuǎn)化與篩選

1.5.1轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌菌液的準備

A. tumefaceins菌株 C58C1::pBIG2RHPH2和C58C1在YEB培養(yǎng)基平板 (含25 μg/mL新霉素或者 0 μg/mL新霉素) 上涂布活化，30℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆接種于10 mL MM液體培養(yǎng)基 (含25 μg/mL 新霉素或者 0 μg/mL 新霉素)，28℃、200 r/min培養(yǎng)1～2 d，得到培養(yǎng)液，然后用IM 液體培養(yǎng)基 (添加設(shè)計濃度的AS，見表1) 稀釋10倍，200 r/min培養(yǎng)4～6 h，測定OD600，并調(diào)整OD600至設(shè)計濃度 (表1)。

表1 不同條件下甜瓜蔓枯病菌的轉(zhuǎn)化效率Table 1 Ratio of transformant ofD. bryoniaeconidia in the different conditions

1.5.2共培養(yǎng)和篩選

上述1.3中制備好的6管孢子懸浮液 (100 μL/管)，其中5管加入100 μL C58C1:: pBIG2RHPH2菌液，第6管加入100 μL C58C1菌液。先在共培養(yǎng)培養(yǎng)基(IM+AS+瓊脂 15 g/L) 上平鋪硝酸纖維素濾膜 (孔徑 0.45 μm、直徑 45 mm) (Whatman，Hillsboro，OR公司產(chǎn)品)，將6個離心管內(nèi)的混合液分別均勻涂布于濾膜上，封口膜封好，22℃～25℃培養(yǎng)至設(shè)計時間 (表1)，濾膜含菌面朝上轉(zhuǎn)移至MM培養(yǎng)基 (含100 μg/mL潮霉素+200 μg/mL頭孢噻肟鈉+200 μg/mL 氨芐青霉素+瓊脂15 g/L) 平板上，25℃繼續(xù)培養(yǎng)2 d，挑取單個轉(zhuǎn)化子接種到新的PDA平板(含100 μg/mL潮霉素B)上，25℃暗培養(yǎng)4 d，接著紫外燈照射7 d (12 h黑暗+12 h紫外照射) 直至分生孢子產(chǎn)生，新生的分生孢子用無菌水懸浮后，涂布接種到PDA平板 (含100 μg/mL潮霉素B) 上，25℃培養(yǎng)48 h，挑取萌發(fā)的單孢子菌落接種到PDA平板(含100 μg/mL潮霉素) 上，25℃繼續(xù)培養(yǎng)7 d，保存菌種，備用。

1.5.3影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效果的因素

分別進行農(nóng)桿菌濃度OD600(0.12、0.15、0.18)、共培養(yǎng)的篩選時間 (24 h、48 h、36 h)、AS濃度(100、200、300 μg/mL) 不同組合方式下對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效果的影響試驗，統(tǒng)計每100 μL甜瓜蔓枯病菌分生孢子懸浮液轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)目。每處理重復(fù)6次，取平均值。采用SAS (9.1) 的Duncan法三因素完全隨機實驗進行多重比較，P＜0.05水平上分析各處理間轉(zhuǎn)化效率的顯著性差異。

1.6 轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定

為測定hph基因在轉(zhuǎn)化子基因組中的遺傳穩(wěn)定性，隨機選取 3個蔓枯病菌轉(zhuǎn)化子接種到不含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代，然后接種于PDA液體培養(yǎng)基 (含100 μg/mL潮霉素B) 中，25℃振蕩培養(yǎng)4 d，備用。

分別提取甜瓜蔓枯病菌基因組DNA和RNA，制備cDNA，以DNA或者cDNA為模板，引物Up primer：5′-GCATGAAAAAGCCTGAACTCACCGC-3′，Down primer：5′-CGCTATTTCTTTGCCCTCGGACG AG-3′，進行hph基因的PCR和RT-PCR擴增，檢測hph的整合和轉(zhuǎn)錄。PCR程序如下：95 ℃ 5 min ；95℃60s，60℃60s，72℃60s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min 。

將轉(zhuǎn)基因株系的基因組DNA進行EcoR I單酶切后，進行瓊脂糖電泳分析。以地高辛探針標(biāo)記和檢測試劑盒 (Roche公司產(chǎn)品) 標(biāo)記hph的PCR產(chǎn)物為探針，Southern blotting檢測T-DNA的插入拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素對供試蔓枯病菌和農(nóng)桿菌的影響測定

2.1.1平板法測定不同潮霉素B濃度對甜瓜蔓枯病菌分生孢子萌發(fā)和菌絲生長的影響

0～25 μg/mL潮霉素B對甜瓜蔓枯病菌的分生孢子萌發(fā)基本沒有抑制作用，50 μg/mL潮霉素B對孢子的萌發(fā)抑制作用較強，但是少數(shù)孢子仍能萌發(fā)，100 μg/mL潮霉素B條件下分生孢子完全不能萌發(fā)(圖1A)。與分生孢子相比，菌絲對潮霉素B更加敏感，25 μg/mL潮霉素B強烈抑制菌絲的生長。所以本轉(zhuǎn)化實驗就選擇100 μg/mL潮霉素B篩選陽性轉(zhuǎn)化子 (圖 1B)。

圖1 甜瓜蔓枯病菌在含有不同濃度潮霉素B的PDA平板上的分生孢子萌發(fā) (A) 和菌絲生長 (B) 情況Fig.1 Conidia germination (A) and hyphae growth (B) ofDidymella bryoniaeon PDA media with different concentrations of hygromycin B (0, 25, 50, 100, 150, 200, 250 μg/mL).

2.1.2頭孢噻肟鈉、氨芐青霉素和四環(huán)素在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上對農(nóng)桿菌的抑制作用

C58C1::pBIG2RHPH2在不含任何抗生素以及含 200 μg/mL氨芐青霉素+200 μg/mL頭孢噻肟鈉+200 μg/mL四環(huán)素的共培養(yǎng)培養(yǎng)基 (同IM+AS+瓊脂 15 g/L) 上都不能生長。為了抑制農(nóng)桿菌以及其他雜菌的生長，共培養(yǎng)蔓枯病菌分生孢子和C58C1::pBIG2RHPH2時，培養(yǎng)基內(nèi)添加200 μg/mL氨芐青霉素+200 μg/mL頭孢噻肟鈉+200 μg/mL四環(huán)素。

2.2 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化組合

對農(nóng)桿菌懸浮液濃度、共培養(yǎng)時間和 AS濃度進行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)農(nóng)桿菌懸浮液的OD600為 0.15、共培養(yǎng)時間 48 h (或 36 h)、AS濃度為200 μmol/L (或 300 μmol/L) 時甜瓜蔓枯病菌分生孢子的轉(zhuǎn)化效率最高，1×105個孢子中能產(chǎn)生45～52個轉(zhuǎn)化子，4個處理之間沒有顯著性差異 (表1)。從3個因素的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌的菌量對分生孢子的轉(zhuǎn)化效率影響最大，菌量太低 (OD600為 0.12)，轉(zhuǎn)化效率也較低，但是農(nóng)桿菌達到一定菌量后(OD600為 0.15)，濃度再增大 (OD600為 0.18)，轉(zhuǎn)化效率反而總體有下降趨勢，這說明菌量太大對分生孢子的轉(zhuǎn)化是不利的。在農(nóng)桿菌OD600為0.15時，隨著共培養(yǎng)時間的延長，轉(zhuǎn)化效率有所提高，同樣的共培養(yǎng)時間，AS的濃度升高，轉(zhuǎn)化效率也有所增大，但是共培養(yǎng)的時間48 h和36 h以及AS的濃度是200 μmol/L或300 μmol/L時轉(zhuǎn)化的效率沒有顯著性差異。這與前人的研究結(jié)果是相似的[12-16]。為了節(jié)省工作時間和節(jié)省AS，我們選擇當(dāng)甜瓜蔓枯病菌分生孢子懸浮液濃度1×106個孢子/mL時，確定甜瓜蔓枯病菌的最優(yōu)轉(zhuǎn)化體系為：農(nóng)桿菌懸浮液OD600為0.15、共培養(yǎng)時間為48 h、誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加200 μmol/L AS。

2.3 轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性的檢測

2.3.1hph基因在甜瓜蔓枯病菌的轉(zhuǎn)化子內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制和轉(zhuǎn)錄

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個轉(zhuǎn)化子的hph基因都有擴增條帶，這表明T-DNA已經(jīng)插入到甜瓜蔓枯病菌的染色體上，表現(xiàn)出hph基因在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平上的遺傳穩(wěn)定性 (圖 2)，與前人的報道是吻合的[15,17-18]。這將為農(nóng)桿菌成為甜瓜蔓枯病菌功能基因研究的重要工具提供了可能。

圖2 PCR和RT-PCR驗證連續(xù)繼代5次的甜瓜蔓枯病菌轉(zhuǎn)化子的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (hph) 的穩(wěn)定性Fig.2 Verificaton by PCR and RT-PCR for hygromycin B phosphotransferase gene (hph) in three transformant ofD.bryoniaeafter 5 times of subculture. M: DNA marker; 1, 3, 5:PCR products of the transformants; 2, 4, 6: RT-PCR products of the transformants; 7, 8: the PCR and RT-PCR products of the wild type, respectively.

2.3.2T-DNA單拷貝插入轉(zhuǎn)化子的幾率較高

Southern blotting研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個轉(zhuǎn)化子都只有一條雜交條帶，說明T-DNA都以單拷貝形式插入蔓枯病菌轉(zhuǎn)化子的染色體 (圖 3)，這與前人的研究結(jié)果相似[14,19-20]。這說明農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化甜瓜蔓枯病菌分生孢子建立該病菌的突變體庫以及進行該病菌的功能基因研究是可行的。

圖3 Southern blotting驗證連續(xù)繼代5次的甜瓜蔓枯病菌轉(zhuǎn)化子的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (hph) 的穩(wěn)定性Fig.3 Verificaton by Southern blotting for hygromycin B phosphotransferase gene (hph) in three transformant ofD.bryoniaeafter 5 times of subculture. WT: wild type ofD.bryoniae; 1, 2, 3: the transformants.

3 討論

與其他轉(zhuǎn)化方法相比，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化真菌具有 4個優(yōu)點：1) 農(nóng)桿菌可以轉(zhuǎn)化完整的細胞，如分生孢子、菌絲、子實體等，這就免去了制備原生質(zhì)體的麻煩；2) 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化效率高，研究表明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的每 107個絲狀真菌細胞一般能產(chǎn)生 300～7 200個轉(zhuǎn)化子，比其他真菌轉(zhuǎn)化方法高100～1 000倍；3) 產(chǎn)生的突變體大部分為單拷貝插入突變體，因此標(biāo)簽基因的分離相對容易；4) 該方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定，農(nóng)桿菌可以轉(zhuǎn)化各種形式的受體，因此當(dāng)采用具有單核的分生孢子為轉(zhuǎn)化受體時可以得到后代不分離的轉(zhuǎn)化子，避免了真菌菌絲多核所造成的轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定的難題[22]。參考其他真菌的轉(zhuǎn)化方法[14-16]，本研究對甜瓜蔓枯病菌的轉(zhuǎn)化條件進行了探索，篩選出最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件，1×105個分生孢子能得到45個左右的轉(zhuǎn)化子，這與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化其他真菌的效率[14-16]相比轉(zhuǎn)化效率較高，這將為甜瓜蔓枯病菌的遺傳學(xué)以及功能基因的研究提供良好的基礎(chǔ)。利用該轉(zhuǎn)化體系我們可以從以下幾個方面對甜瓜蔓枯病菌進行研究：第一，建立甜瓜蔓枯病菌的T-DNA插入突變體庫。篩選突變體庫，從突變體菌株的形態(tài)、生物學(xué)特性以及致病性等方面篩選目標(biāo)突變體，克隆甜瓜蔓枯病菌的功能基因。第二，構(gòu)建攜帶異源序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化甜瓜蔓枯病菌，產(chǎn)生插入失活的突變體，高效快速克隆功能確定的蔓枯病菌的基因。第三，甜瓜蔓枯病菌的基因功能驗證。將目標(biāo)基因的部分序列克隆至T-DNA左右邊界內(nèi)側(cè)，然后進行轉(zhuǎn)化就可以實現(xiàn)目標(biāo)基因以同源重組的方式敲除，可根據(jù)表型確定該基因的功能。第四，改造甜瓜蔓枯病菌，利用攜帶有某一特定基因的外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體菌株，使其成為植物的“疫苗”，在葫蘆科植物蔓枯病的防治中發(fā)揮重要的作用。

致謝：在此特別感謝Shaobin Zhong博士 (Department of Plant Pathology，North Dakota State University，USA) 給予實驗方法的指導(dǎo)和對英文的潤飾。

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Transformation ofDidymella bryoniaemediated byAgrobacterium tumefaciens

Haiying Ren1, Li Fang1, Gang Li2, Shuijiang Ru1, and Hanrong Wang1

1Institute of Plant Protection and Microbe,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou310021,China
2Institute of Quality Standards for Agricultural Products,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou310021,China

Received:January 7, 2010;Accepted:April 9, 2010

Supported by:Doctor Startup and International Cooperation Foundation of Zhejiang Academy of Agricultural Sciences.

Corresponding author:Hanrong Wang. Tel: +86-571-86404224; Fax: +86-571-86404225; E-mail: wanghrg@yahoo.com.cn

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士啟動經(jīng)費和國際合作項目資助。