快速檢測蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留方法的優(yōu)化

胡明燕 車明秀 張艷 王駿

摘要：乙酰膽堿酯酶抑制-分光光度法是目前監(jiān)管中應(yīng)用最為廣泛的快速篩查蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測方法。對該方法進(jìn)行了多項條件的優(yōu)化，結(jié)果表明，酶活性ΔA0控制在0.2～0.3時，抑制率能真實反映樣品陽性結(jié)果;孵育溫度是影響結(jié)果精密度的重要因素，部分儀器自帶恒溫裝置的溫控穩(wěn)定性較差，比色槽溫度變化較大，導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果的平行性和重現(xiàn)性較差，試樣在恒溫水浴鍋中的反應(yīng)結(jié)果重現(xiàn)性很好;配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時，應(yīng)將丙酮含量控制在≤1%時，丙酮對試驗的影響可以忽略。

關(guān)鍵詞：有機(jī)磷;氨基甲酸酯;農(nóng)藥殘留快速檢測;乙酰膽堿酯酶抑制-分光光度法

中圖書分類號：O656.31? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）21-0112-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.028? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

The Optimization of Acetylcholinesterase-Spectrophotometry for Determination of Organophosphate and Carbamate Pesticide Residues in Vegetables

HU Ming-yan1，CHE Ming-xiu1，ZHANG Yan2，WANG Jun1

（1.Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250103，China;

2.Licheng Direct Food and Drug Administration of Jinan City，Jinan 250100，China）

Abstract： Acetylcholinesterase-spectrophotometry is the most widely used method for rapid detection of organophosphorus and carbamate pesticide residues in vegetables. However，in practical application，the method is seriously limited by numerous peripheral influencing factors and low accuracy. The optimization of Acetylcholinesterase-Spectrophotometry for determination of organophosphate and carbamate pesticide residues in vegetables were studied in this paper.Controlling the ΔA value between 0.2～0.3 and its results were given，which could improve the accuracy of positive test results. Extra thermostatic bath was chosen instead of device came with instrument and the results showed greatly improved reproducibility and parallelism. In order to avoid the influence of acetone on enzyme activity，the added amount of acetone should be controlled less than 1% when preparing standard solution.

Key words： organophosphate;carbamate pesticide residues;rapid detection;acetylcholinesterase

有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥作為一類高效、廣譜的殺蟲劑、除草劑等正被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，但大量使用后對人、動物和環(huán)境產(chǎn)生的危害也日益嚴(yán)重[1]。有機(jī)磷 （OPs）及氨基甲酸酯（CBs）類殺蟲劑作為昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶的專一性抑制劑被篩選出來廣泛應(yīng)用，占?xì)⑾x劑用量的70%以上[2，3]。有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對人和動物的毒性較大，絕大多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥是劇毒的，因其可與膽堿酯酶迅速結(jié)合，形成磷脂化膽堿酯酶，使膽堿酯酶失去催化水解乙酰膽堿的能力，使乙酰膽堿在體內(nèi)蓄積，導(dǎo)致神經(jīng)處于過度興奮狀態(tài)而出現(xiàn)中毒癥狀[4]，而且噴灑農(nóng)藥還會造成生態(tài)環(huán)境污染[5]。農(nóng)藥的急慢性中毒，特別是果蔬食品污染后引發(fā)的群體中毒事件屢有發(fā)生[6]。因此世界各國對有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留問題均高度重視，投入大量資金、人力和物力控制有機(jī)磷農(nóng)藥相關(guān)的安全問題。中國GB 2763-2016[7]對馬拉硫磷、毒死蜱、樂果、敵敵畏等多種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥有嚴(yán)格限量規(guī)定。

采用酶抑制法的產(chǎn)品是品種最多、應(yīng)用最為普遍的快檢技術(shù)，該類產(chǎn)品可以有效快速檢測有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥。另外速測卡法由于檢驗原理同酶抑制法一致，且其操作簡單、成本低廉，在農(nóng)貿(mào)市場、超市有很高的市場占有率。

現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)僅有GB/T 5009.199-2003[8]和NY/T 448-2001[9]。上述標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定方法為酶抑制法和速測卡法，但均為推薦標(biāo)準(zhǔn)方法，應(yīng)用具有局限性，導(dǎo)致國內(nèi)市場上農(nóng)殘快速檢測產(chǎn)品品種繁多，檢測效果差強(qiáng)人意。本研究以GB/T 5009.199-2003[8]為基礎(chǔ)，優(yōu)化檢測方法，建立酶抑制法快速檢測方法，通用性強(qiáng)且檢驗結(jié)果統(tǒng)一準(zhǔn)確，實現(xiàn)對蔬菜中有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速半定量分析，有效實現(xiàn)不同廠家快速檢測產(chǎn)品結(jié)果的比對，滿足市場監(jiān)督快速篩查需求。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

3種有機(jī)磷和2種氨基甲酸酯類農(nóng)藥參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量見表1，純度均≥98%。

丙酮（CH3COCH3）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（C14H8N2O8S2）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、碘化乙酰硫代膽堿（C7H16INOS）。

pH 8.0緩沖溶液：分別稱取11.9 g無水磷酸氫二鉀及3.2 g磷酸二氫鉀，溶解于1 000 mL水中，混勻。

顯色劑：分別取160 mg 5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）和15.6 mg碳酸氫鈉，用20 mL緩沖溶液溶解，4 ℃冰箱中保存。

底物：取125 mg碘化乙酰硫代膽堿，加15 mL蒸餾水溶解，搖勻后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。保存期不超過兩周。

乙酰膽堿酯酶4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 儀器和設(shè)備

恒溫水浴鍋、電子天平、分光光度計或相應(yīng)商品化測定儀。

1.3? 原理

在一定條件下，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)。正常情況下，酶催化神經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物（乙酰膽堿）水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，用分光光度計在412 nm處測定吸光度隨時間的變化值，計算出抑制率。

1.4? 方法

1.4.1? 試樣的提取

1）整株提取法。選取韭菜、芹菜等有代表性的樣品，擦去表面泥土，稱取試樣3 g置于表面皿中，加入10 mL緩沖液，殘缺面不得接觸緩沖液，輕輕振搖50次，靜置2 min以上，取上清液備用。

2）整體測定法。選取油菜、菠菜等有代表性的樣品，擦去表面泥土，剪成1 cm左右見方碎片，稱取3 g放入離心管中，加入10 mL緩沖溶液，振搖50次，靜置2 min以上，倒出提取液，靜置3～5 min，待用。

1.4.2? 對照液的測定? 先于反應(yīng)管中加入3 mL緩沖溶液，再加入適量酶液、0.1 mL顯色劑，搖勻后于37 ℃水浴鍋中放置15 min。加入0.1 mL底物搖勻，立即測吸光度，3 min后再測定1次，記錄反應(yīng)3 min的吸光度的變化ΔA0。

1.4.3? 樣品液的測定? 先于反應(yīng)管中加入3 mL提取液，其他操作與對照液操作相同，記錄反應(yīng)3 min的吸光度的變化ΔAt。

1.4.4? 結(jié)果判定

結(jié)果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。

式中，ΔA0為對照溶液反應(yīng)3 min吸光度的變化值;ΔAt為樣品溶液反應(yīng)3 min吸光度的變化值。

當(dāng)抑制率≥50%時，表示蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留高于檢測限，判定為陽性，陽性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗2次以上。當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時，應(yīng)采用其他分析方法進(jìn)行確證，進(jìn)一步確定農(nóng)藥品種和含量。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 乙酰膽堿酯酶ΔA0的優(yōu)化

酶抑制法的結(jié)果是樣品溶液與對照溶液ΔA0的比值，因此，ΔA0對結(jié)果的準(zhǔn)確性影響較大。對照溶液ΔA0的變化值過大或過小，有可能出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。為了考察ΔA0大小對酶抑制率的影響，本研究對比了ΔA0變化對陽性樣本的影響，結(jié)果見表2。經(jīng)過多次試驗比較發(fā)現(xiàn)，僅ΔA0控制在0.2～0.3時，抑制率能真實反映樣品陽性結(jié)果，其余均為假陰性結(jié)果。

2.2? 恒溫裝置的選擇

孵育溫度是影響結(jié)果精密度的重要因素，部分儀器自帶恒溫裝置的溫控穩(wěn)定性較差，為了考察不同恒溫裝置對反應(yīng)的影響，本研究對比了空白溶液在儀器自帶恒溫裝置和恒溫水浴鍋中的反應(yīng)效果。由表3可知，自帶恒溫裝置的吸光度相差較大，方差達(dá)到0.038，變化起伏超過平均值的16%，而使用恒溫水浴裝置的平行樣品吸光度差距不大，方差僅為0.002。研究發(fā)現(xiàn)儀器自帶恒溫裝置的溫控穩(wěn)定性較差，比色槽溫度變化較大，導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果的重現(xiàn)性較差，試樣在恒溫水浴鍋中的反應(yīng)結(jié)果重現(xiàn)性很好，因此將恒溫水浴鍋用于后續(xù)的試驗研究。

2.3? 標(biāo)準(zhǔn)測試液的選擇

對有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)每種農(nóng)藥都微溶于水，易溶于丙酮，考慮到丙酮的用量對試驗結(jié)果有一定影響。因此，本研究用丙酮溶解標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在對照溶液中添加丙酮使其含量分別為100%、10%、5%、1%、0%，測定反應(yīng)體系反應(yīng)3 min后的吸光度變化值ΔA，結(jié)果見表4。由表4可以看出，隨著體系中丙酮含量的增加，反應(yīng)體系反應(yīng)3 min后的吸光度不斷降低，表明丙酮能夠抑制酶促反應(yīng)的進(jìn)行，從而影響酶抑制率法測定蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的結(jié)果。丙酮含量≤1%時，幾乎對酶促反應(yīng)沒有影響，因此，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時，應(yīng)將丙酮的含量控制在≤1%的范圍里。

2.4? 優(yōu)化后方法的評價

采用優(yōu)化后的方法由3家不同的機(jī)構(gòu)對5種商品化的試劑盒進(jìn)行驗證，驗證結(jié)果見表5。由表5可知，品牌A和品牌B兩種試劑盒的驗證結(jié)果性能優(yōu)異，各項性能指標(biāo)完全符合國家食藥總局發(fā)布的《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》（食藥監(jiān)辦科〔2017〕43號）[10]的相關(guān)要求;其他3個品牌由于試劑盒質(zhì)量的原因，性能指標(biāo)不能達(dá)到國家規(guī)定的要求。

3? 討論

由于該方法在目前的監(jiān)管工作中應(yīng)用非常廣泛，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留快速檢測產(chǎn)品在國家總局統(tǒng)計的采購量中占30%以上，主要用于農(nóng)貿(mào)市場、超市、批發(fā)市場等流通領(lǐng)域中蔬菜和水果的快速篩查。另外由于目前市場上商品化快檢試劑盒產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，建議應(yīng)用A類和B類快檢產(chǎn)品對其性能指標(biāo)進(jìn)行考察評價，符合該方法性能指標(biāo)和評價準(zhǔn)則各項要求后方可使用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉? 萍，張進(jìn)忠.有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].環(huán)境污染與防治，2006（1）：55-57，71.

[2] 徐? 喧.蔬菜中農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（1）：178-181.

[3] 王金斌，譚芙蓉，王立剛，等.乙酰膽堿酯酶酶抑制法快速檢測農(nóng)藥殘留的研究進(jìn)展[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，25（4）：131-135.

[4] 林春綿，胡曉燕，張安平.酶抑制法快速檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的研究進(jìn)展[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009（4）：386-391.

[5] 陳道勇，楊? 略，郭? 嘉，等.有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的分析檢測及最新研究進(jìn)展[J].河南化工，2011（2）：7-12.

[6] 王小瑜.蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留快速檢測方法的研究[D].山東淄博：山東理工大學(xué)，2008.

[7] GB 2763-2016，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)? 食品中農(nóng)藥最大殘留限量[S].

[8] GB/T 5009.199-2003，蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測[S].

[9] NY/T 448-2001，蔬菜上有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘毒快速檢測方法[S].

[10] 食藥監(jiān)辦科〔2017〕43號，食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范[S].