未培養(yǎng)微生物木聚糖基因真核表達及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

熊 科 ， 崔曉亭 ， 楊玉煥 ， 李秀婷 *

（1.北京工商大學 食品質量與安全北京實驗室，北京 100048；2.北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048；3.北京工商大學 北京市食品風味化學重點實驗室，北京 100048）

木聚糖是半纖維素的主要成分，是自然界可再生的豐富的生物資源。木聚糖酶能夠降解木聚糖成木糖或木寡糖，在飼料、食品、紡織、造紙等行業(yè)有著廣泛的應用，是現(xiàn)代酶學研究的熱點之一。木聚糖酶是專一降解木聚糖的一類酶的總稱，包括內切β-1，4-木聚糖酶、外切 β-1，4-木聚糖酶、β-木糖苷酶，此外，還有一些脫支鏈酶。狹義上的木聚糖酶僅限于β-1，4-內切木聚糖酶，也是目前人們研究最多、了解最深入的木聚糖降解酶。廣義上的木聚糖酶是指能夠降解木聚糖或半纖維素的一組酶的總稱，它對自然界中存在的半纖維素類物質的降解有著重要作用。

目前，多數(shù)的木聚糖酶來源于各類原始菌株的發(fā)酵，該方法獲得的木聚糖酶多數(shù)為復合酶，但優(yōu)良的菌株來源有限，且酶的表達量低、含雜蛋白質較多，不易純化。由于自然界中99%以上的微生物不能被純培養(yǎng)利用，因此該方法得到的產(chǎn)木聚糖酶菌株僅局限于不到1%的微生物基因資源，對自然界中所占比例較大的未培養(yǎng)微生物資源無法利用。隨著基因工程技術的發(fā)展，人們采用基因技術克隆得到已知菌株的木聚糖酶基因，并將其導入一定宿主細胞中表達，具有改善木聚糖酶的性質，提高木聚糖酶活力，便于后期純化等優(yōu)點，在生產(chǎn)上具有很大應用價值，但該方法很難獲得與常規(guī)木聚糖酶性質差異較大、新穎性較好的木聚糖酶[1-4]。而利用宏基因組學的方法獲得某一環(huán)境中所有未培養(yǎng)微生物的木聚糖酶基因，可提高尋找和發(fā)現(xiàn)新的木聚糖酶基因的概率。由未培養(yǎng)微生物宏基因組學方法獲取木聚糖酶基因并轉化表達的研究已有一些報道，如利用堆肥以及利用湖羊瘤胃等未培養(yǎng)微生物進行木聚糖酶基因的克隆。從來源上比較，木聚糖酶可以廣泛來源于各種環(huán)境如海洋、陸地等。而土壤微生物是木聚糖酶的巨大來源庫，通常每克土壤中有幾億到幾百億個微生物，雖然土壤宏基因文庫構建面臨的干擾因素多、難點大，如腐殖酸的去除等，但構建土壤未培養(yǎng)微生物的宏基因組文庫能更廣泛地獲得木聚糖酶優(yōu)良基因資源。因此作者以土壤環(huán)境作為宏基因來源對酶進行發(fā)掘，相比其它環(huán)境的宏基因來源，可大大提高尋找和發(fā)現(xiàn)新木聚糖酶基因的概率，理論意義和潛在的應用價值較大。而畢赤酵母表達系統(tǒng)自開發(fā)利用以來，一直被廣泛應用于各種外源蛋白質的表達，且外源蛋白質的遺傳穩(wěn)定性高[5]，至今已有超過1 000種蛋白質在畢赤酵母中實現(xiàn)了表達[6-8]。因此，將用宏基因組學的方法獲取的未培養(yǎng)微生物木聚糖酶基因X1-19導入畢赤酵母中進行高效表達構建重組表達載體pPIC9K-X1-19及轉化畢赤酵母GS115。篩選獲得木聚糖酶活力較高的轉化子，并對產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，以期獲得與常規(guī)木聚糖酶性質差異較大的木聚糖酶。本研究為未培養(yǎng)微生物木聚糖酶基因的異源表達工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)，具有較好的工業(yè)應用前景。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

GS115畢赤酵母宿主菌：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；pPIC9K畢赤酵母表達質粒：Invitrogen；未培養(yǎng)微生物木聚糖基因X1-19：來源于土壤宏基組DNA，為作者所在實驗室獲??；Plasmid Mini Kit（100）、Gel Exraction Kit（200）：美國 OMEGA 有限公司；卡那霉素：美國AMRESCO有限公司；TaqTMDNA 聚合酶（with GC buffer）、限制性內切酶EcoR I、Not I、Bgl II、T4 DNA 連接酶、PMD18-T：日本TAKARA公司；瓊脂糖：英國OXOID公司；PCR擴增引物：北京奧科鼎盛生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

Scientz-2C基因導入儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；0.2 cm電激轉化杯：美國伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司；水平搖床：北京六一儀器廠；分光光度計：上海棱光技術有限公司；DHZ-DA全溫振蕩器：太倉培英實驗設備廠；ImageQuant 300凝膠成像儀、Multitemp III恒溫循環(huán)水浴器、EPS 601電泳儀：美國GE公司；恒溫培養(yǎng)箱：上海STIK儀器設備有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

BMMY （g/L）： 酵母提取物10， 胰蛋白胨 20，KH2PO412，K2HPO43，YNB 13.4， 生物素 0.5， 甲醇5；其中YNB、生物素、甲醇為過濾除菌，4℃保存。

BMGY （g/L）：酵母提取物10，胰蛋白胨 20，KH2PO412，K2HPO43，YNB 13.4， 生物素 0.5， 甘油10；其中YNB、生物素為過濾除菌，4℃保存。

YPD液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物10，胰蛋白胨 20，葡萄糖20；4℃保存。

MD（g/L）：YNB 13.4，生物素 0.5，葡萄糖 20，瓊脂15；4℃保存。

RDB 培養(yǎng)基（g/L）：YNB 10，葡萄糖20，生物素0.2，氨基酸0.5；1 mol/L山梨醇。

100×AA （5%各種氨基酸）： 分別溶解 500 mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-賴氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸于 100 mL水中，過濾除菌，存于 4℃，可放 1年。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，添加3 g瓊脂粉于200 mL LB即為固體培養(yǎng)基。

1 mol/L山梨醇：18.2 g D-山梨醇溶于100 mL去離子水，過濾除菌，4℃保存。

木聚糖-剛果紅篩選平板：0.5 g/dL木聚糖，1.5 g/dL瓊脂，0.05 mol/L檸檬酸緩沖液。

剛果紅染色液1 g/dL，NaCl洗脫液1 mol/L。

1.3 重組質粒pPIC9K-X1-19的構建

1.3.1 PCR擴增帶酶切位點的基因X1-19 綜合考慮pPIC9K載體的多克隆位點（MCS）上的限制酶位點和X1-19xynA序列，選擇EcoRⅠ和Not I兩個限制酶位點。設計引物，在上游引入EcoR I，下游引入Not I，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 含EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點的引物序列Table 1 Primers with restriction sites

分別用限制性內切酶EcoR I和Not I酶切載體pPIC9K和含EcoR I、Not I酶切位點的基因片段X1-19xynA，37℃反應16 h。反應結束后在1 g/dL瓊脂糖凝膠上電泳檢測，切膠回收目的片段。用T4 DNA連接酶連接帶有粘性末端的基因片段X1-19xynA 和線性化的載體 pPIC9K（摩爾比 3∶l），16 ℃連接12 h。并將連接反應體系熱擊轉化大腸桿菌DH5α，將重組的質粒pPIC9K-xynA轉入大腸桿菌DH5α，提取質粒，PCR篩選陽性克隆。

1.3.2 線性化重組質粒pPIC9K-xynA 為了提高重組質粒在畢赤酵母染色體上的整合效率，有利于酵母轉化子的表型篩選，可在重組質粒轉化畢赤酵母之前，將構建好的重組表達載體線性化處理[9]。選用限制酶Bgl II線性化重組表達載體pPIC9K-xynA，電泳檢測，切膠回收線性化重組質粒pPIC9K-xynA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 電擊轉化重組畢赤酵母 取1～5 μg線性重組質粒與100 μL畢赤酵母感受態(tài)細胞輕輕混勻，轉入預冷的無菌電擊杯（0.2 cm型）中。輕緩敲擊電擊杯，使混合物沉入電擊杯底部，冰上靜置5 min。在電擊儀（BioRad）進行重組畢赤酵母電擊轉化操作。調整電擊轉化儀配置，電壓1.5 kV，電容25 μF，電阻400 Ω，充電完成后電擊轉化畢赤酵母。迅速向電擊杯中加入1 mL冰上預冷的1 mol/L山梨醇，混勻后立即涂布于RDB平板。30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，至轉化子出現(xiàn)。將RBD平板上生長的轉化子轉接到MD培養(yǎng)基中通過組氨酸缺陷篩選陽性轉化克隆子，然后將陽性克隆子重新涂布于RDB平板上，于30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。

1.4 高產(chǎn)木聚糖酶轉化子的篩選

將RDB平板上重新培養(yǎng)的陽性轉化克隆子用無菌水洗下并稀釋至細胞密度為105/mL，涂布在不同質量濃度遺傳霉素 G418（0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、6.00 mg/mL）的 YPD 平板上進行目的基因的高拷貝克隆子逐級篩選。將G418抗性篩選得到的轉化子發(fā)酵培養(yǎng)，用DNS法測定酶活，篩選出酶活性較高的轉化子。通過實驗得知轉化子3為目的基因的高拷貝克隆子，其所表達的木聚糖酶活性較高。

1.5 重組木聚糖酶產(chǎn)酶優(yōu)化

為了提高轉化子3產(chǎn)木聚糖酶的活力，設計單因素優(yōu)化實驗，對影響畢赤酵母產(chǎn)酶的主要因素：接種量、甲醇終體積分數(shù)、初始pH、YNB質量分數(shù)和轉速條件進行考察，確定最佳的發(fā)酵產(chǎn)酶條件。

1.5.1 甲醇添加終體積分數(shù)對轉化子產(chǎn)酶的影響將轉化子3進行誘導產(chǎn)酶，當菌體濃度達到4×108個/mL時，離心除去BMGY菌體富集培養(yǎng)基，然后加入同體積的誘導產(chǎn)酶培養(yǎng)基BMMY，30℃、200 r/min培養(yǎng)，加入誘導產(chǎn)酶培養(yǎng)基BMMY后每隔24小時取樣1 mL備用，并同時補加1 mL不同體積分數(shù)的甲醇溶液，使發(fā)酵體系在9 d中甲醇添加體積分數(shù)始終分別保持為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，以確定最佳的甲醇添加終體積分數(shù)。

1.5.2 細胞初始濃度對轉化子產(chǎn)酶的影響 對轉化子3進行誘導產(chǎn)酶，甲醇終體積分數(shù)參考1.5.1得到的最佳條件。用BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌體濃度達 10×108個/mL 時，再進行梯度稀釋得到 2×108、4×108、6×108、8×108、10×108個/mL 一系列濃度的菌體，分別離心去除BMGY培養(yǎng)基，然后用相同體積的BMMY培養(yǎng)基重懸不同濃度的菌體，30℃、200 r/min誘導培養(yǎng)9 d，每天取樣1 mL測定甲醇體積分數(shù)，并補充甲醇的消耗量，確定最佳的細胞初始濃度。

1.5.3 YNB質量分數(shù)對轉化子產(chǎn)酶的影響 按方法1.5.1和1.5.2確定的最佳甲醇添加量和初始細胞濃度對轉化子3進行誘導產(chǎn)酶。YNB終質量分數(shù)分別設置為 0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2%，30℃、200 r/min誘導培養(yǎng)9 d，每天取樣1 mL測定甲醇體積分數(shù)，并補充甲醇的消耗量，確定最佳的YNB質量分數(shù)。

1.5.4 轉速對轉化子產(chǎn)酶的影響 在最佳甲醇添加量、最佳初始細胞濃度和最佳YNB質量分數(shù)下，轉速分別設置為 180、200、220、240、260 r/min，其他條件相同，30℃誘導培養(yǎng)9 d，每天取樣1 mL測定甲醇體積分數(shù)，并補充甲醇的消耗量，確定最佳的轉速條件。

1.5.5 pH值對轉化子產(chǎn)酶的影響 使用前面已確定的最佳發(fā)酵條件，用不同比例的KH2PO4和K2HPO4調節(jié)誘導培養(yǎng)基BMMY初始pH值分別為4、5、6、7、8，其他條件相同，30 ℃誘導培養(yǎng) 9 d，每天取樣1 mL測定甲醇體積分數(shù)，并補充甲醇的消耗量，確定最佳的初始誘導pH值。

2 結果與討論

2.1 PCR擴增帶酶切位點的基因xynA

按照1.3.1方法，PCR獲得大小約為1 000 bp的片段，與X1-19木聚糖酶基因理論大小1 047 bp大小相同，見圖1。

圖1 木聚糖酶基因X1-19瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 X1-19 xynA from soil-derived metagenomic library

2.2 重組質粒pPIC9K-X1-19的構建

重組質粒pPIC9K-X1-19轉入大腸桿菌DH5α后進行質粒PCR驗證，結果見圖2。克隆子1-4均為陽性克隆子。陽性克隆子擴大培養(yǎng)，按照方法1.3.2酶切驗證，結果見圖 3。 泳道 1、2、3、4分別代表了空載體pPIC9K、重組表達載體pPIC9K-X1-19雙酶切后的片段及目的基因X1-19片段。結合圖1—3，可知目的基因已成功克隆到表達載體pPIC9K，實現(xiàn)了重組質粒pPIC9K-X1-19的構建。

圖2 質粒PCR結果Fig.2 Result of plasmid PCR

圖3 重組質粒pPIC9K-X1-19驗證電泳圖Fig.3 Result of enzymatic digestion of pPIC9K-X1-19

2.3 畢赤酵母GS115高產(chǎn)菌株篩選

2.3.1 G418抗性篩選 重組表達載體pPIC9KX1-19用Bgl II線性化后含有目的基因X1-19的條帶，參考1.3.3方法電擊轉入畢赤酵母。隨后涂布于RDB平板上培養(yǎng)3 d，平板上出現(xiàn)大量His+轉化子菌落。轉化子的拷貝數(shù)與抗G418的能力有關，通過篩選抗G418能力強的酵母即可獲得高拷貝轉化子。

挑選在含3.0 mg/mL G418的平板上生長的轉化子，再依次經(jīng)含有4.0、6.0 mg/mL G418的平板進一步篩選，最終從含有6.0 mg/mL G418的YPD平板上獲得3個轉化子，經(jīng)MM、MD平板鑒定，它們均為甲醇快速利用型（Mut+）。

2.3.2 搖瓶發(fā)酵復篩 將初篩得到的3個轉化子按照1.2培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每天取樣測酶活，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵216 h時酶活最高。經(jīng)過復篩，3個轉化子誘導產(chǎn)酶216 h酶活測定，結果見圖4。其中以轉化子3產(chǎn)酶能力最高，為（27.9±0.7） U/mL。

圖4 高效產(chǎn)酶轉化子篩選結果Fig.4 Transformations of high expression of xylanase

2.4 甲醇添加終體積分數(shù)對轉化子產(chǎn)酶的影響

甲醇體積分數(shù)對工程菌細胞的生長和表達都有影響。一方面，甲醇體積分數(shù)過低會使細胞生長所需要的營養(yǎng)物質得不到滿足，進而影響生物量的積累和外源蛋白質的表達；另一方面，甲醇體積分數(shù)過高會對細胞有毒害作用，不利于菌體的生長和蛋白質的生成，并加速已生成蛋白質的降解[10]。因此，確定最佳的甲醇體積分數(shù)有利于工程菌酵母細胞產(chǎn)酶。

作者設置了5個甲醇添加終體積分數(shù)梯度，為0.5%～2.5%，在30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)并誘導產(chǎn)酶，比較轉化子3的產(chǎn)酶能力，結果見圖5。當甲醇添加體積分數(shù)為1.0%時，轉化子3的酶活達到最高，為（40.3±0.9）U/mL。隨著甲醇體積分數(shù)的提高，產(chǎn)酶能力逐漸下降。

圖5 甲醇終體積分數(shù)對轉化子3產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of methnol concentration on enzyme yield of transformation 3

2.5 接種密度對轉化子產(chǎn)酶的影響

接種密度對重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響也很大。通常較大的接種密度可以縮短生長周期，較快達到產(chǎn)酶高峰期，促使產(chǎn)物的合成提前到來，但如果接種密度過大，會造成前期生長過快，有可能會抑制發(fā)酵過程中酶的合成與分泌，同時造成菌體過早衰減，從而影響酶活力。如果接種密度過小，則生長周期延長，不利于快速產(chǎn)酶，因此確定畢赤酵母的最佳接種密度有利于木聚糖酶的高效表達。

不同接種密度對轉化子3的產(chǎn)酶影響見圖6。最佳的接種密度是8×108個/mL。之后，隨著接種密度的增加，木聚糖酶活逐漸降低，這是因為接種密度過大，菌體需要的營養(yǎng)成分不足，導致菌體過早衰減，產(chǎn)酶能力下降[11]。Jun He[12]等人的研究表明，當接種密度為3×108個/mL時，酶活最高。

圖6 接種密度對轉化子3產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of initial cell concentration on enzyme yield of transformation 3

2.6 YNB質量分數(shù)對轉化子產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基中氮源的含量及成分會影響木聚糖酶的合成和分泌。不同菌株來源的木聚糖酶基因在真核工程菌畢赤酵母中異源表達時，對氮源的需求各不相同。無氨基氮源YNB中含有多種維生素、微量元素和部分無機鹽，為畢赤酵母生長提供營養(yǎng)成分，是培養(yǎng)基中不可或缺的成分，對細胞的生長代謝影響很大。不同YNB質量分數(shù)下畢赤酵母3產(chǎn)酶情況見圖7。當YNB的質量分數(shù)為1.2%時，發(fā)酵液中的酶活達到最高，為（57.4±1.7） U/mL。

2.7 轉速對轉化子產(chǎn)酶的影響

畢赤酵母在代謝甲醇過程中會消耗大量的氧氣，如果轉速過低，會導致發(fā)酵液中的溶氧過低，則甲醛異化途徑將甲醇代謝為甲醛之后，不能有效地將甲醇消耗為二氧化碳和水，而會積累甲醇及其代謝產(chǎn)物過氧化氫和甲醛，對菌體產(chǎn)生毒害作用[13]。如果轉速過高，則細胞間的剪切力過大，會導致細胞結構受到損害裂解死亡[14]。因此，選擇合適的轉速，保證菌體的正常需氧量而又不損害細胞，可以提高工程菌表達外源基因的蛋白質量。

圖7 YNB質量分數(shù)對轉化子3產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of YNB concentration on enzyme yield of transformation 3

不同轉速下轉化子3的產(chǎn)酶情況見圖8。隨著轉速的增加，轉化子3產(chǎn)酶量顯著提高。轉速為240 r/min時的酶活最高，之后隨著轉速的進一步增加，酶活力降低，表明較高的轉速和較低的轉速均不利于轉化子3產(chǎn)酶。Jun He[24]等研究表明，當轉速為250 r/min時，曲霉來源的第十一家族木聚糖酶基因在畢赤酵母中產(chǎn)酶最高。

圖8 轉速對轉化子3產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of rotate speed on enzyme yieldof transformation 3

2.8 pH對轉化子產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基的pH也是影響菌體生長和蛋白質分泌表達的重要因素。不同微生物生長的最適pH不同，同一種微生物在不同pH條件下生長速度和體內代謝產(chǎn)物的生成速度也不同，在不同生長時期所需要的最適pH也有所差異。為了獲得最佳的產(chǎn)酶條件，選擇適合菌株產(chǎn)酶的最佳pH必不可少。畢赤酵母在弱酸性條件下可以正常生長，但在甲醇誘導階段培養(yǎng)基的pH對菌株的產(chǎn)酶過程起著重要的作用，因此，本研究中生長培養(yǎng)基的初始pH設置為6，誘導培養(yǎng)基的初始 pH 分別設為 4、5、6、7、8 五個梯度，通過甲醇誘導產(chǎn)酶，結果見圖9。當培養(yǎng)基的初始pH為5的時候，轉化子的產(chǎn)酶能力最強，為（79.0±2.2）U/mL。過低或者過高的pH都不利于菌株產(chǎn)酶。

圖9 pH值對轉化子3產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of pH on enzyme yield of transformation 3

3 結 語

通過未培養(yǎng)的木聚糖酶基因異源構建重組畢赤酵母產(chǎn)木聚糖酶X1-19，篩選得到酶活較高的轉化子3并對重組酶進行了產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，其最佳產(chǎn)酶條件為：甲醇添加終體積分數(shù)為1.0%，接種體積分數(shù)為8×108個/mL，YNB的質量分數(shù)為1.2%，轉速為240 r/min，初始pH為5時，轉化子產(chǎn)酶能最高為（79.0±2.2） U/mL。

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