茯苓菌絲蛋白雙向電泳體系的建立及質(zhì)譜鑒定

李洪波， 向小亮， 羅海燕， 胡 興*

（1．懷化學(xué)院 生命科學(xué)系，湖南 懷化 418008；2．中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣東 廣州 510530）

茯苓（Poria cocos（Schw.）Worf）為擔(dān)子菌綱多孔菌科真菌，藥用部位為菌核。茯苓為常用中藥材，亦可作食用。茯苓用作食材可以煮粥、熬湯、泡茶、加工成各種糕點(diǎn)和面條等。茯苓的藥理作用主要表現(xiàn)在利尿、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等方面，其主要活性成分為茯苓多糖和三萜系化合物[1-4]。茯苓蛋白質(zhì)約占茯苓菌絲體干質(zhì)量的1.5%，目前對(duì)茯苓菌絲體蛋白的研究報(bào)道還很少。近年來(lái)，與免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)的茯苓蛋白陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[5-8]。最近，研究者從茯苓中發(fā)現(xiàn)一種與樟芝免疫調(diào)節(jié)蛋白1（Aca1）同源性很高的蛋白質(zhì)即茯苓免疫調(diào)節(jié)蛋白-1，通過(guò)構(gòu)建茯苓菌絲體的EST庫(kù)還發(fā)現(xiàn)了另一種可能具有免疫調(diào)節(jié)蛋白WCPCP等[9-10]。茯苓真菌寄生于松樹根部，通過(guò)分解松樹根或樹干中的纖維素和半纖維素進(jìn)行自身營(yíng)養(yǎng)供給，形成菌核，因此茯苓在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分泌具有重要潛在應(yīng)用價(jià)值的酶類，如纖維素酶、半纖維素素及木質(zhì)素酶等。茯苓菌絲體中有哪些蛋白質(zhì)，具有重要功能的蛋白質(zhì)還有待發(fā)現(xiàn)和開發(fā)。蛋白質(zhì)雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）是多年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要方法，在食用菌研究中也得到較多應(yīng)用[10-13]。液體發(fā)酵培養(yǎng)可以連續(xù)大規(guī)模地生產(chǎn)茯苓菌絲體，縮短生產(chǎn)周期并能節(jié)省大量松木，減少對(duì)環(huán)境的破壞，而且液體發(fā)酵培養(yǎng)可以對(duì)培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行精確控制[14]。因此，應(yīng)用2-DE技術(shù)研究搖瓶培養(yǎng)條件下的茯苓菌絲蛋白質(zhì)組學(xué)，為進(jìn)一步深入研究茯苓菌絲中的重要功能蛋白質(zhì)和差異基因表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 “湘靖28號(hào)”茯苓種由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 IPG Strips、40%Acr/Bis（37.5∶1）溶液、Bio-Lyte：BioRad公司；尿素、CHAPS、考馬斯亮藍(lán)G-250：Sigma公司；Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒：上海生工生物工程有限公司。

茯苓菌絲體搖瓶培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母浸膏 3.5， 蛋白胨 4.5，K2HPO41，MgSO4·7H2O 0.5；pH 6.0，121℃滅菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 茯苓菌絲體培養(yǎng) 將50 mL搖瓶培養(yǎng)基裝入250 mL錐形瓶，用菌鏟挑取于平板生長(zhǎng)良好的茯苓“湘靖28”菌絲體數(shù)環(huán)，接種至搖瓶中，160 r/min、26℃振蕩培養(yǎng)4 d作為液體發(fā)酵菌種。300 mL搖瓶培養(yǎng)基裝入2 L錐形瓶，以10%接種液體發(fā)酵菌種，26℃搖瓶轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液于6 000 r/min離心15 min，收集沉積的菌絲球[14]。

1.2.2 蛋白質(zhì)的提取 用多層無(wú)菌濾紙擠去樣品菌絲球中殘存的水分，迅速加液氮研磨成粉末，加入預(yù)冷的10%三氯乙酸丙酮溶液（含0.07%β-巰基乙醇），混勻，置于-20℃過(guò)夜，然后在0～4℃下15 000 r/min離心30 min，去上清液，沉淀用預(yù)冷的80%丙酮（含0.07% β-巰基乙醇）重懸，重復(fù)沉淀、離心多次，至上清液無(wú)色后，沉淀經(jīng)真空干燥制成蛋白質(zhì)干粉，再經(jīng)尿素-硫脲蛋白提取液溶解出菌絲干粉中的蛋白質(zhì)，按生工公司改良Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒說(shuō)明書測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。取茯苓菌絲體蛋白質(zhì)200 μg用于IEF（等電聚焦）及SDSPAGE分析。

1.2.3 蛋白質(zhì)雙向電泳 GE公司Multiphor II雙向電泳系統(tǒng)。第一向等電聚焦 （Isoelectric focusing，IEF） 在 Ettan IPGphorⅡIEF等電聚焦儀（GE Healthcare）上完成。等電聚焦的樣品通過(guò)水化上樣方式加樣。IEF采用13 cm非線性膠條，聚焦程序參照pH3-11NL的IPG膠條的聚焦程序根據(jù)操作手冊(cè)《2-D Electrophoresis principle and methods》設(shè)定，SDS-PAGE凝膠濃度為10 g/dL，考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)膠條染色過(guò)夜，用ddH2O漂洗至背景清晰為止。凝膠掃描：UMAX Powerlook 2100xl光密度掃描儀。凝膠分析軟件：ImageMaster 2D Platinum。采用ImageMaster 2D Platinum對(duì)凝膠中蛋白質(zhì)點(diǎn)的數(shù)目進(jìn)行分析，符合一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的參數(shù)設(shè)置為：Smooth：2.0；Min Area：5.0；Saliency：2.0。

1.2.4 蛋白質(zhì)鑒定 質(zhì)譜分析在中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)中心，采用基質(zhì)輔助激光解吸附電離 （MALDI） 串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 （MALDI-TOF/TOF）Ultraflex III對(duì)選取的10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行分析，獲得二級(jí)肽指紋圖譜，并進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與蛋白質(zhì)鑒定。檢索的數(shù)據(jù)庫(kù)包括NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）， 根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，蛋白質(zhì)得分在73以上，檢索結(jié)果可信度高（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙向電泳結(jié)果重現(xiàn)性

三氯乙酸丙酮溶液沉淀茯苓搖瓶培養(yǎng)的菌絲體總蛋白質(zhì)，再經(jīng)尿素-硫脲蛋白提取液溶解出菌絲干粉中的蛋白質(zhì)，取蛋白質(zhì)200 μg用于IEF及SDS-PAGE分析。經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，Image Master 2D Platinum軟件并結(jié)合肉眼分析，蛋白質(zhì)組表達(dá)基本相似，其中的兩次IEF及SDS-PAGE分析結(jié)果見圖1?？梢钥闯觯迷摲椒ǐ@取2-DE蛋白質(zhì)斑點(diǎn)分辨率高，脫色后所得到的圖像背景干凈，兩次2-DE的結(jié)果高度一致，說(shuō)明利用該方法所得到的2-DE結(jié)果重現(xiàn)性較好。

利用pH3-11NL的膠條分離得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在50 000～105 000之間，其中，大部分蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量在70 000以上，而pH 8以上的堿性蛋白質(zhì)斑點(diǎn)非常少，相對(duì)分子質(zhì)量在40 000以下的蛋白質(zhì)點(diǎn)同樣很少。采用ImageMaster 2D Platinum對(duì)凝膠中蛋白質(zhì)點(diǎn)的數(shù)目進(jìn)行分析，符合一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為452個(gè)，見圖2。

圖1 茯苓菌絲體總蛋白質(zhì)雙向電泳考染結(jié)果Fig.1 2-DE map stained with coomassie R-250 of Poria cocos mycelium total protein

圖2 凝膠中蛋白質(zhì)點(diǎn)的數(shù)目進(jìn)行分析Fig.2 Protein spots analysis of the coomassie R-250 stained gel

2.2 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定

所選擇的10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)見圖3，所選蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量在100 000以下、等電點(diǎn)在3～11、與其它蛋白質(zhì)間距較大且豐度相對(duì)較高。所選擇的10個(gè)高豐度表達(dá)且相對(duì)分子質(zhì)量較低的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF MS）分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，獲得的10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)有6個(gè)蛋白質(zhì)得分值在55以上，并在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到了與之匹配的蛋白質(zhì)，其中3個(gè)蛋白質(zhì)（3、5和10）在NCBI蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)中得分較高（大于73），這3個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)的質(zhì)譜分析結(jié)果在數(shù)據(jù)庫(kù)中的鑒定結(jié)果可信度高，其中得分最高的10號(hào)蛋白質(zhì)點(diǎn)分值達(dá)212，10號(hào)蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果見圖3。表1顯示了6個(gè)蛋白質(zhì)在NCBI庫(kù)中鑒定到蛋白質(zhì)的相關(guān)信息，獲得身份鑒定的6個(gè)蛋白質(zhì)分別為：60S核糖體蛋白L40、自噬性溶酶體蛋白Apg16、泛素、細(xì)胞色素P450、熱休克蛋白STI1和真核起始因子-5a。

圖3 蛋白質(zhì)點(diǎn)的選取及質(zhì)譜分析Fig.3 Protein spots selection and MS analysis

表1 蛋白質(zhì)的鑒定Table 1 Identification results of selected proteins

3 結(jié) 語(yǔ)

蛋白質(zhì)的提取是雙向電泳的第1步，也是最為關(guān)鍵的，決定雙向電泳的成敗。如果需要研究組織中盡可能多的蛋白質(zhì)，可以選擇TCA-丙酮法，這也是目前應(yīng)用最廣的蛋白質(zhì)提取方法，本研究采用該方法獲得了較好的提取效果[11-13]。第二向凝膠濃度對(duì)蛋白質(zhì)的分離效果影響很大，這就需要確定一個(gè)較適宜的分離膠濃度。本研究采用10 g/dL的分離膠濃度效果更好，蛋白質(zhì)點(diǎn)分布更加均勻，這樣在調(diào)整好上樣量后能夠分離到更多的蛋白質(zhì)，但對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)10 g/dL的膠質(zhì)量濃度就顯得偏低。經(jīng)軟件分析共得到不到500個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，這與蛋白質(zhì)上樣量相對(duì)較少、染色和SDSPAGE膠質(zhì)量濃度等都有關(guān)系。本研究主要目的是探索提取真菌菌絲體總蛋白質(zhì)中常用的三氯乙酸丙酮溶液沉淀結(jié)合尿素-硫脲法對(duì)茯苓菌絲體總蛋白質(zhì)提取的適用性，因此蛋白質(zhì)的上樣量相對(duì)差異蛋白分析要少得多，而差異蛋白2-DE分析的上樣量至少為本研究的5倍以上。三氯乙酸丙酮溶液沉淀結(jié)合尿素-硫脲法對(duì)茯苓菌絲體總蛋白質(zhì)提取的重現(xiàn)性好，說(shuō)明該方法對(duì)于茯苓菌絲體總蛋白質(zhì)的提取同樣適用。選取的蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜鑒定后，6個(gè)經(jīng)鑒定的蛋白質(zhì)都是組成型表達(dá)基因的產(chǎn)物，由于還沒(méi)茯苓的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，且已經(jīng)報(bào)道的茯苓蛋白質(zhì)還非常少，因此數(shù)據(jù)庫(kù)檢索大部分蛋白質(zhì)得分較低，只有3種蛋白質(zhì)的得分在73分以上。另外，茯苓菌絲體總蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果說(shuō)明，樣本全蛋白質(zhì)檢索需要檢測(cè)的樣品數(shù)量大，并且大多數(shù)具有應(yīng)用價(jià)值的重要功能蛋白質(zhì)往往并非是組成型基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，通過(guò)減少檢測(cè)樣品的數(shù)量來(lái)提高發(fā)現(xiàn)茯苓菌絲體重要功能蛋白質(zhì)的效率，在后續(xù)的研究中，我們將利用不同組分的培養(yǎng)基在不同條件下對(duì)茯苓菌絲體差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，以期發(fā)現(xiàn)如纖維素酶、半纖維素素、木質(zhì)素酶等酶類和其它重要生物活性蛋白質(zhì)，為茯苓經(jīng)濟(jì)價(jià)值的深入開發(fā)奠定理論與技術(shù)基礎(chǔ)?？傊?，本研究為茯苓菌絲體蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了可靠的蛋白質(zhì)提取方法和較為合適的雙向電泳條件，為一下步差異蛋白的鑒定奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

[1]WANG W，DONG H，YAN R，et al.Comparative study of lanostane-type triterpene acids in different parts of Poria cocos（Schw.）Wolf by UHPLC-Fourier transform MS and UHPLC-triple quadruple MS[J].J Pharm Biomed Anal， 2014，102：203-214.

[2]SUN Y.Biological activities and potential health benefits of polysaccharides from Poria cocos and their derivatives[J].Int J Biol Macromol，2014，68：131-134.

[3]FENG Y L，LEI P，TIAN T，et al.Diuretic activity of some fractions of the epidermis of Poria cocos[J].J Ethnopharmacol，2013，150（3）：1114-1118.

[4]HU Bin，YANG Yiping，YE Yang.Chemical constituents from Poria cocos[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2006，37（5）：655-8.（in Chinese）

[5]RIOS J L.Chemical constituents and pharmacological properties of Poria cocos[J].Planta Med，2011，77（7）：681-691.

[6]CHEN X，ZHANG L，CHEUNG P C.Immunopotentiation and anti-tumor activity of carboxymethylated-sulfated beta-（1-＞3）-d-glucan from Poria cocos[J].Int Immunopharmacol，2010，10（4）：398-405.

[7]CHANG H H，YEH C H，SHEU F.A novel immunomodulatory protein from Poria cocos induces toll-like receptor 4-dependent activation within mouse peritoneal macrophages[J].J Agric Food Chem，2009，57（14）：6129-6139.

[8]CHANG H H，SHEU F.A Novel fungal immunomodulatory protein （PCP）isolated from Poria cocos activates mouse peritoneal macrophage involved in Toll-like receptor 4[J].FASEB J，2007，21（702）：15.

[9]WU Zongxun，SUN Zhiwen.Construction and analysis of EST library in Wolfiporia cocos[J].Bio Formosa，2007，42（1）：47-53.（in Chinese）

[10]LI Hongbo，YANG Ruixue，CHEN Jing，et al.Preparation and analysis of the antibody against Poria cocos immunomodulatory protein WCFIP1[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2014，45（20）：2912-2916.（in Chinese）

[11]HOUY，ZHENGZ，XUS，etal.ProteomicanalysisofFusariumgraminearumtreatedbythefungicideJS399-19[J].Pestic Biochem Physiol，2013，107（1）：86-92

[12]SU Y，GUO Q，TU J，et al.Proteins differentially expressed in conidia and mycelia of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae sensu stricto[J].Can J Microbiol，2013，59（7）：443-448.

[13]QIU J，SU Y，GELBIC I，et al.Proteomic analysis of proteins differentially expressed in conidia and mycelium of the entomopathogenic fungus Aschersonia placenta[J].Can J Microbiol，2012，58（12）：1327-34.

[14]LI Yi，YANG Sheng，LI Chen，et al.Compound medicinal medium of flask liquid fermentation of Poria cocos and its chemical constituents[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2012，43（8）：1519-1522.（in Chinese）