釀酒酵母靜息細胞轉化合成2-苯乙醇

黃筱萍， 黃國昌， 金丹鳳， 劉 蘭， 熊大維

（江西省科學院 微生物研究所，江西 南昌330029）

2-苯乙醇（2-Phenylethanol，2-PE）是一種具有玫瑰香味的芳香醇，亦是芳香族化合物中最重要的香料品種之一，廣泛應用于食品香精、化妝品和日化產(chǎn)品中。天然2-PE是從植物（主要是玫瑰花）中提取，由于其含量太低、成本高，無法滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[1]。利用微生物轉化L-苯丙氨酸生成2-PE是取代天然2-PE產(chǎn)品的有效途徑，酵母菌通過Ehrlich途徑轉化培養(yǎng)基中的L-苯丙氨酸 （L-Phe）為2-PE可大幅度提高2-PE的產(chǎn)量[2]。酵母在自身生長代謝過程中會產(chǎn)生大量的乙醇，乙醇和2-PE聯(lián)合作用對菌體產(chǎn)生的毒性是生物轉化法生產(chǎn)2-PE中產(chǎn)物濃度不高的主要原因，也是制約生物法生產(chǎn)天然2-PE的技術關鍵[2-4]。目前采用兩相萃取技術原位轉移2-PE可一定程度解決產(chǎn)物抑制效應[5-7]，但分離純化困難，提取精制收率低。利用樹脂吸附技術原位轉移2-PE亦可提高2-苯乙醇產(chǎn)量[8-9]。本研究所采用的酵母靜息細胞轉化合成2-PE的方法是利用已經(jīng)培養(yǎng)好的酵母細胞，重新懸浮于緩沖溶液中催化L-Phe轉化成2-PE。以菌體細胞作為酶的載體，根據(jù)酶的特性添加促進Ehrlich途徑中酶活的離子和輔酶NADH再生輔助底物，在單因子試驗基礎上，利用SAS軟件進一步優(yōu)化轉化條件，探討各因素的交互效應，得到較優(yōu)條件組合。酵母靜息細胞催化反應專一性強，底物轉化率高，生成的副產(chǎn)物少，細胞可以重復利用，無需在無菌條件下進行操作[10-11]。在靜息細胞轉化過程中添加大孔樹脂進行原位產(chǎn)物吸附可顯著提高2-PE的產(chǎn)率，并使下游提取精制易于實施。目前靜息細胞的研究在許多領域已經(jīng)展開，如天然化合物的生物合成、藥物前體化合物轉化、乳酸、乙酸的生產(chǎn)等領域[12-15]。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

菌種Saccharomyces cerevisiae SH003：由作者所在實驗室篩選獲得，現(xiàn)保存于江西省科學院微生物研究所；斜面培養(yǎng)基（麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基g/L）：葡萄糖 30，蛋白胨 5，酵母粉 3，麥芽汁 3，pH自然；細胞增殖培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 30，蛋白胨 5，酵母粉3，麥芽汁 3，pH 5.8～6.2；L-苯丙氨酸：河北冀海生物科技有限公司，純度99.5%；2-苯乙醇標準品：Sigma公司，純度98.5%；甲醇：色譜純；超純水自制，其他試劑均為國產(chǎn)分析純；SHIMADZU LC-20A高效液相色譜儀；Agilent HC-C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Sartorius practum 224-1CN 分析天平，湖南湘儀高速冷凍離心機H2500R-2。

1.2 實驗方法

1.2.1 靜息細胞制備 從斜面挑取1～2環(huán)菌苔至30 mL細胞增殖培養(yǎng)液中，于28℃、180 r/min培養(yǎng)18 h，再以2%的接種體積分數(shù)接種于細胞增殖培養(yǎng)液中，于28℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，進行細胞擴增培養(yǎng)，冷凍離心（8 000 r/min，15 min），用 0.1 mol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 6.8）洗滌細胞兩次，將菌體重懸于0.1 mol/L的磷酸鈉緩沖液中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 靜息細胞轉化方法 用0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液配制不同濃度的靜息細胞液，加入底物L-苯丙氨酸和輔助底物，于28℃、200 r/min反應24 h，10 000 r/min離心10 min，上清液采用高效液相色譜法檢測L-苯丙氨酸和2-苯乙醇質量濃度。

1.2.3 靜息細胞轉化條件優(yōu)化方法

1）單因素優(yōu)化：取不同培養(yǎng)時間的酵母菌體離心，制成靜息細胞進行轉化合成2-苯乙醇，對制備靜息細胞的菌體菌齡進行優(yōu)化，測定靜息細胞濃度和不同的緩沖液體系對合成轉化2-苯乙醇的影響。

2）靜息細胞輔酶輔助底物再生體系的構建：通過添加不同的輔助底物還原糖（如葡萄糖、蔗糖、D-甘露糖、D-木糖、阿拉伯糖等）或醇類（如甲醇、乙醇、丙醇）進行還原型輔酶NADH再生。

3）Plackett-Burman試驗設計篩選影響靜息細胞轉化的關鍵因子：采用SAS軟件中多因素二水平試驗設計，以2-苯乙醇產(chǎn)量作為響應用值Y，對影響轉化的因子如細胞濃度、底物質量濃度、糖質量濃度、pH、溫度、轉化時間進行全面考察，篩選出主要影響因子。

4）Box-Benhnken試驗設計結合響應面法分析篩選顯著因子的最優(yōu)水平：以Plackett-Burman設計結果為基礎，選擇影響轉化2-苯乙醇的顯著因子為自變量，以苯乙醇產(chǎn)量為響應值，進行三因素三水平試驗，采用SAS軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸和圖形分析，得出優(yōu)化組合條件，再進行驗證實驗，檢驗模型的可行性。

5）靜息細胞重復利用：將首次轉化結束的靜息細胞離心，洗滌，重新懸浮，加入底物和輔助底物，在相同的條件下進行轉化，驗證靜息細胞催化穩(wěn)定性。

1.2.4 大孔樹脂HZ816對2-苯乙醇和L-苯丙氨酸的靜態(tài)吸附率與解吸率測定 準確量取4 g/L L-苯丙氨酸和2 g/L 2-苯乙醇混合溶液100 mL加入具塞磨口三角瓶中，加入1 g預處理好的樹脂，于25℃、100 r/min振蕩3 h，真空抽濾，濾液測定2-苯乙醇和L-苯丙氨酸質量濃度。計算樹脂的吸附率（mg/g）。收集吸附飽和的樹脂，用濾紙吸干表面水，加入具塞磨口三角瓶中，準確量取10 mL 95%乙醇，于25℃、100 r/min振蕩4 h，計算樹脂解吸率（%）。

式中，c1為吸附前質量濃度（mg/mL），c2為吸附后質量濃度（mg/mL），V 為溶液體積（mL），m 為樹脂質量（g）。

式中，c為解吸液質量濃度 （mg/mL），V為解吸液體積（mL），m 為吸附質量（mg）。

1.2.5 轉化液中加入大孔樹脂吸附2-苯乙醇試驗準確稱取3 g樹脂加入30 mL靜息細胞轉化液中，加入底物L-苯丙氨酸和輔助底物，于26℃、200 r/min反應40 h，真空抽濾，濾液10 000 r/min離心5 min后檢測得L-苯丙氨酸和2-苯乙醇質量濃度。樹脂加入具塞磨口三角瓶中，加入30 mL 95%的乙醇，于25℃、100 r/min振蕩4 h，5 000 r/min離心5 min，上清液檢測得L-苯丙氨酸和2-苯乙醇質量濃度。

1.2.6 反相高效液相色譜法測定L-苯丙氨酸和2-苯乙醇含量[16]發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清液，稀釋，用0.22 μm聚醚水性濾膜過濾后 HPLC 分析。 流動相為 v（甲醇）∶v（水）＝50%∶50%，流速為 1.0 mL/min，檢測波長 260 nm，柱溫30 ℃，進樣量 10 μL。

2 結果與討論

2.1 菌齡對靜息細胞轉化的影響

靜息細胞的轉化依賴胞內(nèi)酶的活性，菌體在不同的生長階段相應酶表達活性相差較大，考察了細胞不同生長階段的轉化能力。轉化條件：分別取在擴增培養(yǎng)液中生長不同時間的菌體，用0.1 mol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 5.5）配制成10%的菌體濃度，加入8 g/L L-苯丙氨酸，輔助底物20 g/L葡萄糖進行轉化，結果見圖1。

圖1 菌齡對靜息細胞轉化2-苯乙醇的影響Fig.1 Effect of incubation time on 2-phenylethanol production by resting cell

隨著菌體培養(yǎng)時間的增加，2-苯乙醇產(chǎn)量也逐漸增加，當菌齡達16 h時，2-苯乙醇的增加漸緩，20 h產(chǎn)量達到最高，達2.34 g/L，隨后逐漸降低。這可能與菌體衰老自溶，胞內(nèi)酶釋放和活性降低有關，因此選用菌齡為20 h的菌體制備靜息細胞進行轉化實驗。

2.2 細胞濃度對轉化合成2-苯乙醇的影響

利用酵母細胞靜息細胞轉化合成2-苯乙醇，真正起作用的是細胞內(nèi)艾氏反應途徑的酶系，菌體量直接影響參與反應的酶量，進而影響其催化轉化的反應速率和轉化率。用pH 5.5、0.1 mol/L的磷酸鈉緩沖液配制不同的細胞濃度，加入L-苯丙氨酸8 g/L，輔助底物葡萄糖20 g/L進行轉化反應，結果見圖2。當細胞濃度為10%時，2-苯乙醇產(chǎn)量達到最高，繼續(xù)提高細胞濃度不能增加2-苯乙醇的產(chǎn)量，這可能是由于過多的菌體導致溶氧供應不足，同時影響溶液的傳質效率，不利于轉化進行，因此在轉化過程中細胞濃度控制在10%比較合適。

圖2 細胞濃度對轉化合成2-苯乙醇合成的影響Fig.2 Effect of cell concentration on 2-phenylethanol production by bioconversion

2.3 緩沖液體系對酵母靜息細胞轉化合成2-苯乙醇的影響

分別配制pH 5.5的0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液，0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液和0.1 mol/L磷酸鈉與磷酸鉀混合緩沖液，在細胞濃度為10%、L-苯丙氨酸為6 g/L、輔助底物葡萄糖為10 g/L進行轉化，考察不同配比的緩沖液對靜息細胞轉化合成2-苯乙醇的影響，結果見圖3。

圖3 不同緩沖液對轉化合成2-苯乙醇的影響Fig.3 Effect of buffer solution on 2-phenylethanol production by bioconversion

PO43+對細胞內(nèi)電子傳遞和還原性輔酶氧化起著重要調節(jié)作用，靜息細胞在K+濃度較高的緩沖液中轉化合成2-苯乙醇能力較高，轉化合成2-苯乙醇的質量濃度高10%左右，這表明K+也可能對艾氏代謝途徑的酶活具有一定的調節(jié)作用，有利于細胞的轉化合成。

2.4 靜息細胞輔酶再生輔助底物篩選

酵母菌通過艾氏途徑轉化合成2-苯乙醇發(fā)生了氧化還原反應，即苯乙醛在脫氫酶的作用下生成了2-苯乙醇，由于細胞中脫氫酶在還原苯乙醛時要不斷消耗作為電子供體的還原型輔酶NADH，活性細胞需要不斷再生NADH以保持細胞內(nèi)正常的氧化還原狀態(tài)[17-18]。靜息細胞自身沒有再生輔酶能力，在轉化液中直接添加輔酶NADH可提高脫氫酶活性，但其價格昂貴。因此添加輔助底物構建與細胞自身代謝耦合的輔酶再生系統(tǒng)是實現(xiàn)靜息細胞轉化合成2-苯乙醇和重復利用的必要手段。

實驗設計在轉化液通過添加輔助底物如還原糖和醇類進行還原型輔酶再生。在細胞濃度為10%，L-苯丙氨酸為8 g/L，輔助底物質量濃度20 g/L條件下進行轉化，表1為添加不同輔助底物對轉化合成2-苯乙醇的影響，對照為不添加輔助底物。

表1 不同輔助底物對轉化合成2-苯乙醇的影響Table 1 Effect of co-substrates on 2-phenylethanol production by resting cells

從表1可以看出，在不添加輔助底物時，基本上沒有2-苯乙醇的產(chǎn)生，這表明靜息細胞內(nèi)的NADH質量濃度極低，制約了乙醇脫氫酶的活性。不同的輔助底物對合成2-苯乙醇的影響很大，乙醇、D-甘露糖、蔗糖和葡萄糖對轉化合成2-苯乙醇有明顯的促進作用，而木糖、甲醇和丙醇沒有促進作用，其中乙醇的促進作用最為顯著，乙醇+葡萄糖、乙醇+蔗糖混合輔助底物的效果與乙醇相似，增加乙醇質量濃度至40 g/L，2-苯乙醇產(chǎn)量無明顯增長。

高質量濃度的2-苯乙醇對生長細胞有一定的毒性，可能是影響了原生質膜的通透性，擾亂跨膜質子電勢及糖類和氨基酸的運輸系統(tǒng)，乙醇和2-苯乙醇的聯(lián)合作用產(chǎn)生的毒性比它們各自產(chǎn)生的毒性累加作用要高[17-18]，而在靜息細胞中添加高質量濃度的乙醇對產(chǎn)物的合成沒有抑制作用，這也表明了靜息細胞轉化L-苯丙氨酸為2-苯乙醇主要依賴艾氏途徑的酶活性。

2.5 Plackett-Burman試驗設計篩選影響靜息細胞轉化的關鍵因子

Plackett-Burman法是一種近飽和的二水平試驗設計方法，選用實驗次數(shù)N＝12的實驗設計，對靜息細胞細胞濃度、底物質量濃度、糖質量濃度、轉化液pH、溫度、轉化時間進行全面考察，另設3個虛擬變量用于估計誤差，每個因素取高（1），低（-1）兩個水平，應用SAS（V9版）軟件分別計算各因素的效應值，響應值Y為2-苯乙醇產(chǎn)量，實驗設計見表2，各因素主效應分析結果見表3。

表2 N=12的Plackett-Burman實驗設計與水平Table 2 N=12 Plackett-Burman experimental design and response value

表3 N=12 Plackett-Burman實驗因素水平及各因素的主要效應分析Table 3 N=12 Plackett-Burman experimental factors levels and main effect of various factors

從表3可以看出，6個因素對轉化效率的影響的主要因素主次關系依次為 X4＞X9＞X1＞X7＞X5＞X2，乙醇質量濃度、pH和轉化溫度對2-苯乙醇產(chǎn)量影響顯著，細胞濃度對2-苯乙醇產(chǎn)量有一定影響，反應時間和L-苯丙氨酸濃度影響不顯著，系數(shù)R2=0.972 7，表明擬合程度良好。選擇乙醇質量濃度、pH和轉化溫度3個因素作進一步響應面分析，其他因素正效應取較高水平，負效應取較低水平，即L-苯丙氨酸為8 g/L，反應時間為24 h，菌體濃度為10%。

2.6 響應面設計與分析

根據(jù)Plackett-Burman實驗確定的實驗因素與水平，設計了三因素三水平的響應面分析實驗，共有15個實驗點，12個分析因子，3個為零點，零點實驗重復3次估計誤差，以2-苯乙醇產(chǎn)量為響應變量，實驗設計和分析結果見表4-5。

二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗表明：因素X1和X2對產(chǎn)2-苯乙醇效果的線效應極顯著，因素X3對產(chǎn)2-苯乙醇效果的線效應顯著；因素X12、X22對產(chǎn)2-苯乙醇效果的曲面效應用極顯著，因素X32對產(chǎn)2-苯乙醇效果的曲面效應用顯著；因素X1X2、X1X3和X2X3對產(chǎn)2-苯乙醇效果的交互影響不顯著。對試驗數(shù)據(jù)進行多次擬合回歸，以2-苯乙醇產(chǎn)量（Y）為因變量，乙醇質量濃度（X1）、轉化溫度（X2）、pH（X3）為自變量，建立回歸方程模型為：Y1=3.458+0.145 8X1-0.222X2-0.095X3-0.195X12-0.233X22-0.157X32。

表4 中心組合試驗方案與結果Table 4 Design and results of Box-Behnken

表5 回歸與方差分析結果Table 5 Results of regression and variance analysis

試驗各因素對2-苯乙醇產(chǎn)量影響顯著程度大小依次為：轉化溫度＞乙醇質量濃度＞pH，模型回歸F 值為 19.812 6，P=0.002 1（P＜0.01），表明該模型極顯著；多元相關系數(shù)R2=0.972 7，表明模型對試驗實際情況擬合較好，通過軟件求出回歸模型的極值點，即最佳轉化條件為轉化溫度為26.04℃，乙醇質量濃度為16.71 g/L，pH 5.11，產(chǎn)2-苯乙醇的理論最大值為3.55 g/L。為檢驗響應面法的可靠性，在最佳轉化條件下進行驗證試驗，考慮到實際操作的方便，調整最佳培養(yǎng)條件為：轉化溫度為26℃，乙醇質量濃度為17 g/L，pH 5.1，在此條件下進行3次平行試驗，2-苯乙醇平均產(chǎn)量達3.54 g/L，與理論預測值相近，說明響應用面法優(yōu)化釀酒酵母靜息細胞轉化合成2-苯乙醇的轉化條件是可行的。

2.7 靜息細胞重復利用實驗

與生長細胞相比，采用靜息細胞轉化最大的特點就是在于菌體細胞可以重復使用，在上述優(yōu)化的轉化條件下進行菌體重復利用實驗，結果見圖4。

圖4 靜息細胞作為生物催化劑的重復利用Fig.4 Repeated utilization of resting cell as biocatalyst

靜息細胞第1次平均轉化合成2-苯乙醇產(chǎn)量為3.54 g/L，以第1次轉化靜息細胞的生物活性為100%計，前3次重復利用試驗中，靜息細胞的生物活性變化很小，均保持在98%以上，細胞重復使用第4次其活性開始下降，隨后靜息細胞的生物活性保持較平穩(wěn)的狀態(tài)，重復利用第8次，其生物活性仍達91.6%，表明在優(yōu)化的轉化條件下，靜息細胞可以多次重復使用，2-苯乙醇產(chǎn)率無明顯下降。

2.8 樹脂對底物L-苯丙氨酸和產(chǎn)物2-苯乙醇的吸咐特征

從多種樹脂（數(shù)據(jù)未列出）中篩選出對產(chǎn)物吸附容量較大，對底物吸附容量低的大孔樹脂HZ816，表6為該樹脂對底物和產(chǎn)物的吸附率。

表6 HZ816樹脂對L-苯丙氨酸和2-苯乙醇的靜態(tài)吸附率Table 6 Static adsorption capability of L-Phe and 2-PE on HZ816

樹脂HZ816對2-PE的吸附率為103.5 mg/g，對底物L-Phe的吸附率僅為5.8 mg/g，對產(chǎn)物的吸附量是底物的約18倍，是一種較理想的產(chǎn)物分離樹脂。用10倍樹脂體積的95%乙醇靜態(tài)洗脫2-PE，洗脫液中 2-PE 量為（98.3±3.8） mg，2-PE 的洗脫率為95%。

2.9 大孔樹脂提高靜息細胞轉化2-苯乙醇產(chǎn)量試驗

在靜息細胞轉化液中加入10%大孔樹脂，在最適轉化條件下轉化40 h，轉化18 h補加底物L-Phe和輔酶輔助底物乙醇，實驗設計和結果見表7。

表7 大孔樹脂HZ816對靜息細胞轉化合成2-PE產(chǎn)量的影響Table 7 Effect of macroporous resin HZ816 on 2-PE bioconversion by resting cell

在轉化液中加入大孔樹脂，可大大提高2-PE產(chǎn)量，轉化液中2-苯乙醇質量濃度較低，大量的產(chǎn)物2-PE被吸附在樹脂中。在L-Phe質量濃度為8 g/L時，加入樹脂的轉化液中2-PE產(chǎn)量提高55.4%，轉化率達90%，樹脂對2-PE的吸附率為82.4 mg/g，比其在水溶液中的吸附率（103.5 mg/g）低，這可能是高濃度的菌體降低了樹脂對產(chǎn)物的吸附。提高底物質量濃度至15 g/L時，產(chǎn)量達9.34 g/L，比未加樹脂產(chǎn)量提高171.5%，繼續(xù)提高底物質量濃度，2-PE產(chǎn)量沒有提高，這可能是樹脂吸附已達飽和，需要進一步增加樹脂的添加量。

3 結 語

通過釀酒酵母靜息細胞轉化合成2-苯乙醇，確定了培養(yǎng)20 h的菌體為制備靜息細胞最適菌齡；0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液有利于2-苯乙醇的合成；乙醇作為輔酶輔助底物可有效還原乙醇脫氫酶輔酶NAD為NADH，與糖類作為輔助底物相比，乙醇作為輔助底物便于后期產(chǎn)物的分離純化。

通過Plackett-Burman設計法和響應面試驗建立了酵母靜息細胞轉化條件的二次多項式模型，得到靜息細胞最佳轉化條件為：乙醇質量濃度為16.7 g/L，轉化溫度為 26℃，pH 5.1，2-苯乙醇產(chǎn)量為3.49 g/L，比優(yōu)化前產(chǎn)量提高了49.1%。此外，靜息細胞作為生物催化劑重復利用8次，其生物催化活性仍保持91.5%。在轉化液中加入樹脂進行產(chǎn)物原位轉移，可大大提高2-苯乙醇產(chǎn)量，在底物質量濃度為15 g/L時，2-PE產(chǎn)量達9.34 g/L，底物轉化率為83.9%，比未加樹脂產(chǎn)量提高了171.5%。與生長細胞相比，靜息細胞具有轉化合成2-苯乙醇操作簡便，無需在無菌條件下進行操作，轉化液組成簡單，細胞可多次重復使用，易于產(chǎn)業(yè)化，對未來工業(yè)應用有潛在的優(yōu)勢。

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