乙醇-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)工藝對(duì)酒糟蛋白飼料的影響

王 柯 ， 張建華 ， 毛忠貴

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

生物質(zhì)乙醇作為燃料具有清潔、可再生的特點(diǎn)，是很好的化石燃料替代品，其產(chǎn)量在過去的10年間得到了大幅度提高[1]。2014年，全球的生物質(zhì)乙醇產(chǎn)量達(dá)到了7 400萬(wàn)t，其中約60%為玉米原料乙醇[2]。對(duì)于玉米乙醇，目前大部分生產(chǎn)廠采用干磨工藝（較濕磨工藝具有較低的投資成本）[3-4]。在該工藝中（圖1a），玉米經(jīng)粉碎、液化、糖化、發(fā)酵和蒸餾的過程最終獲得乙醇，剩下的蒸餾廢液（全酒糟）經(jīng)過固液分離處理得到酒糟清液和濕酒糟渣（Wet distillers’grains，WDG）。酒糟清液的一部分可直接回用于乙醇發(fā)酵過程，但回用比例一般不能超過50%，否則酒糟清液中固形物、乙酸、乳酸和鈉鹽等物質(zhì)會(huì)積累而毒害乙醇發(fā)酵酵母[5-7]。剩余部分經(jīng)蒸發(fā)獲得糖漿和冷凝水，冷凝水回用于乙醇發(fā)酵過程，而糖漿和濕酒糟渣混合干燥制成酒糟蛋白飼料（DDGS）。該工藝可實(shí)現(xiàn)廢水的零排放，但是酒糟清液蒸發(fā)和糖漿干燥會(huì)消耗大量能量，是造成乙醇生產(chǎn)過程低凈能量平衡比的主要原因之一[8]。因此，學(xué)者和乙醇生產(chǎn)商們?cè)噲D開發(fā)新的酒糟清液處理工藝以提高乙醇生產(chǎn)過程的凈能量平衡比。將酒糟清液蒸發(fā)后燃燒獲得能量是其中的一個(gè)選擇，但是該方法運(yùn)行成本非常高且會(huì)引起空氣污染，引入加強(qiáng)型熱氧化系統(tǒng)可減輕空氣污染，但需要高成本投入。酒糟清液的厭氧消化被認(rèn)為是一種更佳的處理方式，因?yàn)榫圃闱逡褐兴母邼舛扔袡C(jī)物可被轉(zhuǎn)化為綠色能源物質(zhì)——沼氣。另外，對(duì)于生物質(zhì)乙醇生產(chǎn)過程整體可持續(xù)性的嚴(yán)格控制也促使將厭氧消化工藝應(yīng)用于其生產(chǎn)過程。例如，歐盟已經(jīng)在“可再生能源指令2009/28/EG”中對(duì)生物質(zhì)燃料生產(chǎn)廠提出了更高的可持續(xù)性標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定從2018年起，新建立的生物質(zhì)乙醇廠必須實(shí)現(xiàn)減少60%溫室氣體排放的目標(biāo)[9]。對(duì)于采用傳統(tǒng)工藝的乙醇廠來(lái)說，這一標(biāo)準(zhǔn)非常難以達(dá)到[10]。因此將厭氧消化應(yīng)用于乙醇生產(chǎn)工藝是改善乙醇生產(chǎn)過程凈能量平衡和進(jìn)一步減少溫室氣體排放的一次很好的機(jī)會(huì)。大量的研究工作已證明厭氧消化可有效處理玉米酒糟清液[11-15]，但是這些研究并沒有給出進(jìn)一步處理厭氧消化出水的方法。

在中國(guó)，很多乙醇生產(chǎn)廠采用“厭氧消化-好氧消化-深度處理-排放”的酒糟清液處理工藝。該工藝存在的主要問題是，好氧消化過程的能耗大，與厭氧消化所得沼氣產(chǎn)生能量基本相當(dāng)，而且會(huì)產(chǎn)生大量剩余污泥需要處理，極大地增加了運(yùn)行成本。為此，我們提出了玉米乙醇-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)工藝以解決上述問題（圖1（b））。在該工藝中，酒糟清液先經(jīng)厭氧消化處理，產(chǎn)生的沼氣可滿足生產(chǎn)過程部分能量需求；而厭氧消化出水可回用于下一批的乙醇發(fā)酵過程，從而消除廢水的排放并減少水資源的消耗。前期小試和中試實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，該工藝循環(huán)過程中乙醇發(fā)酵正常，酒糟清液厭氧消化處理穩(wěn)定高效[16]。但是工藝的改變同時(shí)會(huì)造成副產(chǎn)物酒糟蛋白飼料成分的變化，因此作者研究玉米乙醇-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)工藝對(duì)酒糟蛋白飼料的影響。

圖1 傳統(tǒng)玉米乙醇干磨工藝與玉米乙醇-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)生態(tài)系統(tǒng)流程圖Fig.1 Process diagrams of conventional dry-mill corn grain-to-ethanol process and integrated corn ethanol-methane fermentation ecosystem

1 材料與方法

1.1 材料

酒糟蛋白飼料 （DDG）：在1 L乙醇發(fā)酵罐和20 L-5 L高溫-中溫兩級(jí)厭氧消化反應(yīng)器中連續(xù)運(yùn)行乙醇-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)工藝10批次[16]，分別對(duì)第1批和第10批獲得的酒糟蛋白飼料進(jìn)行取樣。

其它試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純市售商品。

1.2 方法

氨基酸：采用氨基酸分析儀測(cè)定（Hitachi 835-50，Japan）。

DDG基本成分：采用標(biāo)準(zhǔn)方法分析[17]。

電子鼻（αFOX 4000，Alpha M.O.S，F(xiàn)rance）檢測(cè)條件：采用頂空自動(dòng)進(jìn)樣法；載氣采用合成干燥空氣；流速為150 mL/min；注射體積為2.5 mL；注射速度為1 mL/s；注射針溫度為70℃；獲取時(shí)間為120 s。

頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用 （Headspace solidphase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS） （Agilent，USA） 檢測(cè)條件：萃取頭（CAR/PDMS）；SPME萃取頭解析時(shí)間 10 min；GC 條件：HP-5ms（5%-苯基-甲基聚硅氧烷）毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm 厚）；進(jìn)樣口溫度 250℃；載氣 He；流量 1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣；柱初溫40℃保持3 min，以8℃/min上升到120℃保持2 min，再以10℃/min上升至230℃保持8 min；MS條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量 70 eV；離子源溫度250℃；掃描范圍33～350 m/z。

2 結(jié)果與討論

在傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵干磨工藝中，酒糟清液蒸發(fā)得到的糖漿和濕酒糟渣混合，干燥制成酒糟蛋白飼料（DDGS）。而在耦聯(lián)工藝中，酒糟清液不再蒸發(fā)而直接進(jìn)入?yún)捬跸磻?yīng)器處理，因此最終得到的酒糟蛋白飼料為DDG。郭福存和江南[18]對(duì)DDG和DDGS的基本成分進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)DDG中含有較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白質(zhì)和氨基酸，較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鹽，見表1。Kim的研究也得到了同樣的結(jié)果[19]。據(jù)報(bào)道，糖漿中的某些高質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽，例如鉀鹽，還會(huì)對(duì)動(dòng)物飼料造成不良影響[20]。DDG的這些特征使其比DDGS更適合作為動(dòng)物飼料。另外，在耦聯(lián)工藝中，厭氧消化出水的循環(huán)使用可能會(huì)引起循環(huán)批次的DDG與第1批的DDG在基本成分和氣味上存在差異。表1顯示，兩者在基本成分上的區(qū)別主要在于粗脂肪的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表1 酒糟蛋白飼料DDG和DDGS成分分析比較Table 1 Analysis and comparison of composition of DDG and DDGS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%

為了比較循環(huán)批次DDG與第1批DDG在氣味上的差別，采用了電子鼻與頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用相結(jié)合的分析手段。電子鼻是利用氣體傳感器陣列的響應(yīng)曲線來(lái)識(shí)別氣味的電子系統(tǒng)，因此它可給予被測(cè)樣品揮發(fā)性成分的整體信息（即“指紋數(shù)據(jù)”），而非各成分信息。利用電子鼻可對(duì)不同樣品的氣味信息進(jìn)行比較分析，具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好、對(duì)樣品不需要預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn)[21]。因此本研究先利用傳感器型電子鼻對(duì)第1批和第10批的DDG進(jìn)行整體氣味信息的分析比較。

圖2為DDG樣品的電子鼻傳感器信號(hào)圖，可以看出兩批次的DDG在信號(hào)強(qiáng)度上有一定的差異。為了能更好的觀察和分析電子鼻的18個(gè)金屬氧化物傳感器 （Metal oxide semiconductor，MOS）對(duì)不同批次DDG的變化，又進(jìn)行了樣品的電子鼻傳感器信號(hào)數(shù)據(jù)的雷達(dá)圖見圖3。第1批和第10批DDG 間的差異主要表現(xiàn)在 T30/1、T70/2、PA/2、P30/1、P40/2、P30/2和T40/2七種傳感器上。主成分分析（Principle component analysis，PCA） 是一種多元統(tǒng)計(jì)方法，當(dāng)沒有或缺乏有關(guān)樣品信息時(shí)，PCA能迅速瀏覽所有數(shù)據(jù)，找出樣品間相關(guān)聯(lián)的特征，并從中總結(jié)出有關(guān)樣品的信息[22]。在本研究中，它將所提取的電子鼻傳感器多指標(biāo)的信息進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維，并對(duì)降維后的特征向量進(jìn)行線性分類，最后在PCA分析圖上顯示主要的二維圖，結(jié)果見圖4?？梢钥闯觯瑑蒁DG樣品的主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的累積方差貢獻(xiàn)率為96.155%，大于85%，這說明PC1和PC2已經(jīng)包含了很大的信息量，能夠反映樣品的整體信息，該圖表明，兩批DDG樣品有較明顯的差異。

圖2 第1批和第10批DDG樣品的雷達(dá)圖Fig.2 Radar map of the first and tenth batch of DDG

圖3 第1批和第10批DDG樣品的傳感器信號(hào)強(qiáng)度圖Fig.3 Sensor intensity of the first and tenth batch of DDG

圖4 第1批和第10批DDG樣品PCA分析Fig.4 PCA analysis of the first and tenth batch of DDG

采用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)兩批次DDG中的具體揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)。兩DDG樣品測(cè)定的總離子流色譜圖見圖5。通過計(jì)算機(jī)檢索及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，選取匹配度大于50的定性結(jié)果，從而確定了兩個(gè)DDG的揮發(fā)性成分組成，并用峰面積歸一化法計(jì)算出了各組分的相對(duì)含量，見表2。從總離子流色譜圖可以看出，DDG揮發(fā)性組分很豐富，各成分的峰尖且窄，相鄰峰幾乎完全得到分離，已定性組分峰面積之和占總離子流色譜峰面積的90%以上。說明實(shí)驗(yàn)用萃取條件和氣質(zhì)分析條件能夠滿足DDG揮發(fā)性成分分離的要求。

從兩批次DDG樣品中總共定性出33種揮發(fā)性成分。其中第1批DDG有26種，第10批DDG有24種，兩者共有組分有16種，占已定性組分?jǐn)?shù)的48%，說明兩個(gè)DDG樣品在揮發(fā)性組分上有一定的差異。電子鼻和GC/MS檢測(cè)結(jié)果都說明，第1批和第10批DDG在揮發(fā)性成分上存在一定的差異，而造成這種差異的主要原因有兩個(gè)：1）厭氧消化出水中的部分揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)入DDG中；2）厭氧消化出水回用對(duì)酵母的代謝副產(chǎn)物產(chǎn)生了一定的影響。但是用中試獲得的DDG作為飼料添加劑對(duì)豬進(jìn)行了飼喂實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)豬的生長(zhǎng)正常，并沒有受到不良影響。

圖5 第1批和第10批DDG樣品揮發(fā)性成分GC/MS總離子流色譜圖Fig.5 GC/MS totalion chromatogram ofvolatile compounds in the first and tenth batch of DDG

表2 第1批和第10批DDG揮發(fā)性成分及其相對(duì)含量Table 2 Volatile compounds and relativecontent in the first and tenth batch of DDG

續(xù)表

3 結(jié)語(yǔ)

玉米乙醇-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)工藝為解決傳統(tǒng)干磨工藝存在的能耗大、廢水處理成本高的問題提供了一條全新的思路。該工藝的可行性也得到了小試和中試實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。但是對(duì)于該工藝，值得注意的是工藝改變對(duì)主要副產(chǎn)物酒糟蛋白飼料質(zhì)量的影響。通過對(duì)酒糟蛋白飼料成分和氣味分析，發(fā)現(xiàn)耦聯(lián)工藝所得的酒糟蛋白飼料較傳統(tǒng)工藝含有更高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白質(zhì)和氨基酸，更低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鹽，擁有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。雖然循環(huán)批次所得酒糟蛋白飼料與第一批在氣味上表現(xiàn)出一定的差異，但是不會(huì)影響家畜的食用。

[1]MUSSATTO S I，DRAGONE G，GUIMARAES P M R，et al.Technological trends，global market，and challenges of bio-ethanol production[J].Biotechnology Advances，2010，28（6）：817-830.

[2]RENEWABLE F A.Ethanol Industry Outlook 2014[EB/OL].http：//www.ethanolrfa.org/pages/annual-industry-outlook，2014.

[3]BOTHAST R J，SCHLICHER M A.Biotechnological processes for conversion of corn into ethanol[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2005，67（1）：19-25.

[4]BELYEA R L，CLEVENGER T E，SINGH V，et al.Element concentrations of dry-grind corn-processing streams[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2006，134（2）：113-128.

[5]EGG R P，SWEETEN J M，COBLE C G.Grain sorghum stillage recycling：effect on ethanol yield and stillage quality[J].Biotechnology and Bioengineering，1985，27（12）：1735-1738.

[6]SHOJAOSADATI S A，SANAEI H R，F(xiàn)ATEMI S M.The use of biomass and stillage recycle in conventional ethanol fermentation[J].Journal of Chemical Technology and Biotechnology，1996，67（4）：362-366.

[7]SUNG S，SANTHA H.Performance of temperature-phased anaerobic digestion （TPAD）system treating dairy cattle wastes[J].Water Research，2003，37（7）：1628-1636.

[8]INGE R.The Alcohol Textbook[M].Nottingham：Nottingham University Press，2003.85-119.

[9]DROSG B，F(xiàn)UCHS W，MEIXNER K，et al.Anaerobic digestion of stillage fractions-estimation of the potential for energy recovery in bioethanol plants[J].Water Science&Technology，2013，67（3）：494-505.

[10]SCHNOOR J L.The debate is over[J].Environmental Science Technology，2006，40（9）：2861-2861.

[11]AGLER M T，GARCIA M L，LEE E S，et al.Thermophilic anaerobic digestion to increase the net energy balance of corn grain ethanol[J].Environmental Science Technology，2008，42（17）：6723-6729.

[12]SCHAEFER S H，SUNG S.Retooling the ethanol industry：thermophilic anaerobic digestion of thin stillage for methane production and pollution prevention[J].Water Environment Research，2008，80（2）：101-108.

[13]LEE P H，BAE J，KIM J，et al.Mesophilic anaerobic digestion of corn thin stillage：a technical and energetic assessment of the corn-to-ethanol industry integrated with anaerobic digestion[J].Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2011，86（12）：1514-1520.

[14]ALKAN O A，KARTHIKEYAN K.Anaerobic digestion of thin stillage for energy recovery and water reuse in corn-ethanol plants[J].Bioresource Technology，2011，102（21）：9891-9896.

[15]NASR N，ELBESHBISHY E，HAFEZ H，et al.Comparative assessment of single-stage and two-stage anaerobic digestion for the treatment of thin stillage[J].Bioresource Technology，2012，111：122-126.

[16]WANG K，ZHANG J，TANG L，et al.Establishment and assessment of a novel cleaner production process of corn grain fuel ethanol[J].Bioresource Technology，2013，148：453-460.

[17]AOAC.Official Methods of Analysis[M].Arlington：Association of Official Analytical Chemists，1995.

[18]GUO F C，JIANG N.Limiting factors and nutritional value of DDGS[J].China Poultry，2007，29（10）：43-44.（in Chinese）

[19]KIM Y，MOSIER N S，HENDRICKSON R，et al.Composition of corn dry-grind ethanol by-products：DDGS，wet cake，and thin stillage[J].Bioresource Technology，2008，99（12）：5165-5176.

[20]RAUSCHKD，BELYEAR L.The future ofcoproductsfromcorn processing[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2006，128（1）：47-86.

[21]WU Shouyi，ZOU Xiaobao.Progress in the application research of electronic nose for foods[J].JournaI of Jiangsu University of Science and Technology：Natural Science，2000，21（6）：13-17.（in Chinese）

[22]CHEN Xiaoming，MA Minghui，LI Jingming，et al.Application of electronic nose equipment on identification of natural apple essence[J].Food Science，2007，28（3）：261-265.（in Chinese）