重組β-半乳糖苷酶的制備及轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

胡樹(shù)兵 ， 段緒果 ， 吳 敬 *

（1．食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無(wú)錫 214122；2．江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

低聚半乳糖（galacto-oligosaccharide，GOS）是在乳糖分子的半乳糖基一側(cè)連接上1-4個(gè)半乳糖基生成的低聚糖類(lèi)。 半乳糖之間以 β（1-3）、β（1-4）或β（1-6）鍵連接，其中以 β（1-4）鍵為主，是由葡萄糖和半乳糖組成的雜低聚糖[1]。低聚半乳糖是目前各類(lèi)功能性低聚糖品種中惟一源自動(dòng)物乳汁中的一類(lèi)，并且在提高雙歧桿菌數(shù)量、降低梭菌數(shù)量、產(chǎn)生較多短鏈脂肪酸、產(chǎn)生較少氣體等方面具有突出的優(yōu)點(diǎn)[2]。研究證明，GOS可以作為腸道內(nèi)雙歧桿菌增殖因子，具有良好的保健作用。由于在酸性和高溫條件下具有極好的穩(wěn)定性，低聚半乳糖被廣泛地應(yīng)用于糖果、果醬、烘焙食品、清涼飲料、保健食品等。隨著研究的深入，其應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，產(chǎn)品種類(lèi)繁多[3-4]。

以乳糖為底物，利用微生物β-D-半乳糖苷酶催化是工業(yè)化生產(chǎn)低聚半乳糖的主要途徑[5]。β-半乳糖苷酶 （EC3.2.1.23），全稱(chēng)為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，又名乳糖酶，是一種廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中的多功能酶。它不但能夠水解乳糖，還具有半乳糖苷轉(zhuǎn)移活性[6]。該酶可以從多種微生物中得到，例如真菌和細(xì)菌。不同來(lái)源的酶表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)糖基活性，從而導(dǎo)致其合成GOS的水平和組成各不相同。Prenosil等認(rèn)為來(lái)源于真菌、米曲霉的β-半乳糖苷酶與產(chǎn)自黑曲霉、乳酸克魯維酵母和脆壁克魯維酵母的酶相比，可以合成更高濃度的GOS[7]。吳玉飛等將來(lái)源于硫礦硫化葉菌的一種突變體F441Y分別在大腸桿菌BL21（DE3）和畢赤酵母中進(jìn)行了重組表達(dá)，優(yōu)化了酶轉(zhuǎn)化條件，最高GOS轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到61%和59.9%[8-9]。環(huán)狀芽孢桿菌Bacillus circulans β-半乳糖苷酶具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)糖基活性，能夠高效轉(zhuǎn)化乳糖生產(chǎn)低聚半乳糖。而且該酶制備的GOS主要由β-1-4糖苷鍵連接而成，產(chǎn)品應(yīng)用效果明顯、穩(wěn)定性良好，在歐洲被長(zhǎng)期應(yīng)用于功能食品及保健品中，已經(jīng)被證明安全可靠。

前期我們構(gòu)建了一種新的重組大腸桿菌E.coli BL21（DE3）/pET-20b-lac，并對(duì)重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。作者以前期構(gòu)建的重組大腸桿菌為菌種，在搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，得到了重組β-半乳糖苷酶粗酶液。在參考該重組酶酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)酶轉(zhuǎn)化工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲得高效生產(chǎn)低聚半乳糖的最優(yōu)方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

帶有源自環(huán)狀芽孢桿菌B.circulans β-半乳糖苷酶基因β-lac的重組菌E.coli BL21（DE3）/pET-20b-lac為作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 LB種子培養(yǎng)基（g/L） 蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；氨芐霉素的終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。

1.2.2 TB發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L） 蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，磷酸氫二鉀 12.54，磷酸二氫鉀 2.31，甘氨酸0.75%；氨芐霉素終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。

1.3 主要試劑

蛋白胨、酵母粉：購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（oNPG）：購(gòu)于美國(guó)的Sigma公司；α-乳糖等國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭嘿?gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)β-半乳糖苷酶

將保存在-80℃冰箱中的菌種以2%的接種體積分?jǐn)?shù)接種至LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)8 h。然后以5%接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至已加入甘氨酸的TB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=2時(shí)，加入2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)30 h。將發(fā)酵液離心取上清液，即為β-半乳糖苷酶粗酶液。

1.5 β-半乳糖苷酶oNPG水解活力的測(cè)定

配置0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸鈉緩沖液，取1.8 mL置于5 mL離心管中，加入100 μL稀釋后的粗酶液，置于50℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，再加入10 μL 20 mmol/L的oNPG作為底物[10]。反應(yīng)10 min后加入1 mL 1 mol/L冰預(yù)冷的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，420 nm光吸收下測(cè)定吸光值。在上述條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化生成1 μmol oNPG所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.6 β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖工藝優(yōu)化

1.6.1 反應(yīng)初始pH對(duì)GOS轉(zhuǎn)化率的影響 分別用 pH 值為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的磷酸緩沖液溶解300 g/L的乳糖作為底物，加入終濃度為3 U/mL的粗酶液后置于水浴搖床中進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化。設(shè)置水浴搖床溫度為40℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，反應(yīng)24 h后煮沸樣品終止反應(yīng)，產(chǎn)物用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.2 反應(yīng)溫度對(duì)GOS轉(zhuǎn)化率的影響 用pH 6.5的磷酸緩沖液溶解300 g/L乳糖作為底物，加入3 U/mL的粗酶液后置于水浴搖床中進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。水浴搖床溫度分別控制在 40、45、50、55、60、65、70℃，轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r/min，反應(yīng)24 h后煮沸樣品終止反應(yīng)，產(chǎn)物用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.3 乳糖濃度對(duì)GOS轉(zhuǎn)化率的影響 用pH 6.5的50 mmol/L磷酸緩沖液分別配制質(zhì)量濃度為300、400、500、600、700、800 g/L 的反應(yīng)底物乳糖溶液，分別加入3 U/mL的粗酶液，在55℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的回轉(zhuǎn)式水浴搖床中反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后煮沸樣品終止反應(yīng)，用HPLC檢測(cè)生成的產(chǎn)物。

1.6.4 加酶量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)GOS轉(zhuǎn)化率的影響用pH 6.5的50 mmol/L磷酸緩沖液配制反應(yīng)底物乳糖溶液（700 g/L），加酶量分別控制為 1、3、5、8、15 U/mL，設(shè)置水浴搖床溫度為55℃、轉(zhuǎn)速150 r/min，從第4小時(shí)開(kāi)始每隔4 h取樣煮沸終止反應(yīng)，直至反應(yīng)達(dá)到平衡，產(chǎn)物用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 低聚半乳糖測(cè)定方法

產(chǎn)物中的轉(zhuǎn)移二糖含量采用HPLC檢測(cè)[11]。色譜條件為：安捷倫1200 HPLC色譜儀，安捷倫自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱 Thermo Aps-2 HYPERSIL（4.6 mm×250 mm），示差檢測(cè)器為安捷倫2410；流動(dòng)相采用體積分?jǐn)?shù)75%乙腈和水的混合溶液，流速為 0.8 mL/min，柱溫設(shè)定為40℃。

低聚半乳糖產(chǎn)物中的四糖、三糖以及乳糖和單糖的量采用HPLC來(lái)確定[12]。色譜條件為：安捷倫1200 HPLC色譜儀，安捷倫自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱Bio-radAminex HPX-87H （7.8 mm×300 mm），示差檢測(cè)器安捷倫2410；流動(dòng)相為5 mmol/L稀硫酸溶液，流速設(shè)定為0.6 mL/min，柱溫控制40℃。

1.8 低聚半乳糖產(chǎn)率的計(jì)算

其中 GOS（%）=TD（%）+三糖（%）+四糖（%）其中TD為轉(zhuǎn)移二糖

2 結(jié)果與討論

2.1 重組β-半乳糖苷酶的搖瓶發(fā)酵制備

將菌種以2%的接種體積分?jǐn)?shù)從甘油管接種至LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)8 h轉(zhuǎn)接至已加入甘氨酸的TB培養(yǎng)基，當(dāng)OD600=2時(shí)，加入2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，每隔6 h取樣測(cè)酶活，將酶活隨著時(shí)間變化的曲線繪制成圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。隨著時(shí)間的推移，重組β-半乳糖苷酶酶活不斷增加，誘導(dǎo)24 h達(dá)到最高酶活15 U/mL，繼續(xù)增加誘導(dǎo)時(shí)間，胞外酶活有下降的趨勢(shì)。

圖1 重組菌在搖瓶發(fā)酵中的產(chǎn)酶曲線Fig.1 Fermentation process of the recombinant E.coli BL21（DE3） in shake flask

2.2 初始pH對(duì)GOS轉(zhuǎn)化率的影響

pH的改變可以影響酶活性中心基團(tuán)的解離程度，同時(shí)可以影響輔酶和底物的解離程度，進(jìn)而影響酶分子與底物分子的結(jié)合。只有在合適的pH下，底物分子和酶與輔酶的解離狀態(tài)才能達(dá)到最佳，從而更有利于它們互相結(jié)合，發(fā)生催化作用，使酶反應(yīng)速率達(dá)到最高[13]。

為了探究不同pH對(duì)GOS轉(zhuǎn)化率的影響，用磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖液溶解30%的乳糖，加酶量為3 U/mL，40℃下進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖2。在pH 4.0條件下，GOS轉(zhuǎn)化率只有30%；隨著pH的增加，GOS轉(zhuǎn)化率逐漸升高，當(dāng)反應(yīng)體系的pH為6.5時(shí)，GOS轉(zhuǎn)化率為38%，是所有pH條件下的最高水平。pH范圍在5.5～7.0之間時(shí)，GOS轉(zhuǎn)化率維持在相對(duì)較高的水平。這可能是由于在pH 4.0的條件下，整個(gè)反應(yīng)體系偏酸性，導(dǎo)致酶嚴(yán)重失活，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。而在pH 5.5～7.0范圍內(nèi)，β-半乳糖苷酶相對(duì)穩(wěn)定，從而使轉(zhuǎn)化率維持在較高水平。

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)GOS轉(zhuǎn)化率的影響

文獻(xiàn)報(bào)道顯示，反應(yīng)溫度對(duì)GOS轉(zhuǎn)化率的影響較為明顯[14]。如圖3所示，55℃下GOS轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值43%，隨著溫度的升高或下降，GOS轉(zhuǎn)化率下降。70℃下GOS轉(zhuǎn)化率只有32%。從圖中也可以看出，在一定的范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，GOS轉(zhuǎn)化率逐漸升高，這可能是因?yàn)闇囟扔绊懥朔磻?yīng)過(guò)程中分子間相互作用的速度、活化能以及酶和底物的熱穩(wěn)定性，從而改變了GOS的產(chǎn)率[9]。一般來(lái)說(shuō)，在不影響酶活力的前提下，溫度越高，反應(yīng)速率可能越快，同時(shí)高溫可以增加底物的溶解度，有利于提高生產(chǎn)效率。綜合以上因素，選用55℃為后續(xù)研究的反應(yīng)溫度。

圖2 pH對(duì)低聚半乳糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect ofpH on the yield of galactooligosaccharides

圖3 溫度對(duì)低聚半乳糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of temperature on the yield of galactooligosaccharides

2.4 底物質(zhì)量濃度對(duì)GOS轉(zhuǎn)化率的影響

除了溫度和pH兩個(gè)因素之外，底物質(zhì)量濃度也對(duì)GOS轉(zhuǎn)化率有很大的影響[15]。如圖4所示，乳糖質(zhì)量濃度為300 g/L時(shí)，GOS轉(zhuǎn)化率只有42%。隨著乳糖質(zhì)量濃度的增加，GOS轉(zhuǎn)化率也逐漸提高，當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度為700 g/L時(shí)，GOS轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，為53%。繼續(xù)增加乳糖質(zhì)量濃度，GOS轉(zhuǎn)化率顯著下降，當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度增大到800 g/L時(shí)，GOS轉(zhuǎn)化率下降到47%。

從β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)化乳糖制備GOS的反應(yīng)過(guò)程來(lái)分析，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是β-半乳糖苷酶同時(shí)具有轉(zhuǎn)苷活性和水解活性，它的催化反應(yīng)是一個(gè)可逆的過(guò)程。由化學(xué)平衡可知，提高底物乳糖質(zhì)量濃度，可推動(dòng)轉(zhuǎn)苷反應(yīng)朝正向進(jìn)行，促進(jìn)低聚半乳糖的生成。此外，提高乳糖質(zhì)量濃度還可以降低水活度，從而降低酶水解活性、提高其轉(zhuǎn)苷活性。因而當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度小于等于700 g/L時(shí)，GOS轉(zhuǎn)化率隨著底物質(zhì)量濃度的增加不斷升高。但是當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，低聚半乳糖轉(zhuǎn)化率降低，這可能是因?yàn)檫^(guò)高的底物質(zhì)量濃度會(huì)使體系的水分活度過(guò)低，同時(shí)增加了反應(yīng)體系的傳質(zhì)傳熱難度，對(duì)酶反應(yīng)產(chǎn)生了一定的抑制作用[7]，因此選用700 g/L的起始乳糖質(zhì)量濃度為最佳。

圖4 乳糖質(zhì)量濃度對(duì)低聚半乳糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of lactose concentrations on the yield of galactooligosaccharides

2.5 加酶量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)GOS轉(zhuǎn)化率的影響

加酶量不僅影響最終的GOS產(chǎn)量，還會(huì)影響反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間。作者從反應(yīng)過(guò)程的不同反應(yīng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行取樣，測(cè)定反應(yīng)體系中GOS轉(zhuǎn)化率，并且繪制反應(yīng)過(guò)程GOS轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化的曲線，以考察不同加酶量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)GOS轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

加酶量為1 U/mL時(shí)，反應(yīng)進(jìn)行30 h達(dá)到平衡，GOS轉(zhuǎn)化率仍未達(dá)到最大值。當(dāng)加酶量為3 U/mL和5 U/mL時(shí)，反應(yīng)20 h GOS轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到最大值53.6%和54.8%。當(dāng)加酶量增加到8 U/mL時(shí)，達(dá)到最大GOS轉(zhuǎn)化率的時(shí)間明顯縮短，16 h GOS最高轉(zhuǎn)化率為57%，為幾種加酶量下的最高轉(zhuǎn)化率。當(dāng)繼續(xù)增大加酶量到15 U/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化率很快達(dá)到最大值52.2%，但隨著反應(yīng)時(shí)間的推移，轉(zhuǎn)化率有下降的趨勢(shì)。

分析產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因，可能是由于加酶量過(guò)低時(shí)，其催化能力不足，酶反應(yīng)速率較低。而加酶量過(guò)高時(shí)，生成的產(chǎn)物又容易被過(guò)量加入的酶水解掉，從而降低GOS的最終轉(zhuǎn)化率。因此，為了在盡可能短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)達(dá)到最高的轉(zhuǎn)化率，選用8 U/mL的加酶量為最佳。

圖5 加酶量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)低聚半乳糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of enzyme concentration and reaction timeon the yield of galactooligosaccharides

3 結(jié) 語(yǔ)

本研究中重組 E.coli BL21（DE3）/pET-20b-lac菌株能夠高效分泌表達(dá)β-半乳糖苷酶，搖瓶發(fā)酵初步研究得到胞外上清酶活為15 U/mL。對(duì)該重組β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)化乳糖制備低聚半乳糖轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)反應(yīng)條件為：底物質(zhì)量濃度700 g/L，反應(yīng)初始pH 6.5，溫度55℃，加酶量8 U/mL，在該條件下轉(zhuǎn)化16 h，低聚半乳糖最大轉(zhuǎn)化率達(dá)到57%。在后續(xù)的研究中，我們計(jì)劃將該酶在食品安全宿主枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis中進(jìn)行表達(dá)，獲取酶液以制備低聚半乳糖。

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