γ-氨基丁酸受體ρ2亞基重組蛋白構(gòu)建及表達(dá)

王 琪，李超堃，李 敏，安欣芳，付自醒

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453002；3.河南省生物精神病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453002)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過對氯離子通道型GABAC受體的作用，改變氯離子的通透性，引起細(xì)胞膜超極化[1]，進(jìn)而抑制神經(jīng)元興奮。GABA受體分為GABAA、GABAB和GABAC3種亞型，其中GABAA和GABAC屬于配體依賴性氯離子通道受體超家族。組成GABAC受體的亞基主要有3個(gè)，分別為ρ1、ρ2和ρ3。相對于GABAA受體，GABAC受體對GABA更敏感，通道開放時(shí)間更持久，介導(dǎo)持久且緩慢的內(nèi)向氯離子電流[2]。GABAC受體對荷包牡丹堿和巴氯芬均不敏感，可受槲皮素及槲皮素苷調(diào)節(jié)[3]。近年國內(nèi)外大量研究表明，腦缺血可引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性毒性，尤其是谷氨酸的大量釋放及累積是引起神經(jīng)元損傷的重要原因[4-7]。GABA受體對缺血性腦損傷起著非常重要的保護(hù)作用[8]。研究證實(shí)，增強(qiáng)GABA受體活性可抑制腦缺血損傷釋放的大量谷氨酸毒性作用，進(jìn)而發(fā)揮抗腦缺血損傷作用[9-10]。因此，GABAC受體可作為缺血刺激和藥物作用的重要靶標(biāo)。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，黃體酮等藥物能夠特異性結(jié)合GABAC受體ρ2亞基，進(jìn)而干預(yù)GABA能信號(hào)傳導(dǎo)[11-12]，推測GABAC受體ρ2亞基的激活可能在藥物神經(jīng)保護(hù)功能中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證胞內(nèi)GABAC受體ρ2高表達(dá)水平是否具有神經(jīng)保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)在體外合成重組蛋白GABACR ρ2，借助人類免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)的反義激活蛋白(transactivator transcription,Tat)介導(dǎo)重組蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，構(gòu)建一過性表達(dá)系統(tǒng)，為研究GABAC受體ρ2亞基功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料DH5α感受態(tài)細(xì)胞、BL21(DE3)PlysS感受態(tài)細(xì)胞、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒、Bradford蛋白定量試劑盒、His-tag、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)一抗、堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)二抗均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，2×PCR Reagent試劑購于天根生化科技(北京)有限公司，Phusion 超保真DNA 聚合酶購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司，限制性內(nèi)切酶QuickCutDpnI購于寶生物工程(大連)有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒購于美國OMEGA 生物公司，Ni-NTA Fast Start Kit購于美國QIAGEN生物公司，胎牛血清購于美國Hyclone生物公司，高糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、青-鏈霉素購于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，PCR引物由上海Invitrogen生物公司合成，預(yù)染低分子量蛋白Marker購于上海索萊寶生物科技有限公司，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y購于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.2方法

1.2.1重組質(zhì)粒pET-ρ2-GFP-Tat的構(gòu)建以pET30 DNA為模版，pET30上游引物為5′-CATATGTATATCTCCTTCT-3′，下游引物為5′-CACCACTGAGATCCGGCTGCTAAC-3′。利用快速克隆法[11]進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建，以獲得pET30基因片段。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：H2O 33 μL，5×Phusion擴(kuò)增緩沖液 10 μL，脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)2 μL，Phusion DNA聚合酶0.5 μL，上下游引物(5 μmol·L-1)各1 μL，pET30 DNA模板 3 μL，總體積 50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性 15 s；58 ℃復(fù)性15 s；72 ℃延伸 3 min 50 s，18個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸 5 min；4 ℃保存。抽取部分PCR產(chǎn)物利用體積分?jǐn)?shù)10 g·L-1的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

以pEGFP-ρ2質(zhì)粒為模版，ρ2上游引物為5′-GAAACGTCGTCAGCGTCGCCGTATGCCTTATTTTAC-AAGACTC-3′，下游引物為5′-CCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAACGGACTTCCGGCGTTTCA-3′。上、下游引物分別引入Tat、His-tag標(biāo)簽序列進(jìn)行擴(kuò)增以獲得ρ2-GFP-Tat片段。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：H2O 35 μL，5×Phusion擴(kuò)增緩沖液10 μL，dNTP 2 μL，Phusion DNA聚合酶0.5 μL，上下游引物各(5 μmol·L-1) 1 μL，DNA模版 1 μL，總體積 50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性30 s；55 ℃復(fù)性30 s；72 ℃延伸3 min 30 s，共18個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min；4 ℃保存。應(yīng)用體積分?jǐn)?shù)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

將PCR產(chǎn)物各加1 μLDpnI 37 ℃消化過夜，pET30α骨架與ρ2-GFP-Tat片段按11比例混合[11]。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選Kan+抗體單克隆，過夜、培養(yǎng)。取菌液行PCR鑒定重組質(zhì)粒。測序上游引物為5′-GTAGAGGATCGAGATCGA-3′，下游引物為5′-ATCCGGATATAGTTCCTC-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：H2O 7 μL，2×PCR Reagent 10 μL，上、下游引物 (10 μmol·L-1)各1 μL，細(xì)菌液 1.5 μL，總體積 20 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃復(fù)性30 s；72 ℃延伸90 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸 5 min；4 ℃保存。擴(kuò)增完成后，進(jìn)行體積分?jǐn)?shù)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將陽性克隆菌液送于北京Invitrogon測序公司進(jìn)行測序。重組質(zhì)粒命名為pET-ρ2-GFP-Tat質(zhì)粒，測定質(zhì)粒DNA濃度，于-20 ℃保存。

1.2.2重組蛋白ρ2-GFP-Tat誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化將pET-ρ2-GFP-Tat轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)PlysS中，待菌液在600 nm波長下的吸光度值達(dá)到0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，分別于37 ℃和26 ℃誘導(dǎo)過夜。收集菌液于離心管中，12 000 r·min-1離心1 min，棄上清液，加 200 μL 磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline，PBS)重懸沉淀，冰浴20 min后，超聲破碎(6 s超聲6 s間隔)，至菌液澄清。將澄清液體在4 ℃下12 000 r·min-1離心20 min，收集上清液即為可溶性蛋白。8 mol·L-1尿素溶解沉淀，冰浴 30 min，于 4 ℃ 下12 000 r·min-1離心20 min，取上清液即為包涵體蛋白。應(yīng)用免疫印跡鑒定重組蛋白表達(dá)，一抗為小鼠源GFP抗體(11 000 稀釋)，二抗為堿性磷酸酶(Ap)標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(11 000 稀釋)。

1.2.3純化重組蛋白ρ2-GFP-Tat用上述方法誘導(dǎo)200 mL菌液，表達(dá)并提取包涵體蛋白。用His標(biāo)簽親和層析柱進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，5 mL 變性結(jié)合緩沖液平衡柱子后，上樣，分別用10 mL 變性結(jié)合緩沖液，20 mL 變性洗滌緩沖液 (8 mol·L-1尿素，pH 6.3)，2 mL 變性洗脫緩沖液(8 mol·L-1尿素，pH 4.5)進(jìn)行蛋白洗脫，并收集流體。為得到較高純度的重組蛋白，將收集的2 mL流體掛柱，再次進(jìn)行離子交換層析，然后，取 5 cm 透析袋進(jìn)行脫鹽，收集重組蛋白。分別取10 μL收集流體上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離和考馬斯亮藍(lán)染色，鑒定重組蛋白表達(dá)純化情況。

1.2.4重組蛋白ρ2-GFP-Tat轉(zhuǎn)染細(xì)胞將SH-SY5Y細(xì)胞接種于3 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到約80%進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染組)。用含20 μg ρ2-GFP-Tat重組蛋白的1 mL高糖DMEM孵育細(xì)胞24 h。設(shè)置正常培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞為對照組。熒光顯微鏡下觀察Tat介導(dǎo)重組蛋白ρ2的轉(zhuǎn)染能力。

1.2.5重組蛋白ρ2-GFP-Tat的活力檢測胰蛋白酶消化SH-SY5Y細(xì)胞，稀釋細(xì)胞濃度為5×107L-1，每孔100 μL接種于96孔板。按培養(yǎng)條件，將細(xì)胞分為正常組和低氧低糖組。正常組又分為正常對照組和正常轉(zhuǎn)染組。其中正常轉(zhuǎn)染組進(jìn)行 20 μg 重組蛋白ρ2-GFP-Tat預(yù)孵育;正常對照組更換等體積高糖培養(yǎng)基，正常條件下培養(yǎng)。低氧低糖組又分為處理轉(zhuǎn)染組和處理組，處理轉(zhuǎn)染組進(jìn)行 20 μg 重組蛋白ρ2-GFP-Tat預(yù)孵育；處理組更換等體積新鮮低糖培養(yǎng)基。24 h后，2組均給予細(xì)胞低氧低糖損傷處理12 h。各組均更換含有10 μL 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒溶液的新鮮培養(yǎng)基，37 ℃孵育1 h，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測各組細(xì)胞吸光度值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒pET-ρ2-GFP-Tat構(gòu)建經(jīng)核酸電泳后，PCR產(chǎn)物分別在3～5 kb和2～3 kb出現(xiàn)條帶，見圖1。其中，泳道1在2～3 kb處出現(xiàn)與預(yù)期的ρ2基因片段(2.8 kb)大小相符的條帶，泳道2在3～5 kb處出現(xiàn)與預(yù)期pET30骨架片段(5.4 kb)大小相符的條帶(圖1A)。重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)板長有6個(gè)單克隆菌落，挑取菌落進(jìn)行菌液PCR，結(jié)果顯示，菌液樣品均在2.8 kb位置出現(xiàn)條帶，與預(yù)期基因片段大小相符，電泳結(jié)果見圖1B。6個(gè)克隆均為陽性克隆。菌液經(jīng)測序證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建完成。

A：ρ2-GFP-Tat PCR產(chǎn)物鑒定圖；1：ρ2-GFP-Tat；2：pET30 質(zhì)粒片段；B：單克隆菌液PCR鑒定重組質(zhì)粒pET30-ρ2-GFP-Tat圖；3～8：6個(gè)單克隆菌落的菌液PCR產(chǎn)物；9：DNA marker。

圖1PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.1AgarosegelelectrophoresisofPCRproduct

2.2重組蛋白ρ2-GFP-Tat的表達(dá)及條件優(yōu)化運(yùn)用GFP單克隆抗體進(jìn)行菌體蛋白免疫印跡分析，結(jié)果顯示于泳道2和泳道3中可見相對分子質(zhì)量70 000～99 000之間存在蛋白條帶，與預(yù)期大小為79 000的重組蛋白ρ2-GFP-Tat大小相符。而泳道4和泳道5為不同溫度條件下提取的可溶性蛋白，經(jīng)檢測未發(fā)現(xiàn)蛋白條帶。結(jié)果證實(shí)，重組蛋白ρ2-GFP-Tat主要以包涵體形式表達(dá)，且在26 ℃誘導(dǎo)溫度下其表達(dá)量較高(圖2)。

1：對照組；2：37 ℃誘導(dǎo)所得的包涵體；3：26 ℃誘導(dǎo)所得的包涵體；4：37 ℃ 誘導(dǎo)所得的可溶性蛋白；5：26 ℃誘導(dǎo)所得的可溶性蛋白。

圖2重組蛋白ρ2-GFP-Tat表達(dá)

Fig.2Expressionoftherecombinantproteinρ2-GFP-Tat

2.3重組蛋白ρ2-GFP-Tat純化蛋白電泳后考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果見圖3。重組蛋白相對分子質(zhì)量為79 000，蛋白條帶清晰可見，表明了重組蛋白的成功表達(dá)和純化。

1：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：細(xì)胞裂解物；3：包涵體蛋白；4：結(jié)合緩沖液洗脫流體；5：洗滌緩沖液洗脫流體；6：洗脫緩沖液洗脫流體；7：脫離緩沖液洗脫流體。

圖3重組蛋白ρ2-GFP-Tat的SDS-PAGE圖

Fig.3SDS-PAGEfigureofrecombinantproteinρ2-GFP-Tat

2.4重組蛋白ρ2-GFP-Tat轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，轉(zhuǎn)染重組蛋白的細(xì)胞在顯微鏡下可見到綠色熒光信號(hào)，且細(xì)胞核表現(xiàn)陰性熒光信號(hào)；對照組SH-SY5Y細(xì)胞無綠色熒光信號(hào)；見圖4。結(jié)果證實(shí)重組蛋白ρ2在Tat信號(hào)肽介導(dǎo)下可穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞。

A：轉(zhuǎn)染組細(xì)胞明視野圖；B：轉(zhuǎn)染組細(xì)胞暗視野圖；C：正常組細(xì)胞明視野圖；D：正常組細(xì)胞暗視野圖。

圖4重組蛋白ρ2-GFP-Tat轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞(×400)Fig.4Recombinantproteinρ2-GFP-TattransfectSH-SY5Ycells(×400)

2.5重組蛋白ρ2-GFP-Tat的活性評價(jià)正常對照組、正常轉(zhuǎn)染組、處理組和處理轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力分別為(100.0±6.9)%、(89.3±3.6)%、(51.4±3.6)%和(66.1±8.5)%。正常對照組與正常轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；處理組細(xì)胞活力顯著低于正常對照組(P<0.01)；處理轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力顯著高于處理組(P<0.01)。

3 討論

基因工程應(yīng)用中常使用質(zhì)?；虿《具M(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞，該手段風(fēng)險(xiǎn)高，并且轉(zhuǎn)染效率低，周期長。近年來，利用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域輔助的蛋白質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)成為研究熱點(diǎn)。其中，HIV-1 Tat是由11個(gè)氨基酸組成的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，該蛋白域自1998年被發(fā)現(xiàn)后，已廣泛應(yīng)用于外源蛋白、DNA或復(fù)合物透過細(xì)胞膜及血腦屏障的轉(zhuǎn)導(dǎo)[12-13]。Tat融合蛋白可引導(dǎo)不同蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入多種細(xì)胞，目前應(yīng)用的細(xì)胞有外周血淋巴細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、交感神經(jīng)瘤細(xì)胞等[14-17]。且Tat連接的相對位置對目的蛋白的二級結(jié)構(gòu)及功能無影響[18]。Tat介導(dǎo)神經(jīng)珠蛋白可透過血腦屏障發(fā)揮其缺氧缺血腦損傷的保護(hù)作用[19]。白血病抑制因子受體ɑ亞基在Tat介導(dǎo)下透過生物膜，實(shí)現(xiàn)抑制急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞活性[20]。Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)入酶缺乏細(xì)胞，可有效治療Lesch-Nyhan綜合征[21]。以上研究充分證實(shí)了HIV-1 Tat 具有廣譜的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，為異源蛋白質(zhì)跨膜開辟了新途徑。

GABA受體家族中，GABAC受體和GABAA受體均屬于配體依賴性氯離子通道受體，可通過調(diào)節(jié)GABA能神經(jīng)傳遞系統(tǒng)興奮性/抑制性平衡從而維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)[9]。體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明，氧糖剝奪后神經(jīng)元細(xì)胞GABAA受體顯著下降[22]。研究發(fā)現(xiàn)，藥物可通過調(diào)節(jié)GABA受體的表達(dá)，發(fā)揮抗缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用[23]。在缺血腦損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，一些可促進(jìn)GABA攝入或者激活GABAA受體的藥物顯示出一定的神經(jīng)保護(hù)作用[24-25]。神經(jīng)元細(xì)胞表面促離子型GABA受體及其功能的變化可作為關(guān)鍵因素決定神經(jīng)元在缺血損傷中的最終命運(yùn)。而目前關(guān)于ρ2亞基功能的研究更多的是采用基因敲除[26]或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或藥物激活/阻斷[27-28]等手段，但存在耗時(shí)長、效率低等局限性。本研究利用Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)肽成功實(shí)現(xiàn)了ρ2在SH-SY5Y細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，為后續(xù)干預(yù)研究提供新思路和技術(shù)手段。

本研究利用原核表達(dá)載體構(gòu)建ρ2-GFP-Tat重組蛋白，為驗(yàn)證重組蛋白跨膜能力，對SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行重組蛋白轉(zhuǎn)染。由于ρ2末端融合了GFP，經(jīng)重組蛋白ρ2-GFP-Tat轉(zhuǎn)染后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞顯示出綠色熒光信號(hào)。這證實(shí)了重組蛋白ρ2-GFP-Tat成功透過胞膜進(jìn)入人SH-SY5Y細(xì)胞。細(xì)胞活力檢測結(jié)果顯示，正常對照組、正常轉(zhuǎn)染組、處理組和處理轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力分別為(100.0±7.0)%、(89.3±3.6)%、(51.4±3.6)%、(66.1±8.5)%。正常條件培養(yǎng)下重組蛋白ρ2-GFP-Tat對細(xì)胞活力無影響，低氧低糖損傷后，處理轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力明顯高于處理組。這說明重組蛋白ρ2-GFP-Tat在缺氧損傷過程中能夠一定程度上增強(qiáng)細(xì)胞活力。

本研究體外合成ρ2蛋白，并借助Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)肽對缺氧細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，進(jìn)而發(fā)揮其受體功能，增強(qiáng)細(xì)胞活力。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組蛋白ρ2-GFP-Tat-His，表明可以利用原核體系表達(dá)融合蛋白ρ2-GFP-Tat-His，在神經(jīng)元缺氧損傷模型中構(gòu)建ρ2一過性表達(dá)體系，提高其胞內(nèi)表達(dá)水平，進(jìn)而為研究GABAC受體參與神經(jīng)損傷及藥物干預(yù)機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)手段，為干預(yù)神經(jīng)疾病奠定理論基礎(chǔ)。

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