純堿法制備雞皮明膠的工藝優(yōu)化研究

柴夢(mèng)陽(yáng)，辛穎，賴少娟，陳復(fù)生，*

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001；2.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

明膠是動(dòng)物的皮膚、骨、肌腱等結(jié)締組織中的膠原蛋白在一定條件下經(jīng)過(guò)水解處理而得到的多肽混合物[1-2]。明膠具有膠凝性、乳化性、發(fā)泡性等功能性質(zhì)，且其水凝膠具有可逆性、熔點(diǎn)接近于人體溫度、易溶于水的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)[3-5]。市售明膠主要以哺乳動(dòng)物明膠為主，例如豬皮和豬骨明膠、牛皮和牛骨明膠。然而，由于各種哺乳動(dòng)物疾病以及宗教的不斷壯大，哺乳動(dòng)物（豬和牛）明膠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展遭受嚴(yán)重打擊[6-7]。近年來(lái)，魚明膠受到大部分研究學(xué)者的青睞，但是大量的研究證明魚明膠無(wú)法達(dá)到哺乳動(dòng)物明膠的性質(zhì)[8-10]，于是尋找新的明膠來(lái)源成為了現(xiàn)在明膠行業(yè)急需解決的問(wèn)題。雞肉含有豐富的膠原蛋白及多種人體必需氨基酸，深受人們的喜愛(ài)，然而雞皮卻經(jīng)常被當(dāng)做廢棄物丟掉，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。有學(xué)者針對(duì)雞皮做了研究發(fā)現(xiàn)雞皮可以作為提取明膠的良好原料，所得雞皮明膠具有較高的凝膠強(qiáng)度[3]，而凝膠強(qiáng)度是衡量明膠品質(zhì)的商業(yè)指標(biāo)[11]。因此，采用雞皮作為明膠原料不僅能提高資源利用率，還能增加企業(yè)效益。本研究采用純堿法提取雞皮明膠，先通過(guò)單因素試驗(yàn)確定雞皮明膠的基本條件，再通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化得到最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

雞皮：取自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；乙醚、氫氧化鈉：洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠；蒸餾水：河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，所有試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

電熱恒溫干燥箱（DHG-9246A）：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；冷凍干燥機(jī)（LGJ-18）：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；箱式電阻爐（SX-5-12）：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；電子天平（BSA224S-CW）：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（XMTD-7000）：北京市永光明醫(yī)療器械有限公司；循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-D）：河南省予華儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雞皮明膠提取工藝流程和計(jì)算公式

新鮮雞皮→乙醚脫脂→堿液浸泡→水浴提膠→過(guò)濾→分液→濃縮→干燥→明膠

雞皮明膠提取率的計(jì)算公式：

式中：G1為脫脂后雞皮的重量，g；G2為冷凍干燥后得到明膠的重量，g。

1.3.1.1 前處理

新鮮雞皮進(jìn)行清洗、分裝、-18℃凍藏。

1.3.1.2 脫脂處理

新鮮雞皮經(jīng)過(guò)冷凍處理后達(dá)到一定的硬度，用切片機(jī)切成2cm×3cm的片狀，然后稱取適量置于2000mL的大燒杯中，按1∶2（g/mL）加入乙醚溶液，在4℃下放置24 h，然后在通風(fēng)廚中進(jìn)行過(guò)濾。

1.3.1.3 堿液浸泡

分別稱取30 g脫脂雞皮置于15個(gè)500 mL高型燒杯中，按 1∶6（g/mL）加入 NaOH 溶液 180 mL，每隔6 h～8 h換一次溶液，在一定時(shí)間內(nèi)更換4～5次，以除去礦物質(zhì)，經(jīng)處理后的皮料呈現(xiàn)出白色，體積溶脹膨大且彈性很好。最后用自來(lái)水清洗至濾液呈中性。

1.3.1.4 水浴提膠

每個(gè)燒杯內(nèi)按料液比1∶2（g/mL）加入蒸餾水60 mL，置于水浴鍋中進(jìn)行水浴提膠。

1.3.1.5 過(guò)濾、分液、濃縮、干燥

水浴之后用4層紗布過(guò)濾，用分液漏斗對(duì)濾液進(jìn)行分液處理，將明膠粗提液倒入分液漏斗中靜置，除去膠液上層的脂肪，下層膠液倒入燒杯中置于恒溫水浴鍋中，防止室溫過(guò)低導(dǎo)致凝膠。將提取液放進(jìn)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行濃縮除去部分水分，再把凝膠后的產(chǎn)品放入真空冷凍干燥機(jī)將其含水量降到一定程度，得到成品明膠，按公式（1）計(jì)算明膠的提取率。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)的基本條件設(shè)定為NaOH濃度0.05 mol/L，浸堿料液比為 1 ∶6（g/mL），浸堿時(shí)間為24 h，水提料液比為 1∶2（g/mL），提膠溫度為 65 ℃，提膠時(shí)間為2 h。將這些條件中的一個(gè)變化，保持其它的條件不變以分析堿濃度、浸堿時(shí)間、提膠溫度、提膠時(shí)間對(duì)提取率的影響。各因素梯度分別為NaOH濃度：0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mol/L；浸堿時(shí)間：12、18、24、30、36 h；提膠溫度：45、55、65、75、85 ℃；提膠時(shí)間：1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。每個(gè)試驗(yàn)做 3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.3 明膠提取的響應(yīng)面試驗(yàn)

采用響應(yīng)面分析方法對(duì)單因素試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。依照單因素試驗(yàn)，本試驗(yàn)采用NaOH濃度、浸堿時(shí)間、提膠溫度和提膠時(shí)間進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)，以雞皮明膠提取率為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.05軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 堿液濃度對(duì)雞皮提取率的影響規(guī)律研究

堿液濃度對(duì)雞皮明膠提取率的影響規(guī)律如圖1所示。

圖1 堿液濃度對(duì)明膠提取率的影響Fig.1 The influence of alkali concentration on gelatin extraction yield

由圖1可以看出隨著NaOH溶液濃度的增加，明膠的提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。堿能夠結(jié)合膠原蛋白分子的酸性集團(tuán)，斷裂分子內(nèi)或分子間的離子鍵和氫鍵，釋放原膠原分子，使原料體積膨脹，組織松散，以利于熱水提交[3，12]。隨著NaOH溶液濃度的增加，膠原蛋白分子內(nèi)和分子間的離子鍵和氫鍵斷裂，釋放越來(lái)越多原膠原分子，雞皮明膠的提取率增大，當(dāng)NaOH溶液濃度達(dá)到0.05 mol/L時(shí)，雞皮明膠提取率達(dá)到最大，NaOH溶液濃度再增加，雞皮明膠的提取率就隨之降低，這是因?yàn)镹aOH溶液濃度過(guò)大，導(dǎo)致膠原過(guò)度水解，大分子亞基發(fā)生次級(jí)降解，致使提取率降低。因此，選取0.05 mol/L作為NaOH溶液的最佳濃度。

2.1.2 浸堿時(shí)間對(duì)雞皮明提取率的影響規(guī)律研究

浸堿時(shí)間對(duì)雞皮明膠提取率的影響規(guī)律如圖2所示。

圖2 浸堿時(shí)間對(duì)明膠提取率的影響Fig.2 The influence of alkali treatment time on gelatin extraction yield

由圖2可以看出隨著浸堿時(shí)間的增加，明膠的凝膠強(qiáng)度呈先上升后降低的趨勢(shì)，當(dāng)浸堿時(shí)間為24 h時(shí)，明膠提取率達(dá)到峰值。浸堿時(shí)間太短，不能夠破壞膠原分子中非共價(jià)交聯(lián)鍵，進(jìn)而不能松散膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)、破壞非螺旋結(jié)晶區(qū)，不利于后期熱處理過(guò)程中膠原大分子亞基的釋放，導(dǎo)致明膠的產(chǎn)率較低[13]。增加到24 h時(shí)，膠原亞基分子能夠最大限度的得到釋放，從而使其提取率達(dá)到最大值。浸堿時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，雞皮會(huì)過(guò)度膨脹而融化，降低明膠的提取率[14]。因此，最佳浸堿時(shí)間為24 h。

2.1.3 提膠溫度對(duì)雞皮明膠提取率的影響規(guī)律研究

提膠溫度對(duì)雞皮明膠提取率的影響規(guī)律如圖3所示。

圖3 提膠溫度對(duì)明膠提取率的影響Fig.3 The influence of extraction temperature on gelatin extraction yield

由圖3可以看出，在45℃下提膠2 h提取率為3.11%，當(dāng)溫度升至65℃，提取率增加至13.25%，繼續(xù)升溫，提取率持續(xù)下降。熱處理明膠化的膠原，可以使膠原中部分共價(jià)鍵和氫鍵斷裂，三螺旋結(jié)構(gòu)解體，釋放出亞基組分、高分子聚集體及被降解的小分子組合，形成可溶性明膠[15-16]。溫度過(guò)低，只能破壞部分氫鍵、分子間靜電等作用力，使少數(shù)膠原螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解體，明膠大分子亞基組分無(wú)法有效溶出，導(dǎo)致提取率過(guò)低；適當(dāng)升溫，能使膠原化學(xué)鍵的破壞力度達(dá)到最大，不溶性膠原向可溶性明膠轉(zhuǎn)變，釋放最多的大分子亞基，特別是α組分，使提取率達(dá)到最大；溫度過(guò)高，導(dǎo)致膠原解體過(guò)度，大分子亞基發(fā)生次級(jí)降解，致使提取率降低[3，17-19]。所以，選取65℃為最佳提膠溫度。

2.1.4 提膠時(shí)間對(duì)雞皮明膠提取率的影響規(guī)律研究

提膠時(shí)間對(duì)雞皮明膠提取率的影響規(guī)律如圖4所示。

圖4 提膠時(shí)間對(duì)明膠提取率的影響Fig.4 The influence of extraction time on gelatin extraction yield

由圖4可知，在65℃下，當(dāng)提取時(shí)間由1 h增加到2 h，提取率由8.20%提高到13.25%，時(shí)間再延長(zhǎng)，提取率反而下降。在熱處理過(guò)程中，膠原蛋白的氫鍵和部分共價(jià)鍵斷裂，三螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成無(wú)規(guī)則線團(tuán)，膠原蛋白轉(zhuǎn)變成明膠[20]。在提膠初始階段，膠原螺旋解體，溶液中的膠原分子增加，提取率提高，水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，膠原結(jié)構(gòu)遭受過(guò)度破壞，膠原分子水解為小分子片段，提取率降低。故選取2 h為最佳提膠時(shí)間。

2.2 雞皮明膠凝膠強(qiáng)度最佳提取工藝條件的研究

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，以A堿濃度、B浸堿時(shí)間、C提膠溫度和D提膠時(shí)間為自變量，以所得明膠的提取率為響應(yīng)值（Y）設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，因素及水平表見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2。

對(duì)雞皮明膠凝膠強(qiáng)度的最佳提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，具體試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，運(yùn)用Design Expert 8.05數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表3。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 The response surface test factors and levels

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The response surface experimental design and result

經(jīng)過(guò)二次多元回歸擬合得到堿液濃度、浸堿時(shí)間、提膠溫度和提膠時(shí)間對(duì)明膠提取率的二次多項(xiàng)回歸模型如下：

表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Variance analysis and significance test of regression model

對(duì)此模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。該模型方程極顯著（P 值＜0.0001），校正決定系數(shù) R2=0.957 6，失擬項(xiàng)P值為0.308 9＞0.05，說(shuō)明該回歸方程與真實(shí)情況相似度較高，能較好地反映出明膠提取率與堿液濃度、浸堿時(shí)間、提膠溫度、提膠時(shí)間之間的關(guān)系。因此，利用該模型分析和預(yù)測(cè)在這4種條件下對(duì)明膠提取率的影響是可行的。由F值檢驗(yàn)可知各因素對(duì)明膠提取率的影響大小順序?yàn)椋篊>D>B>A，即為提膠溫度＞提膠時(shí)間＞浸堿時(shí)間＞堿液濃度。顯著性分析表明，堿液濃度對(duì)明膠提取率的影響不顯著（P＞0.05），浸堿時(shí)間和提膠時(shí)間對(duì)明膠提取率的影響顯著（P＜0.05），提膠溫度對(duì)明膠提取率的影響極其顯著（P＜0.01）。各交互作用及各平方項(xiàng)對(duì)明膠提取率均不顯著（P＞0.05）。由此可以看出各具體試驗(yàn)因素是簡(jiǎn)單線性影響的響應(yīng)值。去掉不顯著項(xiàng)得到優(yōu)化后的模型如下：

2.3 響應(yīng)曲面分析

雞皮明膠純堿法提取工藝中堿液濃度、浸堿時(shí)間、提膠溫度和提膠時(shí)間4個(gè)因素之間交互作用對(duì)明膠提取率的影響如圖5所示。

圖5 各因素對(duì)明膠提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface and contour of various factors

由圖 5 中 a、b、c、d、e 和 f的等高線可以看出，每?jī)蓚€(gè)因素的等高線均趨向圓形，表明4個(gè)因素間交互作用影響不顯著，這與表3中回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。由圖5a、5b和5c可知，隨著堿液濃度，明膠提取率先減小后增加；由圖5a、5d和5e可知，隨著浸堿時(shí)間的增加，明膠的提取率增加；由圖5b、5d和5f看出，隨著提膠溫度的升高，明膠提取率先增加后減??；由圖5c、5e和5f可得，隨著提膠時(shí)間的延長(zhǎng)，明膠提取率先上升后下降。其中浸堿時(shí)間、提膠溫度和提膠時(shí)間對(duì)明膠提取率的影響均比較顯著，與方差分析的結(jié)果一致。

2.4 最優(yōu)值的確定和回歸模型的驗(yàn)證

通過(guò)Design Expert 8.05軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，得出雞皮明膠的最佳提取工藝為：NaOH濃度0.07 mol/L，浸堿時(shí)間30.00 h，提膠溫度65.00℃，提膠時(shí)間為2.00 h。在此試驗(yàn)條件下預(yù)測(cè)所得明膠提取率的最大理論值為12.03%。在上述最優(yōu)條件下進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示雞皮明膠的提取率為（12.03±0.47）%，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值差異性不顯著，證明該模型得到的工藝參數(shù)可行。

3 結(jié)論

1）本研究采用純堿法通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken中心組合試驗(yàn)對(duì)雞皮明膠的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，得到雞皮明膠的最佳提取工藝條件為NaOH濃度0.07 mol/L，浸堿時(shí)間30.00 h，提膠溫度65.00℃，提膠時(shí)間為2.00 h，得到明膠的最大提取率為12.03%。

2）純堿法提取雞皮明膠是一種新的方法，所得明膠的性質(zhì)還需進(jìn)一步深入探索，為獲得優(yōu)質(zhì)雞皮明膠的提取方法提供理論依據(jù)。

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