超聲輔助凍結(jié)中國對蝦的冰晶狀態(tài)與其水分變化的影響研究

向迎春，黃佳奇，欒蘭蘭，余海霞，楊水兵，楊志堅，胡亞芹，，*

（1.浙江大學(xué)食品與營養(yǎng)系，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點實驗室，馥莉食品研究院，浙江杭州310058；2.浙江大學(xué)舟山海洋研究中心，浙江舟山316021）

從冰結(jié)晶理論來研究，水產(chǎn)品凍藏指在低溫貯藏時水產(chǎn)品組織內(nèi)水分從液態(tài)轉(zhuǎn)變成固態(tài)的相變過程[1]。大氣壓的作用下，組織內(nèi)水分在低于冰點以下開始結(jié)晶，液態(tài)到固態(tài)的轉(zhuǎn)變引起體積增大，冰晶體對組織肌細胞膜等造成機械擠壓及損傷，進而引起水產(chǎn)品凍結(jié)貯藏過程中發(fā)生一系列物理化學(xué)性質(zhì)的改變。因此，研究水產(chǎn)品凍結(jié)過程中冰晶體的成核、生長過程及其生長分布規(guī)律，分析其與組織水分變化間的關(guān)系，將有助于進一步闡明冷凍水產(chǎn)品品質(zhì)變化的原因，從而采取相應(yīng)措施提高其在凍藏過程中的品質(zhì)。

目前，人們常采用傳統(tǒng)的冰箱對水產(chǎn)品進行凍藏保鮮，此方法得到廣泛應(yīng)用。為了提高熱轉(zhuǎn)移速率，人們也使用浸漬方式凍結(jié)，對于批量處理凍品，此方法能使冷凍食品溫度快速均一地下降。對食品進行超聲處理作為一種新型的加工技術(shù)，已被廣泛地應(yīng)用于食品加工的各個操作單元。其中，將低頻超聲波作用于浸漬冷凍過程，其形成的空化氣泡通過移動和破裂可以誘導(dǎo)水分初次成核發(fā)生。此外，低頻超聲波還能促使已存在的冰晶發(fā)生斷裂，形成均勻分布的小冰晶，從而促使二次成核發(fā)生[2]。關(guān)于冷凍過程采用低頻超聲波誘導(dǎo)不同物料中水分成核（包括初次成核和二次成核）在國內(nèi)外已有報道[3-6]。此外，據(jù)報道，低頻高強度超聲波能改善冷凍過程中的傳熱效率，提高冷凍速度，防止大冰晶的生成，起到改善食品品質(zhì)的作用[7]。也有研究表明，超聲波能殺害食品中的部分微生物[8]，因此采用超聲輔助凍結(jié)以保持食品的新鮮度具有廣闊的應(yīng)用前景。如今對高強度功率超聲的研究主要集中在水果蔬菜的保鮮上，并證實具有較好的保鮮效果，而對超聲輔助處理水產(chǎn)品的研究較少。水產(chǎn)品因其特殊的生理特性是食品領(lǐng)域中應(yīng)用冷凍保藏最多的產(chǎn)品，傳統(tǒng)冰箱凍結(jié)速度慢，形成冰晶大，對魚蝦蟹等品質(zhì)影響較大。浸漬凍結(jié)雖傳熱快，但也會形成一定大小的冰晶破壞組織。而若采用超聲輔助處理，能促使凍結(jié)的過程中形成小冰晶，對組織破壞較小，延緩凍品品質(zhì)敗壞，更長時間保持其新鮮度，其潛在的應(yīng)用價值巨大。

水分變化作為新鮮水產(chǎn)品品質(zhì)變化的直接影響因素，決定著產(chǎn)品的品質(zhì)及經(jīng)濟價值。但是凍結(jié)過程中冰晶的形成與水分變化間的關(guān)系，它們是如何相互影響的還有待闡明。

中國對蝦又名明蝦，因其高蛋白、低脂肪、口感鮮美的特性深受消費者喜愛。但是其特殊的生理結(jié)構(gòu)，使蝦在打撈后不易存活，組織腐敗極快，需采用特殊的貯藏方式延長其貨架期。本研究以最常見的明蝦為例，通過觀察其在超聲輔助凍結(jié)及浸漬凍結(jié)、傳統(tǒng)冰箱凍結(jié)過程中的組織冰晶變化，綜合其水分變化，探究冰晶形成與水分變化的相關(guān)性，對驗證冰晶對凍品品質(zhì)的影響具有科學(xué)指導(dǎo)意義，以期為明蝦的冷凍加工提供提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活中國對蝦：駱家莊農(nóng)貿(mào)市場，選取個體重約（12±2）g，體表無損傷的活蝦。保氧活體運回浙江大學(xué)食品加工研究所水產(chǎn)品資源利用與開發(fā)實驗室后，進行不同條件的凍結(jié)處理。

乙醇、氨水、鹽酸、蘇木精伊紅染液：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；OCT包埋劑：美國櫻花OCT有限公司；低溫粘著膜：Leica Biosystems公司。

1.2 儀器與設(shè)備

低溫恒溫超聲機（定制）：寧波新芝生物科技股份有限公司；BS223S電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；HH-1數(shù)顯攪拌恒溫水浴鍋：金壇市科杰儀器廠；Data Trace RF無線實時溫度傳感器：Mesa Laboratories公司；TGL20M臺式低速冷凍離心機：湖南凱達科學(xué)儀器有限公司；MDF-382E（N）三洋超低溫冰箱：日本三洋電機株式會社；MODEL UB200i顯微鏡：重慶澳浦光電技術(shù)有限公司；CryoStar NX50冰凍切片機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 預(yù)處理

凍結(jié)曲線的測定：將熱電偶探頭插入蝦體中心部位固定，分別將插入熱電偶的蝦每5只為一平行并排放入塑料袋真空包裝。分別放入-20℃冰箱、-20℃低溫恒溫超聲機（不開啟超聲）及-20℃低溫恒溫超聲機中，待其溫度降至-20℃停止超聲，記錄其溫度變化的情況。

樣品沖洗快速瀝干表面水，每5只作為一組平行真空包裝，放入恒溫槽預(yù)冷至0℃。

超聲輔助凍結(jié)（UF）：超聲速凍機設(shè)置參數(shù)為頻率45 kHz，功率180 W，開關(guān)5S ON/3S OFF，預(yù)冷的樣品放入-20℃裝有50%乙醇溶液的超聲恒溫槽中開啟超聲。分別在超聲UF2組39 s（-2℃），UF3組169 s（-6℃），UF4組446s（-20℃）時及UF5組446s（-20℃）停止超聲并放置恒溫槽1 d時各取出兩組置于液氮保溫瓶終止其組織變化。

浸漬凍結(jié)（IF）：樣品置于超聲恒溫槽中，不開啟超聲，待溫度達到IF2組45 s（-2℃），IF3組 251 s（-6℃），IF4組 676 s（-20℃）時及 IF5組 676 s（-20℃）再放置恒溫槽1 d時各取出兩組置于液氮保溫瓶終止其組織變化。

冰箱凍結(jié)（RF）：樣品置于-20℃冰箱，待溫度達到RF2組 310 s（-2 ℃），RF3組 3 786 s（-6 ℃），RF4組9 101 s（-20℃）時及 RF5組9 101 s（-20℃）再放置1 d時各取出兩組置于液氮保溫瓶終止其組織變化。

其中UF1組、IF1組、RF1組為未凍結(jié)時的新鮮對照樣。以上3種預(yù)凍處理的樣品液氮處理后均放置于-80℃冰箱保存待用。

1.4 冰晶形態(tài)分析（光鏡觀察）

1.4.1 肉樣固定、切片、染色及觀察[9]

1）將切蝦肉的刀具預(yù)冷到-20℃，砧板四周撒上干冰盡量減少蝦肉的受溫度的影響，預(yù)凍結(jié)好的蝦肉取第二節(jié)切成5 mm×3 mm×3 mm的立方體，3 mm×3 mm的橫切面朝下浸入OCT包埋盒，放入液氮中迅速凝固包埋劑。

2）冷凍切片機切下6 μm的樣品，用低溫粘著膜吸附。

3）70%乙醇固定2 min，水洗；蘇木素染色1 min，水洗；1%鹽酸酒精溶液分化2 s，水洗5 min；氨水反藍30 s，水洗；伊紅染色3 min，水洗；貼于載玻片上封片。

4）制作好的切片在光鏡下觀察，選取適當(dāng)放大的區(qū)域進行拍照，圖片用ImageJ進行分析。每個平行組，選取100個以上有效冰晶進行分析。

1.4.2 面積（Cross-section Area of ice crystal or fiber muscle）[10-11]

標(biāo)定像素與實際尺寸間的轉(zhuǎn)換，利用閥值選出冰晶間隙區(qū)域，直接得出平均孔徑面積及總面積。

1.4.3 當(dāng)量直徑（Equivalent diameter）

與研究對象具有相等面積圓的直徑。

式中：A為孔徑平均面積，μm2。

1.4.4 圓度（Roundness，R）

表示冰晶橫截面接近于圓的程度。

式中：p為周長，R值介于0和1之間，值越大，對象越圓。

1.4.5 長度（Elongation）

冰晶橫截面長軸長與短軸長的比值。其中，當(dāng)長度為1時，對象是圓形或正方形；長度越大于1，對象越長。

1.5 解凍失水率測定[12]

稱取預(yù)處理好的凍蝦質(zhì)量，然后放入4℃冰箱自然解凍后用濾紙吸干表面水分稱重。

式中：W1為解凍前樣品質(zhì)量；W2為解凍后樣品質(zhì)量。

1.6 持水性測定[13]

水分含量：將2 g切碎樣品平鋪于水分測定儀，調(diào)節(jié)溫度到105℃直至完全干燥，讀取數(shù)據(jù)。

采用熱離心法進行測定，取5 g蝦肉置于離心管中，70℃水浴20 min，低速5 000 r/min離心3 min，倒掉水分，稱重。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

冷凍切片用帶攝像機的顯微鏡拍照，用image J計算白色區(qū)域的孔徑面積，相當(dāng)直徑，圓度，拉伸度。采用origin9.0和SPSS12.0進行數(shù)據(jù)處理及Person分析，不同處理間的比較采用顯著差異法（LSD），顯著性p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍結(jié)曲線

一般來講，凍結(jié)速度影響著凍品的品質(zhì)，凍結(jié)速度越快，凍品品質(zhì)相對越好，明蝦凍結(jié)曲線見圖1。

如圖1所示為明蝦在超聲輔助凍結(jié)（UF）、乙醇浸漬凍結(jié)（IF）及冰箱空氣凍結(jié)（RF）過程中的凍結(jié)曲線。蝦體預(yù)冷到0℃后放入對應(yīng)冷凍設(shè)備開始凍結(jié)。從圖1中可以看出，蝦體溫度不斷下降，開始階段下降十分迅速，接近冰點時溫度下降緩慢，經(jīng)過-2℃時蝦肉凍結(jié)曲線出現(xiàn)第1個拐點，即為蝦肉的凍結(jié)點。在經(jīng)過-6℃時，超聲輔助凍結(jié)出現(xiàn)第2個拐點，在兩拐點之間經(jīng)過的時間為冰晶大量生成經(jīng)過的時間[14]。從通過最大冰晶生成帶的時間長短可以評價凍品凍結(jié)過程中的凍結(jié)速度快慢，從而評價形成冰晶的大小及對組織變化的影響。從圖中可以看出不同凍結(jié)方式通過最大冰晶生成帶的時間分別為超聲130s，浸漬206s，冰箱3476s。其中，超聲輔助凍結(jié)最快，比浸漬凍結(jié)提前76 s通過，比冰箱空氣凍結(jié)提前3 146 s通過。林婉玲等[15]對凡納濱對蝦的研究有類似結(jié)果。凍結(jié)速度越快，組織內(nèi)冰晶形成越細小，蝦體組織內(nèi)破壞越小，組織品質(zhì)變化越小。此結(jié)果與李杰等[16]研究的南極磷蝦、凡納濱對蝦、日本沼蝦及秀麗白蝦的凍結(jié)曲線有明顯的差別，這可能與蝦品種及凍結(jié)處理條件不同有極大關(guān)系。

圖1 明蝦凍結(jié)曲線Fig.1 Freezing curve of Penaeus chinensis

2.2 冷凍組織切片圖

超聲、浸漬和冰箱3種凍結(jié)過程中，達到不同溫度時組織形態(tài)的變化情況見圖2。

圖2 -20℃條件下超聲凍結(jié)與浸漬凍結(jié)、冰箱凍結(jié)組織形態(tài)變化對比（200倍）Fig.2 Changes of morphological with different freezing tissues（200 times）

用低溫粘著膜輔助制作的冷凍切片組織清晰，冰晶孔徑完好[17]。蝦肉在4℃未開始結(jié)冰前，肌肉組織規(guī)則致密，HE染色后能看見清晰的組織紋路，細胞核大量分布在組織細胞內(nèi)部。除了微小的白色結(jié)締間隙外看不到其它明顯的間隙。經(jīng)過冷凍的組織變化明顯，3種處理方式下的冷凍組織均受到一定程度的破壞。-2℃時，組織出現(xiàn)極少量的冰晶孔洞。理論上有大量晶核形成，但是冰晶形成不明顯，對組織幾乎沒有破壞作用。各凍結(jié)組之間看不出明顯的差別。隨著凍結(jié)溫度的降低，冰晶逐漸形成，在-6℃時有大量冰晶生成，此時各對照組冰晶均相對細小圓潤。超聲形成的冰晶相對細小均一，而浸漬凍結(jié)其次，冰箱凍結(jié)形成冰晶數(shù)量較少但是孔徑大。當(dāng)溫度達到-20℃時組織冰晶數(shù)量增長趨于平緩，超聲凍結(jié)組織冰晶形成相對多而細小均勻。當(dāng)在-20℃貯藏1 d后可以看出，不同凍結(jié)處理方式對組織微觀結(jié)構(gòu)的影響有明顯差異，超聲輔助凍結(jié)組織結(jié)構(gòu)相對致密，品質(zhì)最好；冰箱凍結(jié)處理的組織冰晶引起間隙最大，對細胞的破壞最嚴(yán)重，進而引起了組織冰晶的進一步長大。不同凍結(jié)過程中冰晶總面積見圖3，不同凍結(jié)過程中冰晶的面積、直徑、圓度、拉伸度對比見圖4。

由圖4可知，未凍結(jié)的組織白色間隙面積范圍為（119±8）μm2，相對直徑范圍為（12±1）μm，周長為（47±0.5）μm，圓度為 0.68，長度為 1.09。

圖3 不同凍結(jié)過程中冰晶總面積（200倍）Fig.3 Total area of ice in different freezing（200 times）

圖4 不同凍結(jié)過程中冰晶信息的對比Fig.4 The comparison of ice crystals information in different freezing processes

從以圖4中可以看出圖a，b，c有顯著上升趨勢，其變化趨勢相近，呈顯著相關(guān)。其中，-2℃時面積、直徑、周長增長相對平緩，-6℃時其值急速增大，之后增長速度又相對減慢，但是比0℃到-2℃間的變化大。因此，可以看出明蝦在不同凍結(jié)過程中-2℃到-6℃面積、直徑、周長變化最大，此時明蝦凍結(jié)通過最大冰晶生成帶，凍結(jié)速率減慢，大量冰晶形成。而-6℃到-20℃期間已形成的冰晶吸附周圍的未凍結(jié)水或水蒸氣，使冰晶逐漸長大。另外，在3種凍結(jié)方式中超聲輔助凍結(jié)增長趨勢始終小于浸漬凍結(jié)，其次小于冰箱凍結(jié)，且超聲凍結(jié)在整個凍結(jié)過程中形成更小面積更小周長的冰晶，對組織影響最小。超聲凍結(jié)組織冰晶最終直徑僅 46.81 μm，而浸漬凍結(jié)達 57.35 μm，冰箱凍結(jié)達67.58 μm，此結(jié)果與黃鴻兵[18]研究的豬肉凍藏后的冰晶直徑在相似的范圍內(nèi)但略小。在-2℃到-6℃的過程中，冰箱和浸漬的圓度降低而超聲的圓度相對呈增長趨勢，這可能是超聲凍結(jié)過程中超聲作用導(dǎo)致大量晶核形成，而機械力對冰晶的圓度有一定破壞。在-6℃到-20℃的過程中超聲凍結(jié)圓度平緩增長而冰箱和浸漬凍結(jié)圓度呈不規(guī)則變化。這可能與超聲作用力對已形成冰晶的破壞有關(guān)。長度在凍結(jié)過程中，超聲凍結(jié)在最大冰晶生成帶結(jié)束前變化極小，之后急劇增大。浸漬凍結(jié)也有相同趨勢，但是相對變化較小。而冰箱凍趨勢變化平緩，在-2℃以后呈現(xiàn)平緩趨勢，說明冰箱凍結(jié)過程中冰晶的長寬比受冰晶的增長影響不大。而超聲凍結(jié)在大量冰晶形成后超聲的空化作用及機械力對冰晶的破壞導(dǎo)致了冰晶長度的增加。超聲輔助凍結(jié)組織優(yōu)于浸漬和冰箱凍結(jié)，此研究結(jié)果與Xu等[19]研究研究的紅心蘿卜有類似結(jié)果。Islam等[20]也研究表明超聲輔助冷凍蘑菇其形成的冰晶相對對照組更加細小。

2.3 凍結(jié)過程中中國對蝦失水率與持水性變化

肌肉中的水分為結(jié)合水和自由水，占主要部分的自由水集中在結(jié)締組織與肌原纖維之間的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，另一部分結(jié)合水存在于組織蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、糖類的羧基、氨基、羥基等結(jié)構(gòu)中使其相互間緊密結(jié)合。常采用失水性來衡量冷凍水產(chǎn)品組織水分的變化。組織中的水分流失直接影響著產(chǎn)品的質(zhì)地、性狀及品質(zhì)。過多的汁液流失引起可溶性營養(yǎng)素、風(fēng)味物質(zhì)、重量的降低，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)變得干柴、多筋。失水性的增大也直接導(dǎo)致產(chǎn)品感官品質(zhì)下降，促進組織內(nèi)微生物的生長。凍結(jié)過程中，組織內(nèi)的水分逐漸凍結(jié)成冰晶，小粒冰晶不斷升華，數(shù)量減少，大粒冰晶變成更大的冰晶，這些冰晶長大，造成肌肉組織結(jié)構(gòu)破壞，進而促使組織持水性下降[21]，不同凍結(jié)方式對解凍失水性的影響見圖5。

由圖5可知，隨著凍結(jié)時間的延長，明蝦的失水性逐漸增大，且超聲凍結(jié)處理的明蝦失水率明顯較浸漬和冰箱凍結(jié)失水率同期值低。而冰箱凍結(jié)失水率增加最快，相比于浸漬、超聲凍結(jié)失水性最大。冰箱失水性增大趨勢明顯大于超聲凍結(jié)，這應(yīng)該與冰箱凍結(jié)速度低于超聲凍結(jié)有關(guān)。超聲輔助凍結(jié)形成冰晶細小，對組織破壞較小，因此相應(yīng)解凍失水性相對冰箱凍結(jié)較小?？赡茉蚴瞧胀ū鋬鼋Y(jié)速度緩慢，生成的冰晶體較大，因而與空氣接觸的面積大，水分散失加快，從而導(dǎo)致其持水力值低。Kaale等[22-23]對三文魚的研究也表明凍結(jié)速度越快，形成的冰晶越細小，失水性相對較小。胡亞芹等[24]在對帶魚的不同凍結(jié)方式中也得到相似結(jié)論。浸漬凍結(jié)相對傳統(tǒng)冰箱凍結(jié)熱交換快，能夠促進溫度平衡，達到組織快速結(jié)冰，形成較均一的冰晶。但是超聲輔助凍結(jié)能進一步促進晶核的形成以及破碎已形成的冰晶，從而減少大冰晶對組織的機械損傷。

圖5 不同凍結(jié)方式對解凍失水性的影響Fig.5 The effects of water loss in different freezing

持水性決定著凍品組織的狀態(tài)，是判斷食品性狀的一個重要因素，其影響著水產(chǎn)品在貯藏運輸過程中的質(zhì)量變化、解凍后的汁液流失、烹飪時的重量變化以及肉的嫩度及多汁性。從而影響著產(chǎn)品的品質(zhì)及經(jīng)濟效益。

持水性與質(zhì)構(gòu)特性密切相關(guān)，組織在貯藏過程中的持水性下降，引起肌絲晶格收縮，肌球蛋白變性，胞內(nèi)間隙增加，不同凍結(jié)方式對持水性的影響見圖6。

圖6 不同凍結(jié)方式對持水性的影響Fig.6 The effects of water holding capacity in different freezing

從圖6中可以看出，隨著時間的延長，3種凍結(jié)處理的明蝦持水性都依次降低，但是超聲凍結(jié)持水性減小明顯低于浸漬及冰箱凍結(jié)。冰箱凍結(jié)持水性在-20℃時下降最快，可能由于冰箱凍結(jié)相對超聲凍結(jié)冰晶個體大，對組織損傷大，從而對細胞破壞更大，使持水性下降。與Kaale等[12，25]對三文魚的研究有類似結(jié)果。冰晶形成直觀影響著明蝦肌體水分的遷移變化。

2.4 凍結(jié)過程中明蝦水分變化與冰晶形態(tài)的相關(guān)性分析

將不同凍結(jié)處理過程中冰晶的相關(guān)指標(biāo)與失水性進行pearson相關(guān)性分析，如表1所示。

表1 凍結(jié)過程中明蝦失水性與冰晶形態(tài)的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 1 The Pearson correlation coefficient of the water loss and the morphology of ice crystals of the penaeus chinensis in the freezing process

失水性與不同凍結(jié)過程中冰晶的面積、直徑以及周長呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均在0.9以上。超聲凍結(jié)與圓度呈顯著相關(guān)性（p＜0.05），而冰晶的圓度和長度與失水性沒有顯著相關(guān)性。說明冰晶對組織的破壞主要取決于冰晶的面積、直徑及周長，其中直徑和周長對組織影響最大。

將不同凍結(jié)處理過程中冰晶的相關(guān)指標(biāo)與持水性進行pearson相關(guān)性分析，如表2所示。

表2 凍結(jié)過程中明蝦持水性與冰晶形態(tài)的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 2 The Pearson correlation coefficient of the water holding capacity and the morphology of ice crystals of the penaeus chinensis in the freezing process

持水性與冰晶的面積、直徑以及周長呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），而除了超聲凍結(jié)的圓度和長度與失水性有相關(guān)性外，其它凍結(jié)方式均沒有顯著相關(guān)性。

3 結(jié)論

在超聲輔助、浸漬、冰箱3種不同凍結(jié)方式中，超聲輔助凍結(jié)能最快通過最大冰晶生成帶；凍結(jié)過程中的組織切片圖可以看出超聲輔助凍結(jié)過程中組織冰晶形成細小，組織的影響最??；凍結(jié)完成時，與浸漬或冰箱凍結(jié)相比，超聲處理組持水性高7.19%～19.50%，失水性低1.30%～2.38%；明蝦組織切片中冰晶面積直徑、周長的變化趨勢與解凍失水性、持水性變化呈極顯著相關(guān)。因此，超聲輔助凍結(jié)明蝦可以有效提高凍結(jié)速率，減少水分變化，更好維持蝦肉品質(zhì)。為超聲輔助凍結(jié)水產(chǎn)品提供了參考，在以后的研究中可以進一步探索超聲凍結(jié)的其它優(yōu)勢。

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