間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性及應(yīng)用

弓勛 綜述；云升 審校

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 干細胞研究中心，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010010）

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell, MSC）是一類多能干細胞，最初被發(fā)現(xiàn)于20世紀50年代，研究發(fā)現(xiàn)其來源于發(fā)育早期中胚層，其具有高度自我更新的能力以及向多種細胞分化的潛能，是人類和小鼠骨髓單層細胞培養(yǎng)中存活時間最長的細胞[1-3]，通過研究表明，它們可以在體外和體內(nèi)通過不同方式誘導(dǎo)分化為脂肪組織細胞、軟骨組織細胞、結(jié)締組織細胞和骨組織細胞及神經(jīng)干細胞。另外也有研究表明，MSC也可能被誘導(dǎo)分化為內(nèi)胚層細胞（肺細胞，肌細胞和腸上皮細胞）及外胚層細胞（上皮細胞和神經(jīng)元）[4-5]。基于其獨特的分化能力及低免疫原性，MSC在再生醫(yī)學(xué)、疾病的臨床應(yīng)用治療中起到了很大的作用。本文通過對MSC的生物特性、不同來源MSC的形態(tài)、增殖、表面標(biāo)記物的比較及MSC在部分疾病的臨床應(yīng)用作簡要綜述。

1 生物特性

近年，因MSC被發(fā)現(xiàn)越來越廣泛的醫(yī)學(xué)價值，研究也越深入，目前的研究表明MSC可以從骨髓、臍帶血、臍帶、胎盤、動員外周血、脂肪組織、牙髓、甚至胎兒肝臟和肺組織體外培養(yǎng)擴增獲得[6]。MSC雖然來源多樣，但具有一些共同的特點：在顯微鏡下觀察呈成纖維細胞形態(tài)，常為梭形或紡錘形，其胞質(zhì)豐富，普遍具有貼壁生長特性，增殖率較高，表面均表達標(biāo)志物CD90、CD105、CD44、CD73、CD9和非常低水平的CD80，對造血細胞的表面標(biāo)志物包括CD34、CD45、CD11b、CD11c、CD14、CD19、CD79a、CD86 和 組 織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex,MHC）II類的表達均為陰性[7-9]。且其具有分泌胰島素樣生長因子、血管內(nèi)皮生長因子及肝細胞生長因子等的能力[10]，在特定條件下進行誘導(dǎo)分化可分化為骨細胞、軟骨細胞以及脂肪細胞，且其免疫原性較低，在異體之間行MSC移植后，也不易引起免疫排斥的反應(yīng)。隨著對MSC臨床治療的需要，國際間充質(zhì)及組織干細胞委員會對人來源的MSC提出了最低的鑒定標(biāo)準(zhǔn)： ①在標(biāo)準(zhǔn)條件下進行培養(yǎng)，須具有對塑料性質(zhì)底物的黏附特性；②通過流式細胞術(shù)檢測MSC的表面標(biāo)志物中CD105、CD73及CD90表達的陽性率應(yīng)≥95%，且 CD45、CD34、CD14或 CD11b、CD79a或CD19、人類白細胞抗原-DR（human leukocyte antigen-DR, HLA-DR）陰性表達率≥98%;③在體外通過標(biāo)準(zhǔn)方法進行誘導(dǎo)后，MSC須能誘導(dǎo)分化為成骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞等[9]。

2 不同來源MSC的比較

目前臨床應(yīng)用較多的為骨髓來源MSC（bone marrow-MSC, BM-MSC）、臍帶來源MSC（umbilical cord-MSC, UC-MSC）和臍血來源MSC（UCBMSC），不同來源MSC雖然具有一些共性，但也具有一些不同的特性。MSC最早被發(fā)現(xiàn)存在于骨髓中，但骨髓的采集為有創(chuàng)操作，這使得BMMSC的來源受到很大程度的限制，同時BM-MSC存在病毒感染的風(fēng)險，并且隨著采集者年齡的增長，其細胞數(shù)量、分化能力、擴增能力會出現(xiàn)明顯的下降趨勢。通過研究的不斷深入，在人臍帶及臍血中也發(fā)現(xiàn)MSC的存在，并且均具備向多種細胞分化的潛能及支持造血的能力[11]。筆者總結(jié)了下述幾點來比較這3種不同來源的MSC。

2.1 細胞形態(tài)比較

周敦華等[12]對BM-MSC和UCB-MSC分別在L-DMEM體系和MSC專用培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，結(jié)果表明這2種不同來源的MSC在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的細胞形態(tài)、集落數(shù)、集落大小均無顯著差異，但成人BM-MSC與UCB-MSC相比較，集落交錯融合時間更早，集落形成的更快。呂璐璐等[13]對比了BM-MSC和UC-MSC在倒置顯微鏡下的形態(tài)，可見2種不同來源的MSC在顯微鏡下均呈梭形、紡錘形，1周后則生長速度開始增快，形成形狀較均一的梭形細胞，呈旋渦形生長或平行排列的生長，二者形態(tài)相似。這表明3種不同來源MSC在集落形成或融合時間上可能存在差異，但通過培養(yǎng)傳代后細胞形態(tài)無顯著差異。

2.2 增殖特性比較

有研究表明，UC-MSC表現(xiàn)出更類似于胚胎干細胞的基因表達譜，并且較BM-MSC具有更快速的自我更新能力[14]，這使UC-MSC倍增的時間較BM-MSC的增殖時間明顯縮短，并且臍帶來源的P1代MSC倍增的時間并不隨著傳代次數(shù)的增加而延長，而骨髓來源的P1代MSC倍增時間傳代至P6代時明顯延長。這提示著，不同來源但數(shù)量相同的MSC在相同時間下擴增，UC-MSC可得到較BM-MSC數(shù)量更大的間充質(zhì)干細胞[13]。鄒葉青等[15]通過實驗對比UCB-MSC和BM-MSC增殖性表明，UCB-MSC培養(yǎng)的成功率低于BM-MSC，雖然在早期階段中UCB-MSC的增殖速率快于BM-MSC的增殖，但經(jīng)過長期培養(yǎng)UCB-MSC的總量少于BM-MSC的總量。周敦華等[12]在15 份臍血中僅有4份臍血培養(yǎng)出MSC。這一結(jié)論與Erices等[16]報道的臍血標(biāo)本中約1/4可體外培養(yǎng)出MSC的結(jié)論相符合。

因此，3種不同來源MSC相比較，UC-MSC增殖時間更短、增殖能力更強，UCB-MSC早期時具有較高的增殖性，但體外培養(yǎng)分化的成功率較 低。

2.3 表面標(biāo)志物比較

通過對細胞免疫表型研究分析顯示，UC-MSC的大多數(shù)免疫標(biāo)記物與 BM-MSC的表達相似，但是HLA-ABC和CD106的表達低于BM-MSC。而HLA分子可以引起MSC移植時的免疫排斥反應(yīng)，這就提示UC-MSC比BM-MSC具有更低的免疫原性。CD106是一類與造血干祖細胞的定位、遷移、增殖和分化有關(guān)的黏附分子。UC-MSC對CD106的低表達可能是UC-MSC 與BM-MSC的鑒別點之一[13]。通過流式儀分析UCB-MSC和BM-MSC表面標(biāo)志物的細胞百分率表明，這2種MSC雖然來源不同，但均表達CD29、CD44及CD105等細胞黏附分子的標(biāo)志物，而造血細胞標(biāo)志物CD13、CD14、CD34及CD45均為陰性，隨著細胞傳代的增加其免疫表型并未發(fā)生改變。這提示UCB-MSC與BM-MSC具有相同的細胞表面標(biāo)志物[17]。通過對這3類MSC免疫表型的分析提示，3種不同來源MSC免疫標(biāo)記物大多數(shù)表達相似，UC-MSC可能具有更低的免疫原性，CD106可能成為BMMSC與外周MSC鑒別點之一。

2.4 多向分化能力比較

有實驗對BM-MSC、UC-MSC及UCB-MSC多向分化能力進行比較，將3種不同來源MSC在特定條件下誘導(dǎo)成脂、成骨分化，對脂肪細胞通過油紅O染色進行鑒定、Vonkossa染色對成骨細胞鑒定，并通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反 應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）鑒定，表明3種不同來源MSC通過特定條件下進行誘導(dǎo)分化，均能誘導(dǎo)為脂肪細胞、成骨細胞，且分化能力無明顯差別[13, 15, 17]。

3 在臨床疾病的應(yīng)用

3.1 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的應(yīng)用

目前系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus, SLE）臨床最普遍的是應(yīng)用免疫抑制藥物進行治療，即皮質(zhì)類固醇和環(huán)磷酰胺[18]。但長期應(yīng)用該類藥物存在較多副作用，移植MSC成為一種新型治療方法。Wang[19]對16名難治性SLE患者移植UC-MSC，通過SLE疾病活動指數(shù)（SLE Disease Activity Index, SLEDAI）、 血 清 抗核抗體（antinuclear antibodies, ANA）、血清補體C3和C4、抗雙鏈DNA抗體（抗dsDNA）、腎功能及白蛋白水平的測量來評估移植前后病情變化，所有患者的臨床癥狀得到緩解，疾病的活動性均顯著降低，且未發(fā)現(xiàn)與治療有關(guān)的死亡。楊桂鮮等[20]對40例難治性SLE患者移植UC-MSC治療，并進行系統(tǒng)的臨床分析，通過在不同時間間隔分別對治療前及治療后進行SLEDAI評分并行實驗室化驗來對比MSC移植的影響，結(jié)果表明在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用MSC能夠更快地控制患者病情，療效更穩(wěn)定，復(fù)發(fā)率更低，且未發(fā)現(xiàn)與移植相關(guān)的并發(fā)癥。王治國等[21]通過實驗觀察BM-MSC對SLE小鼠的血清抗ds-DNA抗體、尿蛋白、腎臟組織的病理形態(tài)，以及小鼠末梢血液、脾臟、胸腺組織中CD4、CD25的表達和T細胞水平等指標(biāo)監(jiān)測治療效果，結(jié)果顯示：BM-MSC移植可改善SLE小鼠各器官的病理損傷，對SLE的實驗治療有效。綜上所述不同來源的MSC均可導(dǎo)致疾病活動性的降低，血清學(xué)的改變和促炎細胞因子的穩(wěn)定對SLE臨床癥狀的改善、疾病的治療具有一定的療效，且未出現(xiàn)與MSC相關(guān)的并發(fā)癥。

3.2 在肝纖維化中的應(yīng)用

肝纖維化是慢性肝臟疾病向肝硬化發(fā)展的中間過程，而肝星形細胞（hepatic stellate cell,HSC）的活化促進細胞外基質(zhì)生成，是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟。目前臨床上治療肝纖維化主要著重于病因治療，并從纖維化發(fā)生的各個路徑抑制纖維化的發(fā)生和發(fā)展，但長期應(yīng)用藥物治療價格昂貴，且易出現(xiàn)較多副反應(yīng)。Chen[22]通過實驗將BM-MSC與HSC進行共同培養(yǎng)后，通過測定HSC的增殖情況及α-平滑肌肌動蛋白（α smooth muscle actin, α-SMA）的表達水平判斷治療效果，結(jié)果表明，BM-MSC通過Notch信號級聯(lián)在體外直接調(diào)節(jié)HSC，從而抑制HSC的生成。施啟鵬等[23]對誘導(dǎo)肝纖維化的SD大鼠模型進行BM-MSC移植治療，并在治療后通過測定肝臟功能指標(biāo)，觀察肝臟組織纖維化的程度及肝臟炎癥發(fā)生的程度，肝組織內(nèi)的α-SMA、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）和COL I表達的水平，證明通過尾靜脈進行BM-MSC移植治療可以顯著改善肝纖維化大鼠的肝臟功能，并減輕肝纖維化的程度。郭圓圓等[24]進行實驗，對四氯化碳（CCL4）誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型靜脈注射間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基（MCS-CM），并進行病理分析及相關(guān)檢驗，證實MSC對肝纖維化具有治療作用，而其作用機制可能與MSC能夠抑制HSC的活化、降低TGF-β1的表達并促進膠原蛋白降解相關(guān)。

4 MSC的安全性與展望

基于MSC獨特的生物學(xué)特性，其在臨床應(yīng)用及治療中被寄予很大的希望，這也引發(fā)一系列關(guān)于人類使用體外培養(yǎng)擴增的MSC的安全性的問題。特別是它們在體外長期擴增時的遺傳穩(wěn)定性、冷凍保存時對MSC性質(zhì)的影響及MSC在實驗室制備中的質(zhì)量控制。MSC具有癌細胞的一些特征，包括壽命長、相對凋亡抗性和長時間復(fù)制能力。因此，MSC的致瘤性經(jīng)常被看作是MSC臨床應(yīng)用的主要障礙。Wang[25]通過食蟹猴模型進行MSC致瘤性研究，通過觀察模型的體重、生命體征、血液生化指標(biāo)、免疫功能、器官重量、組織病理學(xué)檢查，未發(fā)現(xiàn)與MSC相關(guān)的顯著變化。該研究結(jié)果表明MSC的移植不影響生命的一般健康。Centeno等[26]通過體外培養(yǎng)擴增MSC后注入339例患者外周關(guān)節(jié)或椎間盤中，通過增強磁共振（MRI）追蹤監(jiān)測，在任何MSC再植入部位都未檢測到腫瘤并發(fā)癥。Liu[27]等發(fā)現(xiàn)IL-6能夠激活Src信號通路從而增加胃惡性腫瘤細胞的運動活性，進而促進胃癌的進展，而BM-MSC能夠促進白細胞介素-6（interleukin-6, IL-6）的分泌，這也引發(fā)了研究人員對MSC安全性的探討，進而促進胃癌的進展。

因此，雖然有大量實驗研究及隨訪資料表明MSC在臨床中應(yīng)用具有廣闊的應(yīng)用前景，但MSC制備的條件與標(biāo)準(zhǔn)還需要進行更詳細的制定和規(guī)范，且其臨床應(yīng)用的安全性還需要大量實驗及數(shù)據(jù)進行研究分析，但隨著MSC的進一步了解及深入的研究，筆者相信MSC會在醫(yī)學(xué)方面造福人類。