結(jié)核性腦膜炎患者行腦脊液實驗室檢測方法的現(xiàn)狀與進展

李雪蓮 高孟秋

結(jié)核病是嚴重危害人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題。2016年，全球新發(fā)結(jié)核病患者約1040萬例[1]。我國是世界結(jié)核病高負擔國家，2016年登記患者總數(shù)為78萬例[1]。Sunnetcioglu 等[2]報道，肺外結(jié)核約占全部結(jié)核病患者的49.4%，由于缺乏細菌學依據(jù)，肺外結(jié)核的診斷通常比肺結(jié)核更加困難。結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是最常見的肺外結(jié)核之一，約占全部結(jié)核病患者的1%，但卻是導致結(jié)核病患者死亡最常見的一種類型，其病死率可達26.8%，而患者死亡多發(fā)生在最初的6個月[3]。因此，早期診斷及治療是改善TBM預后的重要因素。目前TBM的診斷是通過對臨床表現(xiàn)、腦脊液檢測、頭顱影像學檢查及是否并發(fā)顱外結(jié)核等綜合分析后作出的臨床診斷[4]。但是，TBM的臨床癥狀和體征，如頭痛、發(fā)熱、嘔吐、意識障礙、癱瘓、腦膜刺激征等均缺乏特異性，很難與其他病原體引起的腦膜炎相鑒別，尤其在疾病初期，頭顱影像學并不能呈現(xiàn)出特異性的改變，很容易誤診，老年TBM的誤診率更是高達59.1%[5]。因而，TBM的診斷已成為臨床亟需解決的重要課題。

腦脊液實驗室檢測對診斷TBM具有重要意義，通過檢測腦脊液中的結(jié)核分枝桿菌及其特異性的標志物，將為TBM的診斷提供重要幫助。筆者就TBM患者行腦脊液實驗室檢測方法的現(xiàn)狀與進展進行綜述。

病原學檢測方法

一、細菌學檢測方法

腦脊液涂片找到結(jié)核分枝桿菌是診斷TBM的直接證據(jù)，應用萋-尼(Ziehl-Neelsen)染色法染色后顯微鏡檢查是目前臨床上最常用的方法，成本較低，操作簡便，但陽性檢出率相對較低，國外報道陽性率為7.9%[6]，國內(nèi)僅為4.84%[7]。何紅彥等[8]采用玻片離心改良抗酸染色檢測法，檢出率由常規(guī)方法的11.7%提高至61.7%。鄒月麗等[9]報道的陽性率達94.29%。Chen等[10]應用這一方法對48份腦脊液標本(BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)陽性)進行檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性檢出率高達100%。而Zou等[11]發(fā)現(xiàn)，通過品紅染色抗酸桿菌，其在熒光顯微鏡下的敏感度為96.2%，而陽性率為79.2%。上述方法較好地提高了腦脊液涂片查找抗酸桿菌的敏感度，但均需進行多中心大樣本的臨床研究以確認其診斷價值。

腦脊液培養(yǎng)是目前診斷TBM特異度最高的方法，常規(guī)方法為羅氏(L?wenstein-Jensen)培養(yǎng)法，但由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，大約需31～42 d[12-13]，無法為臨床診斷提供及時的幫助。應用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)(美國BD公司)、BACTEC TB 460系統(tǒng)(美國BD公司)、MB/BacT系統(tǒng)(荷蘭奧根泰尼克公司)和ESP系統(tǒng) Ⅱ(美國BD DifcoTM公司)等方法可以將獲得結(jié)果的時間縮短至2～8周，但敏感度仍然很低(16%～51%)[14-16]，無法滿足臨床需求。

二、分子生物學檢測

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)是檢測結(jié)核分枝桿菌DNA的一種常用技術(shù)。PCR技術(shù)檢測的敏感度及特異度均高于常規(guī)的細菌涂片和培養(yǎng)方法[17]。在腦脊液標本上使用核酸擴增試驗(nucleic acid amplification tests，NAATs)檢測在20年前就有報道[18]，并且由此產(chǎn)生了多種PCR檢測方法。然而，由于這些方法的設(shè)計和表現(xiàn)不同，使得各種不同方法之間的比較存在困難。2003年，Pai等[19]就不同PCR方法對TBM的診斷準確性進行了Meta分析，發(fā)現(xiàn)商業(yè)化PCR檢測在腦脊液樣品中的敏感度為56%，特異度為98%。之后又出現(xiàn)多種應用不同靶標[插入序列6110(IS6110)、蛋白質(zhì)抗原B(protein antigen B)、rpoB基因片段、MPB64基因片段]和測試平臺的PCR檢測方法，總體性能得到了改進。

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新的DNA擴增技術(shù)，通過設(shè)計兩條環(huán)形引物，可以加速反應，提升敏感度。Modi等[20]的研究顯示，在確診的TBM患者中，LAMP的敏感度為96%，特異度為100%，在所有TBM患者(包括確診和疑似患者)中，LAMP的敏感度高于PCR。Nagdev等[21]發(fā)現(xiàn)LAMP技術(shù)診斷TBM的敏感度為88.23%，特異度為80%，優(yōu)于巢式PCR檢測。孫雯雯和肖和平[22]也報道，應用基于IS6110基因片段的LAMP技術(shù)診斷TBM的敏感度為43.02%(74/172)，明顯高于腦脊液抗酸染色和培養(yǎng)，與實時熒光定量PCR相似。上述國內(nèi)研究結(jié)果中LAMP法診斷TBM的敏感度(43.02%)明顯低于國外同類研究，可能與我國在檢測技術(shù)條件上和發(fā)達國家存在較大差異有關(guān)；另外，LAMP技術(shù)應用于腦脊液檢測的研究較少，操作人員經(jīng)驗欠缺，可能存在一定的誤差，這也是導致研究結(jié)果差距的可能原因。但仍然可以看到，腦脊液LAMP檢測是診斷TBM的一種快速、敏感、特異的方法，優(yōu)于PCR檢測，而且操作簡便，沒有分子生物學基礎(chǔ)的檢驗人員經(jīng)過培訓也能掌握該項技術(shù)，適用于在基層地區(qū)開展。

線性探針技術(shù)(line-probe assays，LPAs)是近年來興起的一種檢測技術(shù)，通過PCR技術(shù)將結(jié)核分枝桿菌的基因組特定片段進行擴增，并將擴增的產(chǎn)物與固定在尼龍膜上的寡核苷酸探針雜交，通過酶聯(lián)免疫法顯示結(jié)果。2017年Kaviyil和Ravikumar[17]報道的一項對10 281 例腦脊液標本的檢測結(jié)果顯示，LPAs的敏感度為96.15%，特異度為100.00%，在培養(yǎng)陽性患者中的檢出率高達97.67%。同時，LPAs對診斷異煙肼和利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌也具有很好的敏感度和特異度。張國欽等[23]發(fā)現(xiàn)，以全自動BACTEC MGIT 960檢測法為金標準，GenoType MTBDRplus分子線性探針法對異煙肼耐藥性檢出的敏感度和特異度分別為68.7%和98.9%，對利福平耐藥性檢出的敏感度和特異度分別為92.6%和97.5%。LPAs技術(shù)可以極大地縮短耐藥結(jié)核病的檢出時間，在耐藥基因檢測及結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定方面具有重要的作用。

Xpert MTB/RIF是在美國賽沛公司“GeneXpert”PCR平臺基礎(chǔ)上開發(fā)的一種新型、全自動實時熒光定量檢測技術(shù)，包括“GeneXpert”PCR平臺和Xpert MTB/RIF診斷試劑盒。其被WHO推薦用于肺結(jié)核及肺外結(jié)核的診斷，優(yōu)勢在于其操作簡單，只需要很少的專業(yè)技術(shù)知識和生物安全要求，并且交叉污染的概率很低[24]，2 h即可獲得結(jié)果。近年來，有眾多關(guān)于Xpert MTB/RIF診斷肺結(jié)核準確性的報道。由創(chuàng)新診斷新技術(shù)基金會(Foundation of Innovative New Diagnostics，F(xiàn)IND)組織的一項包括南非、秘魯、阿塞拜疆和印度的多國評估結(jié)果顯示，在納入的1730 例肺結(jié)核患者中，Xpert MTB/RIF在涂陽患者中的檢出率為98.2%(551/561)，在涂陰患者中為72.5%(124/171)[25]。Chang等[26]的Meta分析結(jié)果顯示，在18項研究的10 224份樣本中，Xpert MTB/RIF診斷肺結(jié)核的敏感度為90.4%，特異度為98.4%。這些研究結(jié)果促成了WHO對該方法的認可與推薦[27]。而Xpert MTB/RIF由于對腦脊液標本的研究較少，樣本量小，結(jié)果各異。Patel等[28]在結(jié)核病高負擔國家之一的南非進行的研究發(fā)現(xiàn)，Xpert MTB/RIF診斷TBM的敏感度為62%，特異度為95%。Rufai等[29]的研究卻發(fā)現(xiàn)Xpert MTB/RIF在腦脊液標本中的檢測陽性率僅為14.2%，低于BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)(19.5%)。楊元利等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，Xpert MTB/RIF檢測腦脊液標本的敏感度為23%(14/61)。如果在進入系統(tǒng)前將腦脊液標本進行離心，可以將診斷的敏感度提升至72%[31]。Xpert MTB/RIF Ultra是基于GeneXpert平臺的一種全新的、全自動巢式實時PCR檢測技術(shù)，其在HIV陽性的TBM患者中的敏感度為70%，而將樣本量增加到6 ml以上，陽性率可由7%提高到26%[32]。雖然WHO推薦將腦脊液Xpert MTB/RIF檢測作為初步診斷TBM的方法，但Boyles和Thwaites[33]提出，有效的TBM診斷試驗的陰性預計值應達到99%，而Xpert MTB/RIF檢測只有84%左右，因此應首先強調(diào)Xpert MTB/RIF對于TBM診斷的有限性；另外，需要強調(diào)Xpert MTB/RIF檢測需要大量的腦脊液(理想情況下為8～10 ml)。因此，WHO在制定指南時應對TBM的診治路徑有明確的指導，并不會因Xpert MTB/RIF檢測而影響路徑的實施。

免疫學檢測方法

腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)是一種核苷酸氨基水解酶，廣泛分布于人體各組織中。ADA檢測快速、簡便，在結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腹膜炎、結(jié)核性心包炎等的診斷中均廣泛應用。TBM患者腦脊液ADA升高可能是由于T淋巴細胞對病變局部刺激產(chǎn)生的一種反應。大量的研究表明，腦脊液中ADA的測定有利于鑒別TBM和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病[34-36]，Pormohammad等[37]的Meta分析結(jié)果也顯示腦脊液ADA對TBM診斷的準確性相對較高，敏感度和特異度分別為89%和91%，但其臨界值(cut-off值)相差較大(在6～15.5 U/L之間)。目前，國內(nèi)外對TBM腦脊液中ADA的cut-off值尚沒有統(tǒng)一的界定。而且腦脊液中ADA活性升高并非僅見于TBM，凡能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫功能變化的疾病都可導致ADA活性改變。Corral等[38]的研究顯示，在神經(jīng)系統(tǒng)巨細胞病毒感染、隱球菌感染、淋巴瘤、念珠菌性腦膜炎的患者中發(fā)現(xiàn)ADA升高。一項系統(tǒng)綜述也顯示[39]，在納入的13項研究中(338例TBM患者)，不能確定合適的cut-off值來鑒別TBM和細菌性腦膜炎。因此，只有當除外細菌性腦膜炎后，腦脊液ADA對TBM的診斷才具有重要價值。

γ干擾素(interferon-γ，INF-γ)是結(jié)核分枝桿菌免疫反應的主要介導者，它參與巨噬細胞激活和輔助性T細胞(Th)1 淋巴細胞的轉(zhuǎn)化過程。近年來，大量的研究報道應用γ干擾素釋放試驗(interferon-γ release assay，IGRA)診斷活動性和潛伏性結(jié)核感染[40-42]。雖然IGRA對肺結(jié)核診斷的價值有限[43]，但是將IGRA應用于漿膜腔積液的檢測可能更有價值[44]。一些研究顯示腦脊液IGRA檢測具有較好的特異度，但敏感度欠佳(58%～68%)[45-47]。IGRA同樣存在著一些缺陷：約10%～80%的檢測出現(xiàn)不確定的結(jié)果；需要大量的腦脊液標本(5～10 ml)才能獲得足夠數(shù)量的細胞等。而且IGRA與羅氏培養(yǎng)之間的一致性較差，出現(xiàn)這種情況可能是因為腦脊液中的IFN-γ也是免疫反應的一部分，可能有助于清除腦脊液中的細菌，導致陰性的培養(yǎng)結(jié)果。因此，這些非培養(yǎng)方法似乎不能作為確診試驗，而只能作為補充試驗[48]。

其他檢測指標

近年來，一些新的腦脊液檢測指標應用于TBM的診斷，顯示出了一定的價值，但均需更進一步的研究來確定。

一、花生四烯酸鹽5脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX-5)

ALOX-5是白三烯B4和脂氧素代謝途徑中的一種酶，已被證明在小鼠結(jié)核病的發(fā)病機制中起作用[49-50]。Kataria等[51]通過對TBM患者腦脊液標本進行蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)11種人蛋白和8種分枝桿菌蛋白表達水平改變，其中ALOX-5通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)得到了驗證。該研究證實了ALOX-5作為疾病發(fā)病機制中新的診斷標記和關(guān)鍵分子的潛在價值。

二、乳酸

乳酸是人體中一種常見的代謝物，以兩種立體異構(gòu)體——(對映異構(gòu)體)-L-乳酸和D-乳酸的形式存在。在人體中，L-乳酸被認為是乳酸正常的生理存在形式。D-乳酸水平升高通常是由于腸道創(chuàng)傷或胃腸道疾病。Hill等[52]檢測了467個腦脊液標本中的乳酸水平，發(fā)現(xiàn)最低閾值為3 mmol/L時，敏感度為81.8%，特異度僅為56.6%；而閾值為6 mmol/L時，特異度最高，達到94.2%，但敏感度僅為54.6%。因此沒有合適的乳酸閾值作為診斷TBM的標準。Mason等[53]則首次報道了TBM患者的腦脊液中觀察到的乳酸為L-乳酸，但這可能僅僅是宿主對感染的反應。小膠質(zhì)細胞可以優(yōu)先利用乳酸作為能量底物，因此，TBM患者中乳酸水平的升高似乎是因為它是一種重要的能量底物并且具有保護神經(jīng)的能力，并沒有任何細菌的作用。

三、阿拉伯糖甘露糖脂(lipoarabinomannan，LAM)及其IgG抗體

LAM是分枝桿菌菌屬所特有的菌壁成分，具有菌屬特異性，故可以應用LAM及其抗體作為結(jié)核病診斷與鑒別診斷的指標。Shah等[54]的研究發(fā)現(xiàn)，尿LAM側(cè)流法(lateral flow assay，LFA)檢測可用于診斷HIV陽性成年人的活動性結(jié)核病。Cox等[55]檢測了91例患者的腦脊液發(fā)現(xiàn)，對于組織病理學診斷確診的TBM，LAM-LFA的敏感度為75%，特異度為87%。對于組織病理學不典型而存在其他部位結(jié)核病的TBM，LAM-LFA的敏感度為50%，特異度為70%，對于應用綜合診斷標準診斷的TBM患者，LAM-LFA的敏感度為68%，特異度為78%。Patel等[56]的研究顯示，在HIV感染率較高的地區(qū)，LAM檢測方法在腦脊液標本中的敏感度為31%，特異度為94%。因此，腦脊液中的LAM可作為TBM的輔助診斷工具。

四、熱休克蛋白(heat shock protein，Hsp)

Hsp是一組在結(jié)構(gòu)上高度保守的多肽，廣泛存在于自然界原核、真核細胞中，不同相對分子質(zhì)量的Hsp(Hsp90、Hsp70、Hsp65和Hsp10等)在細胞內(nèi)的分布不同，廣泛存在于結(jié)核分枝桿菌中，Hsp90、Hsp70、Hsp65和Hsp10等多種家族成員在結(jié)核感染期間可在宿主中引起強烈的免疫反應。關(guān)于Hsp在TBM患者中的診斷意義的報道較少。Mudaliar 等[57]應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測腦脊液中相對分子質(zhì)量為65 000(65 kD)的Hsp的水平，發(fā)現(xiàn)其明顯高于非TBM患者和非感染性神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者。Shekhawat等[58]發(fā)現(xiàn)Hsp70和Hsp90對TBM診斷的敏感度分別為89%和88%，特異度分別為82%和89%，具有潛在的診斷價值。

綜上所述，近年來臨床雖然對TBM的理解和認識有所進步，但TBM仍是結(jié)核病最致命的類型之一，提高生存率的最好方法是快速準確地診斷和迅速開始治療。目前，診斷TBM的實驗室檢測方法并不能完全滿足臨床需求，且很多文獻報道的檢測方法敏感度超出我國的臨床實際情況，這可能與腦脊液標本量、收集方法、早期應用廣譜抗生素[59-60]等因素有關(guān)。但最近的一些發(fā)展已經(jīng)顯示出了希望，包括提高涂片顯微鏡鏡檢敏感度的方法、自動化核酸擴增平臺的開發(fā)及使用新的生物標志物等，但都需要進行更多及更大范圍的研究來確定。

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