iRGD肽協(xié)同奧沙利鉑逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸腫瘤耐藥的研究進展

紀(jì)忠偉 楊羽茜 李勝龍 張博淼 李云龍 黃躍南

結(jié)直腸癌是世界上常見的惡性腫瘤，早期結(jié)直腸癌（Ⅰ期和Ⅱ期）患者的5年生存率在60%以上；50%以上的患者在確診時已經(jīng)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移（為Ⅲ期或Ⅲ期以上），5年生存率下降到10%，化療和手術(shù)治療仍是重要的治療手段，也是提高生存率的唯一途徑［1］。奧沙利鉑（oxaliplatin）是常用于結(jié)直腸癌化療的第三代鉑類藥物，然而，結(jié)直腸癌化療無效的一個重要原因是腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥。

一、奧沙利鉑在結(jié)直腸癌化療中的耐藥機制

奧沙利鉑是第三代鉑類藥物，常用于結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌的化療，通過主動轉(zhuǎn)運進入細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)的親核分子結(jié)合，主要是DNA，也與RNA和蛋白質(zhì)結(jié)合，在兩個鄰近的鳥嘌呤之間或鳥嘌呤與腺嘌呤之間形成鏈內(nèi)加合物，而破壞DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄［2］。在結(jié)直腸癌化療中，奧沙利鉑耐藥的分子機制主要涉及核酸切除修復(fù)系統(tǒng)（nucleic acid excision repair system，NER）、微小RNA、細(xì)胞膜表面三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體（ATP-binding cassette transporters, ABC轉(zhuǎn)運體）等。

1.NER：NER是高度保守的DNA修復(fù)途徑，修復(fù)DNA損傷，改變DNA分子的螺旋結(jié)構(gòu)并干擾DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。該系統(tǒng)修復(fù)過程的重要步驟包括識別DNA受損特定區(qū)域的損傷和分界，形成復(fù)合物以解開受損部分并將其切除，最后，切除后的區(qū)域被重新正確合成并連接以保持DNA分子的完整［3］。在體內(nèi)順鉑和奧沙利鉑導(dǎo)致的DNA損傷能被NER系統(tǒng)修復(fù)，NER系統(tǒng)中核酸切除修復(fù)交叉互補因子-1和其催化因子XPF（ERCC4）在核苷酸切除修復(fù)中起著重要的作用，被證明參與奧沙利鉑的耐藥［4］，其它蛋白如XPF和XPG（ERCC5）也與奧沙利鉑耐藥有關(guān)。但也有研究表明，修復(fù)交叉互補因子-1水平降低與奧沙利鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯有關(guān)，與耐藥性的產(chǎn)生或DNA修復(fù)能力的改變無關(guān)［5］，因此仍需要進一步研究。

2.微小RNA（MicroRNAs）：MicroRNAs（miRNA）是非編碼RNAs，通過模板序列以堿基互補的方式結(jié)合到靶信使RNAs上，導(dǎo)致靶信使RNAs降解或轉(zhuǎn)錄抑制。研究表明miRNAs突變與人類腫瘤獲得性耐藥密切相關(guān)，在體外過度表達miR-153，miR-203，miR-143，通過相應(yīng)地調(diào)整FOXO3a，ATM激酶和IGF-1R而影響奧沙利鉑的耐藥性［6］。臨床試驗中，結(jié)直腸患者血漿中過度表達miR27b和miR-148a，與以奧沙利鉑為基礎(chǔ)的一線化療耐藥和無進展生存期縮短相關(guān)，而過度表達miR-326與總體生存率下降相關(guān)［7］。

3.細(xì)胞膜表面ABC轉(zhuǎn)運體（ABC transporters）：腫瘤細(xì)胞藥物流出轉(zhuǎn)運體ABC家族在轉(zhuǎn)出細(xì)胞內(nèi)的化療藥物方面起著重要的作用，特別指出的是ABC亞家族，包含多藥耐藥相關(guān)蛋白已經(jīng)證明參與鉑類藥物的耐藥［8］，在體外卵巢癌模型中，多藥耐藥相關(guān)蛋白1和多藥耐藥相關(guān)蛋白4能增加ABC轉(zhuǎn)運體的基因表達及與氨基端相關(guān)的糖基化，這對減少癌細(xì)胞中化療藥物的累積及增加對化療藥物的耐藥性起著重要作用［8］。

以奧沙利鉑為基礎(chǔ)的化療方案目前已成為轉(zhuǎn)移性或晚期結(jié)直腸癌化療的標(biāo)準(zhǔn)方案。然而，單獨使用奧沙利鉑在體內(nèi)并沒有顯示出足夠高的抗腫瘤活性，主要歸因于靜脈給藥后人體對藥物有劑量限制性的毒副作用，藥物在腫瘤組織的累積濃度低，以及腫瘤細(xì)胞對藥物的耐藥。一般而言，癌癥化療的效果受到化療藥物對正常細(xì)胞和組織的毒副作用以及多藥耐藥發(fā)展的限制，這些局限性是由于抗腫瘤藥物對腫瘤細(xì)胞缺乏選擇性以及它們對靶組織的低遞送率。iRGD肽作為一種靶向肽與化療藥物結(jié)合，可以使化療藥物最大化地遞送到腫瘤組織內(nèi)，同時使其在正常組織中的累積和毒性最小化。

二、iRGD肽的結(jié)構(gòu)及逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥機制

iRGD是腫瘤組織特異性穿透肽，通過荷瘤鼠體內(nèi)噬菌體文庫篩選出來，具有靶向特定腫瘤的能力，已經(jīng)證明能選擇性遞送化療藥物和顯像劑至腫瘤的特定部位［9-10］。iRGD肽包含兩個氨基酸基序，即RGD基序和R/KXXR/K基序（即CendR基序），由9個氨基酸組成，即CRGDKGPDC，易與靶腫瘤細(xì)胞表面的神經(jīng)纖毛蛋白-1（neuropilin-1，NRP-1）受體結(jié)合，增加對靶腫瘤細(xì)胞膜的通透性［11-12］。靜脈注射iRGD后，iRGD與在腫瘤脈管系統(tǒng)中特異性表達的αv整聯(lián)蛋白結(jié)合，然后被水解加工成CRGDK/R，在C-末端暴露出活性的CendR基序，CendR基序與NRPS相互作用，激發(fā)穿過組織的主動容量轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（active bulk transport system），使結(jié)合iRGD的藥物甚至游離但與iRGD共同施用的藥物在腫瘤組織內(nèi)滲透和擴散［9，12］。首先，RGD 基序與整合素的 αvβ3和αvβ5受體結(jié)合，而這些受體主要在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中表達，在腫瘤的其他細(xì)胞中也有表達，這很可能使iRGD肽在腫瘤組織的擴散中起重要作用，而血管內(nèi)皮是iRGD肽進入腫瘤細(xì)胞的大門。其次，蛋白酶切割事件（Protease cleavage event）激活CendR基序（R/KXXR/K），這種蛋白酶沒有被確定，可能是弗林蛋白酶或弗林蛋白酶樣酶，因為CendR基序是這些蛋白酶首選識別基序。組織穿透肽一致通過R/KXXR/K基序與NRP結(jié)合，增加血管滲透性和分子通過組織的轉(zhuǎn)運。R/KXXR/K基序不具有活性，除非它占據(jù)肽的C端位置，因此稱為C-end Rule基序（CendR motif）［13］。CendR基序是這些蛋白酶的首選識別基序，蛋白酶切割需要與整合素結(jié)合，而有CendR基序但不與整合素結(jié)合的肽類是無作用的，因此與整合素結(jié)合的前提限制了iRGD肽靶向腫瘤的作用。最后，CendR基序結(jié)合NRP-1或神經(jīng)纖毛蛋白-2（NRP-2），進而激活內(nèi)吞作用/胞吐轉(zhuǎn)運通路，此通路即為CendR通路［11，13-14］。此通路由iRGD激發(fā)，在增強化療藥物向腫瘤組織遞送中起重要作用，而NRP-1和NRP-2是調(diào)節(jié)血管通透性的關(guān)鍵分子［15］。

三、CendR通路的細(xì)胞生物學(xué)

CendR通路始于細(xì)胞的內(nèi)吞作用步驟，該步驟與已知的內(nèi)吞細(xì)胞通路明顯不同。CendR內(nèi)吞囊泡與巨噬細(xì)胞囊泡最相似，但與經(jīng)典的巨胞飲不同，因為CendR通路需要神經(jīng)纖毛蛋白受體，另一明顯區(qū)別是CendR通路通過細(xì)胞和組織的營養(yǎng)缺乏來提高活性，在營養(yǎng)素供應(yīng)豐富的情況下，反應(yīng)低下，營養(yǎng)物質(zhì)通過中心營養(yǎng)感受器mTOR發(fā)揮其對CendR通路的作用［16］。CendR通路的mTOR調(diào)節(jié)主要通過調(diào)節(jié)NRP-1的表達來發(fā)揮作用。盡管營養(yǎng)素缺乏增強了通路的活性，但實際仍需要通過NRP-1激發(fā)。在mTOR活性較高的腫瘤中，mTOR調(diào)節(jié)CendR通路的一個必然結(jié)果是iRGD不能有效地將藥物輸送到具有高水平mTOR活性的腫瘤中，mTOR抑制劑雷帕霉素（rapamycin）與iRGD肽結(jié)合能增加腫瘤中CendR通路的遞送效率［16］。

當(dāng)CendR通路處于激活狀態(tài)時，形成的內(nèi)吞囊泡很大，平均直徑約200 nm，可以容納相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞外液，如果細(xì)胞外液中含有化療藥物，和納米顆粒一樣作為荷載物儲存在這些內(nèi)吞囊泡中，必要時大量釋放到通路中，這種情況說明了CendR通路的一個重要特點，除了共價連接的有效荷載物外，也能轉(zhuǎn)運與iRGD肽一起施用但不與其結(jié)合的有效荷載，即旁觀者效應(yīng)（by-stander effect）［17］。iRGD荷載在腫瘤組織中的傳遞意味著能將有效載荷從一個細(xì)胞遞送到另一個細(xì)胞。CendR通路是一個主動轉(zhuǎn)運通路，需要消耗能量［18］，細(xì)胞與細(xì)胞之間CendR通路荷載物的轉(zhuǎn)運已經(jīng)在培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中證實［18］，最初的內(nèi)吞過程很好理解，但是細(xì)胞間轉(zhuǎn)運的途徑和分子機制的信息很少。從已經(jīng)攝取CendR通路有效荷載的細(xì)胞釋放的外泌體含有效荷載，表明外泌體轉(zhuǎn)運作為細(xì)胞間轉(zhuǎn)運的一種機制，即使在有能溶解納米顆粒但不滲透膜的化合物存在下，銀納米顆粒也可以從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)運到另一個細(xì)胞，這與CendR有效載荷受到生物膜（如外泌體）保護的觀點一致。另一種假設(shè)細(xì)胞間轉(zhuǎn)運是通過微米或納米管來完成的，已經(jīng)證明在腫瘤細(xì)胞之間或腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間管狀導(dǎo)管的存在，細(xì)胞內(nèi)的大分子通過這些導(dǎo)管從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)運到另一個細(xì)胞［19-20］。在短距離內(nèi)通過這些管道傳輸?shù)男时韧饷隗w傳輸更高［20］，這種機制可以解釋CendR通路跨組織轉(zhuǎn)運的有效性和傳輸速度。

iRGD肽通過與神經(jīng)纖毛蛋白（neuropilin，NRP）相互作用增加腫瘤血管通透性將藥物遞送到血管外腫瘤組織中。在iRGD中的兩個活性基序中，NRP結(jié)合的CendR基序在抗轉(zhuǎn)移方面起重要作用，而整合素結(jié)合的RGD基序似乎只是將肽帶到腫瘤組織或細(xì)胞中，因為沒有CendR基序的RGD肽缺乏抗轉(zhuǎn)移活性［13］。NRP-1和NRP-2在腫瘤細(xì)胞中高度表達，并且已經(jīng)證實在腫瘤轉(zhuǎn)移中起作用［12，15］。iRGD結(jié)合NRP-1和NRP-2，抗腫瘤轉(zhuǎn)移可能是通過兩種NRPs共同作用的結(jié)果。其抗轉(zhuǎn)移作用由NRP結(jié)合的CendR基序介導(dǎo)，而不是由與整合素結(jié)合的RGD基序介導(dǎo)。iRGD抑制腫瘤細(xì)胞的遷移并引起體外化學(xué)排斥依靠CendR和NRP-1，該肽引起細(xì)胞急劇崩潰和部分細(xì)胞脫離，導(dǎo)致驅(qū)避活性，表明CendR在整聯(lián)蛋白功能調(diào)節(jié)中起重要作用［17］。當(dāng)該肽用于藥物遞送至腫瘤的靶向肽時，iRGD的抗轉(zhuǎn)移活性可以提供顯著的附加益處。

研究表明腫瘤細(xì)胞遷移是轉(zhuǎn)移級聯(lián)的關(guān)鍵步驟，涉及細(xì)胞突起的動態(tài)調(diào)節(jié)，細(xì)胞突起介導(dǎo)細(xì)胞粘附，提供移動的牽引力，并感知吸引或排斥細(xì)胞的環(huán)境信號。一些細(xì)胞遷移抑制劑通過折疊額細(xì)胞突起來消除前向牽引，幫助細(xì)胞改變方向，起到化學(xué)治療劑的作用。包括天然CendR分子Semaphorin 3A（Sema 3A）在內(nèi)的各種化學(xué)治療藥物通過抑制腫瘤侵襲來抑制轉(zhuǎn)移［22］。iRGD肽，是一個有力的轉(zhuǎn)移抑制劑，通過CendR基序結(jié)合NRP-1抑制腫瘤細(xì)胞遷移和化療耐藥，活細(xì)胞成像研究表明，iRGD提供了收回細(xì)胞突起的線索，并且一致地排斥了遷移的腫瘤細(xì)胞群，該作用依賴NRP結(jié)合CendR基序，因為CRGDC（非CendR對照肽）無效，并且iRGD在Transwell測定中的化學(xué)誘導(dǎo)被阻斷性抗NRP-1b1b2抗體顯著抑制［21］。這些發(fā)現(xiàn)證明了iRGD的CendR依賴性化學(xué)傾向性質(zhì)，并提供了抗轉(zhuǎn)移作用的潛在機制。

綜上所述，iRGD肽通過穿透效應(yīng)、滯留效應(yīng)以及主動靶向作用，將化療藥物特異地遞送到腫瘤組織內(nèi)，最低限度地降低化療藥物在正常組織細(xì)胞內(nèi)的累積，降低藥物的毒副作用，增強化療效果。研究表明，當(dāng)iRGD肽用作化療藥物遞送的輔助療法時，將同時發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。iRGD的抗轉(zhuǎn)移作用可以用于預(yù)防初始轉(zhuǎn)移，抑制已發(fā)生轉(zhuǎn)移的再轉(zhuǎn)移，以及克服抗血管生成療法中的促轉(zhuǎn)移副作用［21-23］。目前研究僅在動物實驗?zāi)Ｐ秃图?xì)胞培養(yǎng)上，但是人類腫瘤對iRGD肽增強治療的真正效果只能在臨床試驗中確定，有待于進一步研究。