SPE-GC法聯(lián)用快速檢測果蔬中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留

郭團(tuán)玉，謝友亮，陳媛梅，陳 峰，3*

(1.寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100；2.寧德師范學(xué)院化學(xué)與材料學(xué)院，福建 寧德 352100；3.綠色能源與環(huán)境催化福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 寧德 352100；4.福建省寧德市藥品檢驗(yàn)所，福建 寧德 352100)

我國是世界上最大的果蔬生產(chǎn)和消費(fèi)國，也是農(nóng)藥使用大國[1]。有機(jī)磷農(nóng)藥是一種廣譜殺蟲劑，具有高效、溶解性好、易被水解、易降解等特效，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，但也因其毒性較大，會(huì)污染環(huán)境且對人體危害極大，因此成為當(dāng)前農(nóng)藥殘留檢測的重點(diǎn)以及社會(huì)熱點(diǎn)關(guān)注話題[2―4]。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥的最大允許殘留量為 0.2μg/mL[5]。目前， 有機(jī)磷類農(nóng)藥檢測方法有光譜法、試紙法技術(shù)、氣相色譜法、液相色譜法、免疫學(xué)方法、生物傳感器與生物芯片技術(shù)等，其中，氣相色譜法(以下簡稱GC)是檢測有機(jī)磷類農(nóng)藥的國家標(biāo)準(zhǔn)方法[6]。雖然氣相色譜法較為成熟，但對樣品純度要求很高，樣品的前處理過程復(fù)雜，分析費(fèi)用高，耗時(shí)長，對樣品具有破壞性等缺點(diǎn)[7]。固相萃取(以下簡稱SPE)為上世紀(jì)八十年代開始發(fā)展起來的一種微量樣品處理技術(shù)，主要用于樣品的純化，能夠滿足樣品進(jìn)氣相色譜儀檢測前的凈化[8，9]。

本研究以有機(jī)磷農(nóng)藥中的敵敵畏、乙酰甲胺磷為研究對象，用乙腈作為提取劑，將浸液提取法與超聲波提取法相結(jié)合，最大程度提取出樣品中殘留的農(nóng)藥，接著，采用GCB/PSA雙層固相萃取柱對提取液進(jìn)行分離純化，去除GC分析中關(guān)鍵性的干擾物(如色素、甾醇、脂肪酸、有機(jī)酸、糖類等)，得到待測液。最后，通過優(yōu)化氣相色譜條件后進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑：敵敵畏、乙酰甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)品采購自國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心；敵敵畏、乙酰甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液均為100μg/mL；水果樣品采購自寧德市某超市；乙腈、丙酮、甲醇均為色譜純；甲苯、二氯甲烷、無水硫酸鈉(在650℃下烘干4h)、氯化鈉、無水乙醇均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備：TARACE1300型氣相色譜儀(配FTD氮磷檢測器，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；ZB-1701P型石英毛細(xì)管色譜柱(美國菲羅門公司)； KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SPE柱(500mg，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；sepulco 12孔固相萃取裝置(北京飛美斯分析科技有限公司)；R205B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；MS 3 digital型漩渦振蕩器(德國IKA公司)；T 18 digital型組織搗碎機(jī)(德國IKA公司)；SHA-BA型數(shù)顯水浴恒溫振蕩器(上海比朗儀器有限公司)。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品的提?。簩⒐哂盟姆址ㄈ樱湃虢M織搗碎機(jī)中在15000r/min高速下?lián)v碎勻漿2min。準(zhǔn)確稱取勻漿樣品30.0g，置于250mL碘量瓶中，加入60mL乙腈，混合均勻，控制溫度為20℃(原因是可以減少乙腈揮發(fā)，不破壞殘留農(nóng)藥的成分，提取出的雜質(zhì)相對較少，避免雜質(zhì)對色譜柱的污染與損壞)，設(shè)定超聲功率為100w，超聲10min，進(jìn)行第一次超聲，靜置1min后加入已烘干好的25.0g無水硫酸鈉(原因是更均勻的吸收水果和乙腈中的水分)，進(jìn)行第二次超聲。超聲結(jié)束后，將樣品置于數(shù)顯恒溫振蕩器上，在20℃的溫度下高速振蕩10min，震蕩后的樣品經(jīng)減壓抽濾后加入5.0g氯化鈉(采用鹽析作用不僅有利于兩相分層， 還提高了有機(jī)磷農(nóng)藥在有機(jī)相中的萃取率。)[10]，再劇烈振蕩1min后靜置，使其分層，準(zhǔn)確移取其上清液20mL，置于雞心瓶中，在40℃下旋蒸至近干。將3mL丙酮/二氯甲烷(1∶1)混合液，分3次加入到旋蒸好的雞心瓶中，封住瓶口，用漩渦振蕩器振蕩2min，使其溶解，得到供1.3.2項(xiàng)使用的樣品。

1.3.2 樣品的凈化：對SPE柱進(jìn)行活化處理后，控制流速在25滴/分鐘，將1.3.1項(xiàng)得到的樣品倒入活化好的SPE柱中，使樣品中色素等雜質(zhì)充分被柱吸附，再用少量丙酮/二氯甲烷(1∶1)洗脫2～3次，合并收集洗脫液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在40℃下，旋蒸濃縮至近1mL，加入少量丙酮溶解，定容至5mL，得到待測樣，送氣相色譜儀檢測。

1.4 GC條件

優(yōu)化的色譜條件：ZB-1701型石英毛細(xì)管色譜柱( 30 m×0.25 mm×0.25μm)，F(xiàn)TD氮磷檢測器，進(jìn)樣口溫度230℃，恒流，氮?dú)饬髁?0mL/min，氫氣流量2.3mL/min，空氣流量60mL/min，尾吹氣流量15mL/min，不分流模式，進(jìn)樣量1μL。采用保留時(shí)間定性， 峰面積外標(biāo)法單點(diǎn)校正定量。

程序升溫條件：初始溫度60℃ 保持1 min，以20℃/ min的升溫速度升溫至160℃， 保持1 min，以10℃/min的升溫速度升溫至180℃，保持1 min，最后以5℃/min的升溫速度升溫至260℃，保持1 min，整個(gè)程序升溫程序用時(shí)26min。檢測器溫度280℃。

1.5 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合稀釋， 配制成0.16、0.48、0.64、1.6、3.2、6.4、8.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 洗脫劑的選擇

洗脫劑的選擇直接關(guān)系到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。溶劑極性太弱， 會(huì)洗脫干擾成分，而極性太強(qiáng)， 卻導(dǎo)致樣品不易被洗脫。根據(jù)相似相溶的原理，樣品應(yīng)采用較低極性的混合溶劑進(jìn)行洗脫。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索后，實(shí)驗(yàn)時(shí)配制丙酮/二氯甲烷(1∶1)，乙腈/甲苯(1∶1)，乙腈/甲醇(1∶1)混合溶劑作洗脫比較實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖1﹑圖2 ﹑圖3所示。在圖1中，樣品得到了良好的分離，且峰特征明顯，基線較平穩(wěn)；在圖2中，樣品間雖能得到分離，但乙酰甲胺磷的峰分解出多個(gè)小峰，表明乙酰甲胺磷出現(xiàn)了小部分分解或凈化不完全，有其他雜質(zhì)干擾；在圖3中，沒有樣品的特征峰，表明樣品均未能洗脫出來。綜上，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)采用丙酮/二氯甲烷(1∶1)混合溶劑作為洗脫劑，洗脫效果最好。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

色譜柱的類型和極性、柱溫、載氣流量、柱壓等是影響氣相色譜分離效果、分析時(shí)間長短和方法靈敏度的主要因素[11]，因此，本研究對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。如圖4所示，優(yōu)化前，混合標(biāo)樣的色譜峰特征不明顯且峰面積小，氣相色譜儀的電壓信號高，基線不平穩(wěn)；如圖5所示，優(yōu)化后，混合標(biāo)樣的色譜峰特征明顯且峰面積大，氣相色譜儀的電壓控制在30―50 pa范圍內(nèi)基線平穩(wěn)。綜上，采用優(yōu)化后的“1.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，樣品出峰時(shí)間短， 峰形佳， 樣品可以得到有效分離。

圖4優(yōu)化前混合標(biāo)樣的GC圖圖5優(yōu)化后混合標(biāo)樣的GC圖

Fig.4 GC chromatogram of mixed standard sample before optimization；

Fig.5 GC chromatogram of mixed standard sample after optimization

2.3 定性分析

取6.4μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，結(jié)果如圖6所示，譜圖中有三個(gè)明顯的峰，與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對照，可知丙酮的保留時(shí)間為1.570 min，敵敵畏的保留時(shí)間為7.015 min，乙酰甲胺磷的保留時(shí)間為10.203 min。而且由圖還可知，敵敵畏、乙酰甲胺磷與丙酮均能夠得到很好的分離，具有較高的專屬性。

2.4 線性試驗(yàn)

按“1.4”項(xiàng)下的色譜條件分別對各濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，得到圖7和圖8。由圖可知，敵敵畏和乙酰甲胺磷在0.16～8.0μg/mL的濃度范圍內(nèi)顯現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)R都在0.995以上。

圖6 定性分析的GC圖

圖7敵敵畏的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖8乙酰甲胺磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.6 GC chromatogram of qualitative analysis；Fig.7 Standard curve of dichlorvos；

Fig.8 Standard curve of acetyl methamidophos

2.5 檢測限試驗(yàn)

以信噪比為3∶1時(shí)的相應(yīng)的進(jìn)樣濃度為檢測限，按“1.4”項(xiàng)進(jìn)行試驗(yàn)，由圖9可知敵敵畏的檢測限為0.015μg/mL，其信噪比S/N=3.0；由圖10可知乙酰甲胺磷的檢測限為0.086μg/mL，其信噪比S/N=3.0。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法靈敏度高。

圖9敵敵畏檢測限的GC圖圖10乙酰甲胺磷檢測限的GC圖

Fig.9 GC chromatogram of dichlorvos on detection limits；

Fig.10 GC chromatogram of acetyl methamidophos on detection limits

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)

以0.64μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，測定次數(shù)為6次，記錄峰面積。由表1可知，敵敵畏的峰面積RSD=3.21%、乙酰甲胺磷的峰面積RSD=2.95%。根據(jù)藥典規(guī)定，氣相色譜法的重復(fù)性試驗(yàn)峰面積的RSD不得大于10.0%。試驗(yàn)結(jié)果表明，氣相色譜條件和儀器方法重復(fù)性好。

以0.64μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，在不同時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測定，由表2可知，敵敵畏的峰面積RSD=1.66%、乙酰甲胺磷的峰面積RSD=2.62%。根據(jù)藥典規(guī)定，氣相色譜法的穩(wěn)定性試驗(yàn)峰面積的RSD不得大于10.0%。試驗(yàn)結(jié)果表明，敵敵畏和乙酰甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液在48 h內(nèi)保持穩(wěn)定，穩(wěn)定性佳。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

分別添加3.2、6.4、8.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4項(xiàng)進(jìn)樣分析，從而考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。每種濃度的樣品平行測定6次，測定每個(gè)樣品中的敵敵畏和乙酰甲胺磷的峰面積，將其與添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表3可知，敵敵畏的回收率在89.32%～109.93%之間，RSD為2.67%～5.26%；乙酰甲胺磷的回收率在80.27%～93.68%之間，RSD為3.22%～9.76%。根據(jù)藥典，氣相色譜法檢測的回收率應(yīng)在75%～120%之間，RSD不得大于10.0%，試驗(yàn)結(jié)果都落于上述區(qū)間內(nèi)，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度均良好。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 實(shí)際樣品檢測

運(yùn)用以上建立的SPE-GC法對寧德市某市場隨機(jī)采購的果蔬樣品進(jìn)行敵敵畏、乙酰甲胺磷殘留量的快速檢測，結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，所采集的樣品中敵敵畏、乙酰甲胺磷均未檢出，說明它們的殘留量極低，均低于它們的檢測限以及國標(biāo)允許的殘留量，可放心食用。

表4 果蔬樣品敵敵畏、乙酰甲胺磷的檢測結(jié)果

3 結(jié)論

1)建立了SPE-GC法同時(shí)對果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行定性及定量分析的檢測方法。

2)采用優(yōu)化的色譜條件，方法靈敏度更高；采用丙酮/二氯甲烷(1∶1)混合溶劑作為洗脫劑，洗脫效果最好。

3)敵敵畏、乙酰甲胺磷及溶劑峰所呈現(xiàn)的分離效果良好；敵敵畏與乙酰甲胺磷濃度在0.16～8.0μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.995以上。敵敵畏的檢測限為0.015μg/mL，乙酰甲胺磷的檢測限為0.086 μg/mL；表明該方法的靈敏度高。

4)敵敵畏的回收率在89.32%～109.93%之間，RSD為2.67%～5.26%；乙酰甲胺磷的回收率在80.27%～93.68%之間，RSD為3.22%～9.76%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度好。

本法和國標(biāo)GB/T 5009.103―2003比較，具有操作簡單快速、檢測結(jié)果可靠準(zhǔn)確、有機(jī)溶劑用量少的特點(diǎn)，極大降低了GC分析中由基質(zhì)體系導(dǎo)致的信號干擾，可以用于短時(shí)間內(nèi)較多數(shù)量混合樣品的檢測，從而為同時(shí)快速檢測果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留提供了重要的參考借鑒作用。

[1]邵承斌， 譚冬梅.果蔬農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)與降解研究進(jìn)展[J].重慶工商大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2006， 23(1):29―34.

[2]吳迎春， 聶峰.水果蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的快速檢測技術(shù)研究[J].陜西理工學(xué)院學(xué)報(bào)(自科版)， 2009， 25(3):73―76.

[3]蘇明偉， 鄭言波， 楊海，等.果蔬農(nóng)藥殘留檢測的預(yù)處理和檢測條件優(yōu)化研究[J].食品科學(xué)， 2006， 27(5):199―201.

[4]鄭金武.蔬菜農(nóng)藥殘留的現(xiàn)狀與檢測技術(shù)的概況[J].生物災(zāi)害科學(xué)， 2011，34(2): 61―63.

[5] GB/ T5009.199―2003.《蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量快速檢測方法》(衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn))[S].北京:中華人民共和國衛(wèi)生部， 中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)， 2003.

[6] Cristina Aprea， Claudio Colosio， Teresa Mammone， et al. Biological monitoring of pesticide exposure: a review of analytical methods[J]. Journal of Chromatography B， 2002， 769: 191―219.

[7]姜俊，李培武，謝立華，等.固相萃取-全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜同步快速檢測蔬菜中64種農(nóng)藥殘留[J].分析化學(xué)，2011，39(1):72―76.

[8] Danis T， Sakkas V， Stratis I. Pesticide Multiresidue Analysis in Fresh and Canned Peaches Using Solid Phase Extraction and Gas Chromatography Techniques[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，2002， 69(5):674―81.

[9] Green C E， Abraham M H. Investigation into the effects of temperature and stirring rate on the solid-phase extraction ofdiuron from water using a C18 extraction disk.[J]. Journal of Chromatography A， 2000， 885(1―2):41―49.

[10]李四生， 李家濤， 李昌安，等.毛細(xì)管氣相色譜法測定蔬菜、水果中20種有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2009(2):318―320.

[11]秦瓏， 楊夢祺， 王建營，等.毛細(xì)管氣相色譜法測定果蔬食品中21種有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留量[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2010(1):88―90.