脲對Flt3配體包涵體蛋白質(zhì)體外復(fù)性與同時純化的作用研究

余秀娟，張如月，盧金銘

(1.河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口 075000；2.華北電力大學(xué)科技學(xué)院，河北 保定 071000)

脲對Flt3配體包涵體蛋白質(zhì)體外復(fù)性與同時純化的作用研究

余秀娟1，張如月1，盧金銘2

(1.河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口 075000；2.華北電力大學(xué)科技學(xué)院，河北 保定 071000)

目的研究小分子脲對包涵體蛋白質(zhì)體外復(fù)性與同時純化的作用。方法考察在高效疏水相互作用色譜(HPHIC)流動相中添加脲時，不同濃度的小分子脲對包涵體蛋白重組人酪氨酸激酶配體(recombined human Flt3 ligand,rhFL)復(fù)性效率的影響，并采用熒光光譜技術(shù)，進(jìn)一步研究目標(biāo)蛋白Flt3復(fù)性前后復(fù)性效果變化與熒光強度變化的規(guī)律。結(jié)果當(dāng)脲的添加濃度為3 mol·L-1時，rhFL的質(zhì)量回收率達(dá)到33.1%，更易于恢復(fù)其天然構(gòu)象及生物活性。結(jié)論添加適當(dāng)濃度的脲可促進(jìn)rhFL的復(fù)性與同時純化，通過熒光光譜技術(shù)可以初步推測包涵體蛋白在復(fù)性過程中生物活性的變化，為rhFL蛋白藥物的研發(fā)提供參考。

高效疏水相互作用色譜法；脲；Flt3配體；包涵體蛋白質(zhì)；體外復(fù)性

Flt3配體(Flt3 ligand，F(xiàn)L)是一類在骨髓基質(zhì)細(xì)胞和造血細(xì)胞中表達(dá)，刺激早期造血因子生長的具有很強協(xié)同作用的造血生長因子。人Flt3配體分子主要分布在初級淋巴細(xì)胞和次級淋巴細(xì)胞中[1-2]，由4個半胱氨酸殘基形成2個分子內(nèi)的二硫鍵，使整個分子折疊形成四螺旋的結(jié)構(gòu)域，每一個螺旋都由β-折疊相連接。經(jīng)探索，人們利用重組DNA技術(shù)在大腸桿菌(E.coil)中成功地表達(dá)了rhFL，發(fā)酵所得的產(chǎn)物主要以不溶的包涵體形式存在，通過對其氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果顯示rhFL具有自身的熒光性質(zhì)，可作為實驗的模型蛋白進(jìn)行研究。

在實際應(yīng)用中，包涵體可利用其不溶性及高度的致密性來促進(jìn)純化，但聚集形式的存在導(dǎo)致包涵體蛋白質(zhì)的復(fù)性難度增加。傳統(tǒng)的稀釋法可以降低高濃度蛋白的復(fù)性難度，有效降低蛋白的復(fù)性濃度，獲取少量蛋白質(zhì)的復(fù)性產(chǎn)物，但卻不能大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)，所以如何有效地解決E.coil中過度表達(dá)的包涵體產(chǎn)物的體外復(fù)性問題成為生產(chǎn)的關(guān)鍵單元[3]。近些年來，越來越多的包涵體蛋白質(zhì)采用液相色譜法(LC)進(jìn)行復(fù)性與同時純化并且獲得了成功，LC法具備能夠快速地除去變性劑、使復(fù)性蛋白質(zhì)易與錯誤蛋白分離、易于自動化和耗時少等優(yōu)點，達(dá)到了包涵體蛋白體外復(fù)性的技術(shù)要求[4]。

大量資料顯示，HPHIC作為一種理想的包涵體蛋白體外復(fù)性的液相色譜法，其流動相為鹽-水體系，該體系可使水化的變性蛋白瞬時失水，形成的局部結(jié)構(gòu)有利于變性蛋白的折疊，分辨率較高，為包涵體蛋白的復(fù)性過程提供了良好的折疊環(huán)境[5]。本實驗采用的HPHIC法，考察了在流動相中添加不同濃度的小分子脲時，對rhFL包涵體蛋白復(fù)性與同時純化效率的影響，通過熒光光譜技術(shù)，總結(jié)了目標(biāo)蛋白復(fù)性前后復(fù)性效果與熒光強度變化規(guī)律的關(guān)系，為rhFL蛋白藥物的研發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀LC-10A(島津，日本)；可變波長紫外可見光檢測器1PD-20AVP(島津，日本)；N2000色譜工作站(浙江大學(xué))；F-4500熒光光譜儀(日立，日本)；PB-10型pH計(Sartorius公司，德國)；SORVALL RC28S離心機(Sovall公司，美國)；UV-1700紫外可見分光光度計(島津，日本)；AUW220型分析天平(島津，日本)；國華THZ-82搖床(國華電器有限公司，蘇州)。

蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(marker)(分析純，美國Sigma公司)；二硫蘇糖醇(DTT)(分析純，Wolsen公司)；脲(urea)(分析純，Wolsen公司)；考馬氏亮藍(lán)R-250(電泳純，F(xiàn)luka公司)；考馬氏亮藍(lán)G-250(分析純，F(xiàn)luka進(jìn)口分裝)；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、硫酸銨(NH4)2SO4、溴酚藍(lán)、氯化鈉(NaCl)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)(均為國產(chǎn)分析純)。

1.2 色譜條件

流動相A：50 mmol·L-1KH2PO4，3.0 mol·L-1(NH4)2SO4，pH 7.0；流動相B：50 mmol·L-1KH2PO4，pH 7.0，過濾后使用。采用填料為硅膠基質(zhì)的HPHIC色譜餅(10 mm×20 mm I.D.)，配基為苯基型，填料的平均孔徑為30 nm，實驗室自行合成并裝填。在波長為280 nm和2.0 mL·min-1流速條件下，進(jìn)樣200 μL至已用100%流動相A平衡過的色譜餅上，再進(jìn)行30 min的線性梯度洗脫，直至流動相B液為100%，并持續(xù)洗脫15 min，使色譜餅再生，最后用100%流動相A液使色譜餅平衡，從而構(gòu)成一個完整的色譜過程。

1.3 FL蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)

1.3.1 種子液的制備

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主E.coli細(xì)胞獲得的工程菌，按2%(V/V)比例接種于LB培養(yǎng)基(含Amp+，100 μg·mL-1)中，在30 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)過夜。

1.3.2 搖瓶中菌種的培養(yǎng)

次日，按一定比例將種子液轉(zhuǎn)接于含有培養(yǎng)基(Amp+)的三角瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)至一定的細(xì)胞濃度(A600約為0.8)，加入IPTG(終濃度為0.6 mmol·L-1)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)若干個小時。

發(fā)酵所配試劑以及FL蛋白發(fā)酵培養(yǎng)的具體方法參見文獻(xiàn)[6]。

1.4 rhFL包涵體的回收與溶解

1.4.1 主要緩沖液的組成

緩沖液Ⅰ：20 mmol·L-1PBS，1 mmol·L-1EDTA-Na2，pH 7.4；緩沖液Ⅱ：1.0 mol·L-1脲，1 mmol·L-1EDTA-Na2，0.5 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1PBS，pH 7.4；包涵體的溶解液：8.0 mol·L-1脲，50 mmol·L-1DDT，1 mmol·L-1EDTA-Na2，pH 8.0。

1.4.2 rhFL包涵體的復(fù)性前預(yù)處理

稱取一定量的rhFL發(fā)酵產(chǎn)物，加入10 mL·g-1的緩沖液Ⅰ進(jìn)行洗滌。室溫下攪拌均勻，將得到的菌體置于冰水浴中超聲破碎，設(shè)定超聲破碎儀的能量不低于30%，破碎時間為30 min，每破碎7.0 s，停7.0 s。再在溫度為4 ℃、轉(zhuǎn)速為10 000 rpm的條件下離心20 min，棄去上清液，收集沉淀部分，即為rhFL包涵體。

獲得的rhFL包涵體中加入10 mL·g-1的緩沖液Ⅱ，室溫下攪拌約30 min。在溫度為4 ℃、轉(zhuǎn)速為10 000 rpm的條件下離心20 min，棄去上清液，收集沉淀部分。反復(fù)用緩沖液Ⅰ洗滌一次、緩沖液Ⅱ洗滌兩次，在溫度為4 ℃、轉(zhuǎn)速為10 000 rpm的條件下離心20 min，棄去上清液，獲得初步純化的rhFL包涵體蛋白質(zhì)。

1.4.3 包涵體的溶解

向獲得的初步純化的rhFL中加入10 mL·g-1的包涵體溶解液，置于溫度為4 ℃的冰箱中12 h以上。再在溫度為4 ℃、轉(zhuǎn)速為12 000 rpm條件下離心20 min，上清液即為實驗所需的rhFL變性抽提液，置于溫度為4 ℃的冰箱中保存，用于后續(xù)蛋白的復(fù)性研究。

1.5 分析與鑒定rhFL復(fù)性與同時純化的效果

1.5.1 rhFL的質(zhì)量回收率

采用Bradford法測定從HPHIC色譜餅收集的色譜餾分中的蛋白質(zhì)含量，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，目標(biāo)蛋白質(zhì)量回收率計算見文獻(xiàn)[6]。

1.5.2 rhFL的熒光光譜分析

將色譜餾分收樣得到的各目標(biāo)蛋白餾分采用熒光光譜儀進(jìn)行熒光光譜的測定。激發(fā)波長為280 nm，掃描速率1200 nm·min-1，激發(fā)光和發(fā)射光的狹縫寬度均5 nm。測定各復(fù)性條件下的熒光發(fā)射光譜圖。

2 結(jié) 果

基因在E.coli中高效表達(dá)得到的是錯誤折疊的包涵體蛋白且大多不具有生物活性。本實驗所用的rhFL包涵體蛋白也是E.coli中高效表達(dá)得到的，且主要以不可溶和無活性的形式存在。為得到正確折疊的蛋白質(zhì)，必須進(jìn)行包涵體蛋白的體外輔助復(fù)性[7]。實驗采用固定相以苯基為配基的分析型色譜餅，并在色譜流動相中添加小分子脲進(jìn)行rhFL的復(fù)性與同時純化。圖1是在流動相中添加0～4.0 mol·L-1脲時HPHIC色譜餅上復(fù)性與同時純化rhFL包涵體的色譜圖。圖1顯示，隨著流動相中脲濃度的增加，色譜峰逐漸升高，當(dāng)脲濃度為3.0 mol·L-1時，色譜峰的變化最大，之后逐漸平緩。

圖1 不同脲濃度時rhFL HPHIC復(fù)性與純化的色譜圖(為目標(biāo)峰)

色譜條件：流動相A:3.0 mol·L-1(NH4)2SO4,0～4.0 mol·L-1urea,50 mmol·L-1KH2PO4(pH 7.0);流動相B:0～4.0 mol·L-1urea,50 mmol·L-1KH2PO4(pH 7.0);流速:2.0 mL·min-1;進(jìn)樣體積:200 μL。

出峰順序：Line 1:0 mol·L-1urea;Line 2:1.0 mol·L-1urea;Line 3:2.0 mmol·L-1urea;Line 4:3.0 mol·L-1urea;Line 5:4.0 mol·L-1urea。

收集不同脲濃度下目標(biāo)峰的色譜餾分，測定其蛋白質(zhì)含量并計算質(zhì)量回收率(圖2)。圖2顯示，當(dāng)脲濃度為3.0 mol·L-1時，質(zhì)量回收率最高可達(dá)33.1%。根據(jù)變性蛋白質(zhì)的各異性，添加適當(dāng)濃度的脲利于變性蛋白向天然態(tài)構(gòu)象折疊。

圖2 不同脲濃度時rhFL HPHIC復(fù)性與純化的質(zhì)量回收率

對色譜餅上復(fù)性與同時純化的目標(biāo)餾分進(jìn)行構(gòu)象變化的進(jìn)一步熒光光譜表征(圖3)。當(dāng)添加的脲濃度為3.0 mol·L-1時，熒光強度最低，說明此時目標(biāo)蛋白質(zhì)的構(gòu)象最接近其天然態(tài)的構(gòu)象，該結(jié)果與其獲得的質(zhì)量回收率結(jié)果一致。因此，在流動相中添加適當(dāng)濃度的脲可以促進(jìn)rhFL色譜法的復(fù)性與純化，其色譜峰的變化、質(zhì)量回收率的提高和熒光強度的改變，均可說明添加3.0 mol·L-1脲時更適合目標(biāo)蛋白的復(fù)性。

圖3 不同濃度L-Arg時rhFL HPHIC復(fù)性與純化的熒光光譜變化

出峰順序：Line 1:0 mol·L-1urea;Line 2:1.0 mol·L-1urea;Line 3:2.0 mmol·L-1urea;Line 4:4.0 mol·L-1urea;Line 5:3.0 mol·L-1urea。

3 討 論

本實驗采用HPHIC法，考察了在流動相中添加不同濃度的小分子脲對rhFL包涵體蛋白復(fù)性與同時純化效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 mol·L-1的脲濃度為最佳結(jié)果，rhFL的質(zhì)量回收率可達(dá)33.1%，易于恢復(fù)目標(biāo)蛋白的天然構(gòu)象及生物活性。利用熒光光譜技術(shù)，對比完全變性時和復(fù)性后蛋白的熒光強度，若復(fù)性后蛋白的熒光強度降低，說明此時蛋白的構(gòu)象發(fā)生了轉(zhuǎn)變，在一定程度上變性蛋白得到了復(fù)性。利用得到的質(zhì)量回收率與熒光強度的變化關(guān)系，可以初步推測包涵體蛋白質(zhì)在復(fù)性過程中生物活性的變化，為rhFL蛋白質(zhì)藥物的研發(fā)提供了參考。

[1] DAMDINSUREN A,MATSUSHITA H,ITO M,et al.FLT3-ITD drives Ara-C resistance in leukemic cells via the induction of RUNX3[J].Leuke Res,2015,39(12):1405-1413.

[2] MCCLANAHAN T,CULPEPPER J,CAMPBELL D,et al.Biochemical and genetic characterization of multiple splice variants of the Flt3 ligand[J].Blood,1996,88(9):3371-3382.

[3] ZHANG Y L,CHEN S S,YANG K G,et al.Expression of nattokinase inEscherichiacoliand renaturation of its inclusion body[J].J Biotech,2016(231):65-71.

[4] VEMULA S,DEDANIYA A,THUNUGUNTLA R,et al.Simplified in vitro refolding and purification of recombinant human granulocyte colony stimulating factor using protein folding cation exchange chromatography[J].J Chromat A,2015,1379(11):74.

[5] BAUMGARTNER K,GRO HANS S,SCHüTZ J,et al.Prediction of salt effects on protein phase behavior by HIC retention and thermal stability[J].J Pharma Biomed Analy,2016,128:216-225.

[6] JIA J.Refolding and simultaneous purification of the recombinant human Flt3 ligand by protein folding liquid chromatography[D].Xi’an:Northwest University,2010.

[7] 王驪麗,耿信篤.源于大腸桿菌蛋白的表達(dá)、液相色譜復(fù)性與純化新進(jìn)展[J].中國科學(xué)B輯:化學(xué),2009,39(8):711-727.

來稿日期：2017-05-16

張家口市科學(xué)技術(shù)和地震局項目(No.1521001A)，河北北方學(xué)院青年課題項目(No.Q2014022)

余秀娟(1984-)，女，河北張家口人，講師，2016級博士，主要研究方向為蛋白藥物的制備及其分離與純化。

Q 78

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2017.12.003

李薊龍]