通心方對冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響

劉 征，馮其茂,董耀榮,樊 俊

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院,上海 200071)

通心方對冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響

劉 征1，馮其茂2,董耀榮2,樊 俊2

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院,上海 200071)

目的探討通心方治療冠心病患者療效及對外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)數(shù)量、功能的影響。方法將48例冠心病患者隨機(jī)分成對照組和治療組，每組24例。對照組在西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上加服麝香保心丸，治療組在西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上加服通心方，2組療程均為3個月。觀察2組治療前后外周血EPCs數(shù)量、功能的變化，統(tǒng)計2組臨床療效。結(jié)果治療3個月后，2組EPCs數(shù)量均明顯高于治療前(P均<0.05)，且治療組明顯高于對照組(P<0.05)。對照組EPCs增殖活力OD值從治療第4天開始明顯高于治療前(P<0.05)；治療組EPCs增殖活力OD值于治療第1天開始明顯高于治療前(P<0.05)，從第5天開始出現(xiàn)對數(shù)增殖期，且第5—7天明顯高于對照組(P均<0.05)。治療組總有效率明顯高于對照組(P<0.05)。結(jié)論通心方能刺激冠心病患者骨髓釋放更多的EPCs到外周血，能顯著提高外周血EPCs的增殖能力，改善患者臨床癥狀，其效果優(yōu)于麝香保心丸。

通心方；冠心病；內(nèi)皮祖細(xì)胞

冠心病(CHD)是指由于冠狀動脈粥樣硬化，導(dǎo)致血管發(fā)生狹窄或阻塞，從而致使心肌缺氧缺血甚至壞死而發(fā)生一系列臨床表現(xiàn)的病癥。血管內(nèi)皮損傷是冠心病發(fā)生的病理生理基礎(chǔ),被認(rèn)為是動脈粥樣硬化形成的早期環(huán)節(jié),損傷的血管內(nèi)皮周邊趨化炎性細(xì)胞,造成血管壁硬化及狹窄,進(jìn)一步造成血管內(nèi)皮修復(fù)障礙。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)作為一種干細(xì)胞，在一定的條件下可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有促進(jìn)缺血組織血管再生和血管內(nèi)皮化，抑制血栓形成和冠狀動脈支架植入后再狹窄的作用[1]，但EPCs移植治療冠心病的效果卻不理想[2]。本課題組早期臨床研究證實(shí)，通心方能顯著改善冠心病患者的側(cè)支循環(huán)和射血分?jǐn)?shù)[3]，能改善冠心病嚴(yán)重三支病變患者的心室重構(gòu)和心室舒張功能[4]，對于廣泛彌漫性病變、失去介入和搭橋機(jī)會的嚴(yán)重冠心病患者顯示出較好臨床療效。本研究進(jìn)一步觀察了通心方對冠心病患者外周血EPCs數(shù)量及功能的影響，旨在探討該方治療冠心病的可能作用機(jī)制。

1 臨床資料

1.1一般資料 收集2015年7月—2016年10月就診于上海市中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科和急診科的冠心病患者48例，年齡40～95歲，均經(jīng)冠狀動脈造影確診(至少1支血管狹窄>50%)，經(jīng)心內(nèi)科、心外科診斷不適合進(jìn)行冠脈支架植入術(shù)和冠脈搭橋術(shù)，或患者及家屬放棄行冠脈支架植入術(shù)和冠脈搭橋術(shù)。中醫(yī)辨證為氣虛血瘀證，氣虛主癥為神疲乏力、心悸氣短、面色少華，血瘀主癥為胸部固定刺痛、舌質(zhì)紫暗[5-6]。排除年齡40歲以下或95歲以上者；心功能Ⅳ級或肺水腫者；嚴(yán)重肝腎功能不全者；對中藥過敏者；伴發(fā)惡性疾病、嚴(yán)重炎性疾病、出血性疾病者；惡性心律失常、急性冠脈綜合征、不穩(wěn)定型心絞痛者；妊娠或哺乳期婦女；老年癡呆者?；颊呒凹覍僭敢夂献?，且研究經(jīng)上海市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會通過。采用隨機(jī)分組的方式將入選者隨機(jī)分成對照組和治療組，每組24例，2組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。

表1 2組一般資料比較

1.2治療方法 2組患者均根據(jù)病情給予血小板抑制劑、硝酸酯類、β受體阻滯劑、他汀類藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、鈣離子阻滯劑等常規(guī)治療。在常規(guī)治療基礎(chǔ)上，治療組給予通心方治療，組方：黃芪30 g、川芎12 g、桃仁15 g、地鱉蟲12 g、三棱15 g、牡蠣40 g、桂枝12 g、枳殼12 g、夏枯草12 g，每日1劑,由上海市中醫(yī)醫(yī)院制劑科制成水煎劑,分2次口服，每次150 mL；對照組給予麝香保心丸(上海和黃藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字 Z31020068)口服，每次2粒，每日3次。2組療程均為3個月。

1.3檢測指標(biāo)及方法

1.3.1EPCs數(shù)量 參照文獻(xiàn)[7]方法，采用密度梯度離心法從人外周血提取單個核細(xì)胞，用體外誘導(dǎo)方式進(jìn)行培養(yǎng)。具體方法：分別于治療前后取2組患者外周靜脈血8 mL，經(jīng)抗凝后，加入淋巴細(xì)胞分離液，在室溫下，以300 g離心30 min。取中層細(xì)胞分層液與血漿交界部位混濁的灰白色層獲取單個核細(xì)胞。將獲取的單個核細(xì)胞懸液用Hank's 液洗滌2 次，1 500 r/min 在室溫下離心5 min，吸取上清，加入含10%胎牛血清、ECGS 100 mg/L的RPMI-1640 培養(yǎng)液。以(2～3)×106個/mL密度重懸單個核細(xì)胞于預(yù)先準(zhǔn)備好的纖維連接蛋白包被的6孔板，每孔2 mL。置于5%CO2、37 ℃孵育箱中培養(yǎng),每隔3 d更換1次含胎牛血清和ECGS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)至第14天收集貼壁EPCs細(xì)胞。將收集的EPCs細(xì)胞計數(shù)后用PBS溶液稀釋，調(diào)整待檢測細(xì)胞濃度為106個/mL,分別重懸于A、B兩管中。A管為陰性對照管只加100 μL細(xì)胞懸液，B管加入100 μL細(xì)胞懸液、FITC標(biāo)記的CD34(20 μL)、PE標(biāo)記的VEGF-2(20 μL)、PE-CY5標(biāo)記的CD45(20 μL)。4 ℃避光孵育1 h。孵育結(jié)束后所有檢測管進(jìn)行離心(1 000 r/min,10 min)，棄上清，沉淀用400 μL PBS重懸，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。分析每10 000個細(xì)胞中以 CD34陽性、VEGF-2陽性、CD45陰性標(biāo)記細(xì)胞的百分比作為EPCs占外周血中有核細(xì)胞的百分比。

1.3.2EPCs增殖能力 將培養(yǎng)14 d的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，制成(1～5)×104個/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，設(shè)3個復(fù)孔，設(shè)一空白對照孔，置于5%CO2、37 ℃孵育箱。每天取1 板，檢測EPCs增殖能力，連續(xù)7 d。具體方法：將Cell Counting Kit-8(CCK-8)和無血清必需基本培養(yǎng)基按1:10體積混合，每孔100 μL加入待測孔中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長吸光度，記錄每塊板的OD值，繪制生長曲線。

1.3.3臨床療效 根據(jù)中醫(yī)證候積分計算療效指數(shù)[(治療前積分-治療后積分)/治療前積分×100%]，根據(jù)療效指數(shù)評定療效。顯效：70%≤療效指數(shù)<90%；有效：30%≤療效指數(shù)<70%；無效：療效指數(shù)<30%。顯效+有效為總有效。

2 結(jié) 果

2.12組治療前后EPCs數(shù)量比較 2組治療前EPCs數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療3個月后，2組EPCs數(shù)量均明顯高于治療前(P均<0.05)，且治療組的EPCs數(shù)量明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 2組治療前后EPCs數(shù)量比較%)

注：①與治療前比較，P<0.05；②與對照組比較，P<0.05。

2.22組治療前后EPCs增殖能力及生長曲線比較2組治療前EPCs增殖活力均低下，OD值呈緩慢上升趨勢，2組各時間段 OD值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。對照組EPCs增殖活力OD值從治療第4天開始明顯高于治療前(P<0.05)；治療組EPCs增殖活力OD值于治療第1天開始明顯高于治療前(P<0.05)，從第5天開始出現(xiàn)對數(shù)增殖期，且第5—7天明顯高于對照組(P均<0.05)。見表3及圖1。

表3 2組治療前后EPCs增殖能力比較

注:①與治療前比較，P<0.05；②與對照組比較，P<0.05。

圖1 2組治療前后EPCs生長曲線比較

2.32組臨床療效比較 對照組顯效3例，有效12例，無效9例，總有效率63%；治療組顯效8例，有效14例，無效2例，總有效率92%。治療組總有效率明顯高于對照組(P<0.05)。

3 討 論

冠狀動脈搭橋術(shù)、經(jīng)皮冠脈球囊擴(kuò)張術(shù)和支架植入術(shù)已經(jīng)成為冠心病和急性心肌梗死的主要治療手段，但仍有30%的嚴(yán)重冠脈病變?nèi)玳]塞病變、彌漫病變、三支血管病變、嚴(yán)重鈣化、嚴(yán)重血管扭曲等患者不適合冠脈搭橋術(shù)和介入治療，或因各種原因不愿意手術(shù)或支架植入。因此重建血管內(nèi)皮功能、增強(qiáng)EPCs內(nèi)皮修復(fù)功能成為防治心血管損傷性疾病的全球研究熱點(diǎn)。

EPCs大量存在于骨髓及臍血中，僅少量釋放到外周血。當(dāng)內(nèi)皮功能受到損傷時，能刺激骨髓釋放大量EPCs到外周血,并能定向遷移到受損血管內(nèi)皮處，對損傷的血管內(nèi)皮進(jìn)行修復(fù)[8]，分泌促血管生長因子促進(jìn)局部缺血灶血管新生。冠心病患者外周血中 EPCs數(shù)量減少,EPCs功能低下,提示EPCs修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮能力降低[9-10]。另外EPCs的數(shù)量與心血管疾病致死風(fēng)險呈負(fù)相關(guān)，檢測EPCs數(shù)量可用于預(yù)測心血管事件的發(fā)生[11]。然而EPCs移植治療冠心病的效果卻不理想，分析原因可能為受體心肌對治療不接受，被注射到心臟局部細(xì)胞在局部停留短暫，很快被遷移到肺、脾和其他器官，停留于局部的細(xì)胞通常死亡，局部存活的細(xì)胞不能與原有心肌細(xì)胞協(xié)調(diào)起作用[2]。

近年來,祖國醫(yī)學(xué)通過抑制血管炎癥、重建血管內(nèi)皮功能、促進(jìn)血管新生等途徑(即所謂的藥物搭橋)治療冠心病取得了一定進(jìn)展[12-14]。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為冠心病屬于“胸痹心痛病”范疇,其病機(jī)復(fù)雜多變，概括為寒凝、氣滯、血瘀、氣虛、痰濁、陰陽俱損，其中氣虛血瘀是冠心病最為常見的病機(jī)。麝香保心丸即根據(jù)該病機(jī)所研制，且臨床證實(shí)其能夠促進(jìn)冠心病患者EPCs的動員過程，機(jī)制可能與麝香保心丸改善患者的血管內(nèi)皮功能，增加NO的合成有關(guān)[15]。故本研究選擇麝香保心丸作為對照藥物。而本課題組在多年臨床實(shí)踐和研究的基礎(chǔ)上, 結(jié)合冠心病具有“久病入絡(luò),久病必瘀,久病傷氣”的特點(diǎn),提出“活血通絡(luò)、益氣通陽”論治冠心病的觀點(diǎn)，創(chuàng)制了通心方。方中黃芪、川芎、桂枝益氣行血、溫通心陽,桃仁、地鱉蟲、牡蠣、三棱活血破血，夏枯草軟堅散結(jié)，枳殼理氣寬中，以氣行血，加強(qiáng)活血通絡(luò)之功,諸藥合用共奏益氣活血通絡(luò)、溫通心陽之功效,標(biāo)本兼顧?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)黃芪具有明顯正性肌力作用，能保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移與增生,具有促進(jìn)側(cè)支循環(huán)生成、加速梗死灶愈合的作用[16]。黃芪的主要有效成分黃芪甲苷可增加體外培養(yǎng)的EPCs數(shù)量，改善EPCs增殖、遷移、黏附和體外血管生成能力[17]。川芎的主要成分川芎嗪具有提高機(jī)體內(nèi)NO水平和降低ET-1水平，從而保護(hù)損傷的血管內(nèi)皮功能作用，而完整的血管內(nèi)皮功能可促進(jìn)EPCs、VEGF、FGF等多種促血管生成因子釋放[18]。桃仁、地鱉蟲、牡蠣可以調(diào)節(jié)血脂，改善高膽固醇血癥[19-21]。夏枯草具有一定的抗炎及擴(kuò)張血管,增加冠脈血流的作用[22]。

骨髓中 EPCs表面標(biāo)記有3種，即CD133、CD34和VEGFR-2,而外周血中EPCs提取培養(yǎng)后分化成熟，CD133表達(dá)逐漸減少甚至缺失，但繼續(xù)表達(dá)CD34和VEGFR-2[23]；CD45則是白細(xì)胞的表面標(biāo)記物，在EPCs中基本不表達(dá)。因此,本實(shí)驗(yàn)以表達(dá)CD34和VEGFR-2雙陽性并且CD45表達(dá)陰性的細(xì)胞鑒定為EPCs。結(jié)果顯示，治療3個月后，2組EPCs數(shù)量均明顯升高，且治療組明顯高于對照組；2組治療前EPCs增殖上升緩慢、無對數(shù)上升期，提示EPCs活力低下；對照組EPCs增殖活力OD值從治療第4天開始明顯高于治療前；治療組EPCs增殖活力OD值于治療第1天開始明顯高于治療前，從第5天開始出現(xiàn)對數(shù)增殖期，且第5-7天明顯高于對照組；治療組總有效率明顯高于對照組。說明通心方可刺激冠心病患者骨髓釋放更多的EPCs到外周血，能顯著提高外周血EPCs的增殖能力，引導(dǎo)EPCs歸巢到缺血心肌區(qū)修復(fù)損傷血管內(nèi)皮，改善缺血灶的血管內(nèi)皮功能，促進(jìn)釋放促血管生成因子，加速建立側(cè)支循環(huán)為缺血心肌提供血供，進(jìn)而改善患者的心功能及臨床癥狀，且效果優(yōu)于麝香保心丸，值得臨床推廣使用。

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EffectofTongxinprescriptionontheendothelialprogenitorcellsinperipheralbloodofpatientswithcoronaryheartdisease

LIU Zheng1, FENG Qimao2, DONG Yaorong2, FAN Jun2

(1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203; 2. Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200071)

ObjectiveIt is to investigate the curative effect of Tongxin Prescription on the number and function of endothelial progenitor cells in peripheral blood of patients with coronary heart disease.MethodsForty-eight patients with coronary heart disease were randomly divided into control group and treatment group, each group had 24 cases. The control group was treated with normal western medicine combined with Shexiang Baoxin Pill, while the treatment group was treated with normal western medicine combined with Tongxin prescription. Both groups were treated for 3 months. The clinical efficacy was evaluated,the changes of the number and function of endothelial progenitor cells in peripheral blood were observed before and after treatment in the two groups.ResultsAfter three months of treatment, the number of endothelial progenitor cells in the two groups was higher than that before treatment, the number of endothelial progenitor cells in the treatment group was significantly higher than that in the control group (P<0.05). The OD of proliferation ability of endothelial progenitor cells from the fourth day was significantly higher than that before treatment in the control group (P<0.05), and the OD from the first day was significantly higher than that before treatment in the treatment group (P<0.05), furthermore,logarithm phase occurred from the fifth day, and the OD was higher in the treatment group than that in the control group from fifth to seventh day (P<0.05). The total effective rate in the treatment group was obviously higher than that in the control group (P<0.05).ConclusionTongxin Prescription can stimulate the bone marrow to release more endothelial progenitor cells to the periphery, significantly enhance the proliferation ability of peripheral blood cells and improve the clinical symptoms in the patients with coronary heart disease, its effect is better than that of Shexiang Baoxin pill.

Tongxin Prescription; coronary heart disease; endothelial progenitor cells

10.3969/j.issn.1008-8849.2018.01.002

R541.4

A

1008-8849(2018)01-0005-05

劉征，女，博士研究生在讀，研究方向?yàn)樾难軆?nèi)科疾病診治。

馮其茂，E-mail：fenqimao@126.com

上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(13ZR1439900)；中國博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2014M550131)

2017-02-15