髓核組織高溫相關(guān)絲氨酸蛋白酶A1表達水平與椎間盤退變程度的相關(guān)性

李大鵬，吳 燕，岳佳偉，孫繼芾，王家倫，黃永輝

1江蘇大學(xué) 附屬醫(yī)院骨外科，江蘇鎮(zhèn)江 212001 2江蘇大學(xué) 醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，江蘇鎮(zhèn)江 212013

·論著·

髓核組織高溫相關(guān)絲氨酸蛋白酶A1表達水平與椎間盤退變程度的相關(guān)性

李大鵬1，吳 燕2，岳佳偉2，孫繼芾1，王家倫2，黃永輝1

1江蘇大學(xué) 附屬醫(yī)院骨外科，江蘇鎮(zhèn)江 2120012江蘇大學(xué) 醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，江蘇鎮(zhèn)江 212013

目的分析髓核組織高溫相關(guān)絲氨酸蛋白酶A1(HtrA1)的表達水平與椎間盤退變程度(Pfirrmann分級)的相關(guān)性。方法36例需手術(shù)摘除髓核組織的患者，術(shù)前行磁共振成像檢查，據(jù)矢狀位T2加權(quán)相磁共振對擬手術(shù)節(jié)段予Pfirrmann分級；采用逆轉(zhuǎn)錄PCR及Western blot方法檢測髓核組織中HtrA1的mRNA及蛋白表達水平，對髓核組織HtrA1的表達水平與Pfirrmann等級進行相關(guān)性分析。結(jié)果36例椎間盤經(jīng)磁共振成像檢查，Pfirrmann Ⅰ級3例、Ⅱ級10例、Ⅲ級11例、Ⅳ級7例、Ⅴ級5例；髓核組織HtrA1 mRNA及蛋白表達水平隨Pfirrmann等級增高而增加，經(jīng)Bonferroni檢驗，除Ⅳ、Ⅴ級間外(P>0.05)，余各級間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析：HtrA1 mRNA及蛋白表達水平與Pfirrmann分級間存在秩相關(guān)關(guān)系(P<0.000 1)。結(jié)論髓核組織HtrA1 mRNA及蛋白表達水平隨Pfirrmann等級增高而升高，提示HtrA1與椎間盤退變程度存在相關(guān)性。

椎間盤退變；髓核；磁共振成像；Pfirrmann分級

下腰痛是脊柱外科臨床上一個常見的問題，約80%的人在其一生中會出現(xiàn)下腰痛的表現(xiàn)[1- 2]，其最常見原因是腰椎間盤退變[3]，椎間盤退變始于髓核，髓核細胞數(shù)量減少及功能降低，導(dǎo)致聚集蛋白聚糖、Ⅱ型膠原等細胞外基質(zhì)合成減少及降解加快，進而導(dǎo)致髓核組織脫水、裂隙形成、凝膠狀態(tài)的消失[4- 5]。椎間盤退變程度常采用磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)Pfirrmann分級[6- 7]進行評估，Pfirrmann分級綜合評估髓核、纖維環(huán)信號強度及椎間盤高度等因素，退變程度由輕到重分為Ⅰ～Ⅴ級。高溫相關(guān)絲氨酸蛋白酶A1(high temperature requirement serine protease A1，HtrA1)是一種具有熱休克蛋白性質(zhì)的膜絲氨酸蛋白酶，有研究顯示HtrA1在骨性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)軟骨組織表達升高，能促進軟骨基質(zhì)的降解[8- 9]，另有研究顯示HtrA1能促進椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展[10]，但HtrA1的表達水平與椎間盤退變程度的相關(guān)性研究較少。因此，本研究主要分析髓核組織HtrA1的表達水平與椎間盤Pfirrmann等級的相關(guān)性。

資料和方法

髓核組織來源2015年7月至2016年6月，江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院骨外科36例住院患者需手術(shù)取出椎間盤髓核組織，其中男性21例、女性15例；年齡18～80歲，平均(59.6±13.1)歲；手術(shù)節(jié)段：L1/2椎間盤 2例、L2/3椎間盤1例、L3/4椎間盤4例、L4/5椎間盤18例、L5/S1椎間盤11例。診斷：3例患者為腰椎爆裂性骨折，余33例患者為椎間盤退變性疾病(椎間盤突出、椎管狹窄等)，均排除椎間隙感染、結(jié)核、腫瘤等疾病。本研究已經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，并與患者簽訂知情同意書。

材料Trizol(Invitrogen公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo公司)、PCR擴增試劑盒(Promega公司)、DNA Marker(TaKaRa公司)、HtrA1引物(上海生工生物工程有限公司)、β-actin引物(上海生工生物工程有限公司)、細胞裂解液(南通碧云天生物技術(shù)研究所)、HtrA1抗體(Santa Cruz公司)、β-actin抗體(Santa Cruz公司)、羊抗兔二抗(Rockland公司)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(南通碧云天生物技術(shù)研究所)、辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(Millipore公司)、蛋白Marker(Invitrogen公司)、聚偏二氟乙烯膜(Roche公司)。

MRI檢查36例患者術(shù)前均行MRI檢查，常規(guī)腰椎矢狀位T2加權(quán)相參數(shù)：快速自旋回波序列：重復(fù)時間3500 ms，回波時間99.0 ms，層厚 4.0 mm，層數(shù)11，視野280 mm。2名脊柱外科醫(yī)師各自獨立對擬手術(shù)節(jié)段椎間盤進行Pfirrmann分級(圖1)，當(dāng)分級結(jié)果不一致時，由2名專家共同討論取得一致意見。

逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測髓核組織HtrA1mRNA水平髓核組織取出后，眼科剪仔細將內(nèi)層纖維環(huán)組織去除，沖洗去除血污，將組織剪碎，液氮研磨，加入1 ml Trizol提取RNA；嚴格按試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；cDNA行PCR擴增，引物序列見表1，反應(yīng)條件如下：HtrA1：94℃ 3 min；94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)；72℃ 7 min。β-actin：94℃ 3 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 45 s，30個循環(huán)；72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，0.5 μg/ml EB DNA染液染色，采集圖像后，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)分析條帶，得到所檢測目的基因的像素強度值。

A.Pfirrmann Ⅰ 級(箭頭)；B.Pfirrmann Ⅱ 級(箭頭)；C.Pfirrmann Ⅲ 級(箭頭)；D.Pfirrmann Ⅳ 級(箭頭)；E.Pfirrmann Ⅴ 級(箭頭)

A.Pfirrmann grade Ⅰ(arrow)；B.Pfirrmann grade Ⅱ(arrow)；C.Pfirrmann grade Ⅲ(arrow)；D.Pfirrmann grade Ⅳ(arrow)；E.Pfirrmann grade Ⅴ(arrow)

圖1矢狀位磁共振成像T2加權(quán)相Pfirrmann分級

Fig1Pfirrmann grading according to the sagittal T2 weighted magnetic resonance imaging

表 1 逆轉(zhuǎn)錄PCR相關(guān)基因引物及大小Table 1 Sequences of primers used in reverse transcription-polymerase chain reaction

HtrA1：高溫相關(guān)絲氨酸蛋白酶A1

HtrA1：high temperature requirement serine protease A1

Westernblot檢測髓核組織HtrA1蛋白水平髓核組織取出后，眼科剪仔細將內(nèi)層纖維環(huán)組織去除，沖洗去除血污，將組織剪碎，細胞裂解液提取總蛋白，測定蛋白濃度，蛋白樣品置于1.5 ml EP管中，加入等體積2×上樣緩沖液，煮沸5 min；10%丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，聚偏二氟乙烯膜Tris HCl緩沖鹽溶液/吐溫20漂洗，3%牛血清白蛋白封閉，兔抗HtrA1抗體(1∶ 200)4 ℃孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG (1∶ 10 000)室溫孵育1 h，加入HRP發(fā)光底物，成像分析系統(tǒng)成像并分析光密度值。

統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SAS 10.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，計算Kappa統(tǒng)計量評價兩名閱片者閱片結(jié)果的一致性；髓核組織HtrA1 mRNA及蛋白表達水平與Pfirrmann等級的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析；各Pfirrmann等級組間HtrA1表達水平差異比較采用ANOVA方差分析，各組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

MRI結(jié)果36例椎間盤術(shù)前MRI檢查結(jié)果：Pfirrmann Ⅰ級3例、Ⅱ級10例、Ⅲ級11例、Ⅳ級7例、Ⅴ級5例，經(jīng)Kappa檢驗，兩名閱片者閱片結(jié)果具有極佳一致性(k=0.832)。

髓核組織HtrA1mRNA表達水平與Pfirrmann等級的相關(guān)性髓核組織HtrA1 mRNA表達水平隨Pfirrmann等級增高而增加，經(jīng)ANOVA方差分析，各等級mRNA表達水平不全等或全不等(F=97.51，P<0.0001)；經(jīng)Bonferroni檢驗，除Ⅳ、Ⅴ級間外(P>0.05)，余各級間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)(圖2、3)。經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，HtrA1 mRNA表達水平與Pfirrmann分級間存在秩相關(guān)關(guān)系(P<0.000 1，相關(guān)系數(shù)rs=0.935 96)(圖3)。

髓核組織HtrA1蛋白表達水平與Pfirrmann等級的相關(guān)性髓核組織HtrA1蛋白表達水平隨Pfirrmann等級增高而增加，經(jīng)ANOVA方差分析，各等級mRNA表達水平間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=52.37，P<0.000 1)；經(jīng)Bonferroni檢驗，除IV、V級間外(P>0.05)，余各級間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)(圖4、5)。經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，HtrA1蛋白表達水平與Pfirrmann分級間存在秩相關(guān)關(guān)系(P<0.000 1，相關(guān)系數(shù)rs=0.941 13)(圖5)。

討 論

椎間盤由外層的纖維環(huán)、中央的髓核以及上下軟骨終板組成[11]，椎間盤退變過程中，髓核組織中聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原合成減少而降解加快，導(dǎo)致髓核內(nèi)水含量減少，并逐漸失去原有的凝膠樣形態(tài)，髓核纖維化并逐漸與纖維環(huán)分界不清，髓核凝膠狀態(tài)的消失使其緩沖負荷的能力下降，進而出現(xiàn)纖維環(huán)撕裂、椎間盤高度下降等病理改變。椎間盤退變病理過程中，髓核組織的結(jié)構(gòu)、功能的改變占主導(dǎo)及關(guān)鍵地位[11]，因此，本研究選擇髓核而非纖維環(huán)、終板作為研究對象。

圖2Pfirrmann各級HtrA1 mRNA表達水平

Fig2The mRNA expression of HtrA1 in different Pfirrmann grade groups

aP=0.014 9；bP<0.000 1；cP<0.0001

圖3HtrA1 mRNA表達水平與Pfirrmann等級的相關(guān)性

Fig3Correlation between mRNA expression of HtrA1 and Pfirrmann grade

Mr：相對分子質(zhì)量

Mr：relative molecular mass

圖4Pfirrmann各級HtrA1蛋白表達水平

Fig4Protein expression of HtrA1 in different Pfirrmann grade groups

aP=0.0160；bP<0.0001；cP<0.0001

圖5HtrA1蛋白表達水平與Pfirrmann等級的相關(guān)性

Fig5Correlation between protein expression of HtrA1 and Pfirrmann grade

MRI是評價椎間盤退變程度應(yīng)用最為廣泛、最為精準的檢查手段之一，能夠反應(yīng)椎間盤的水含量及形態(tài)學(xué)上的變化[12]。Pfirrmann等[13]根據(jù)MRI T2加權(quán)相上髓核信號強度、纖維環(huán)信號強度、髓核與纖維環(huán)界限、椎間盤高度等因素，將椎間盤退變分為Ⅰ～Ⅴ級，有研究顯示Pfirrmann分級能夠反應(yīng)髓核組織在細胞水平的退變程度[14]，也有學(xué)者采用改良Thompson分級等其他方法評估椎間盤退變程度[15]，但是Pfirrmann分級評價椎間盤退變具有較高的可靠性[16- 17]，目前已成為評價椎間盤退變最常用的方法[18]，因此，本研究采用Pfirrmann分級評價椎間盤退變程度。

HtrA1最初在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)[19]，C端為HtrA家族特有的高度保守的胰酶樣催化區(qū)域和PDZ區(qū)域，N端為胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白區(qū)域和Kazal類型蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域[20]。有研究顯示，HtrA1在骨性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達升高，能促進軟骨基質(zhì)的降解，提示HtrA1在關(guān)節(jié)退變中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[8- 9]。另外，日本學(xué)者研究認為HtrA1啟動子內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性與椎間盤退變相關(guān)，沒有G等位基因的人群更容易出現(xiàn)椎間盤退變[21]，由此看來，HtrA1在椎間盤退變的病理過程中可能發(fā)揮著重要作用。

本研究提取髓核組織總RNA及總蛋白，在基因及蛋白水平檢測不同退變程度的椎間盤髓核組織中HtrA1表達的差異，結(jié)果顯示髓核組織HtrA1 mRNA及蛋白表達水平隨Pfirrmann等級增高而增加，除Pfirrmann Ⅳ、Ⅴ級間外，余各級間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示HtrA1與椎間盤退變程度存在相關(guān)性，退變越嚴重，HtrA1的表達越高，可能與椎間盤內(nèi)細胞外基質(zhì)的降解有關(guān)，后續(xù)研究將進一步探討HtrA1與基質(zhì)金屬蛋白酶的表達是否存在關(guān)聯(lián)。Pfirrmann Ⅳ、Ⅴ級間HtrA1的表達無差異(P>0.05)，考慮Ⅴ級退變的椎間盤內(nèi)髓核細胞數(shù)量進一步減少，為成纖維細胞所取代，因此HtrA1的表達并未進一步提高。

近年來，有學(xué)者應(yīng)用一種新的MRI成像技術(shù)-T2*成像評價椎間盤退變，通過T2*成像掃描，對圖像進行處理分析，可以計算椎間盤某一區(qū)域的T2*值，從而量化評價椎間盤退變的程度[22- 26]。Schultz等[27]研究顯示T2*值可反映椎間盤內(nèi)生化改變，較Pfirrmann分級能更好地反映椎間盤膠原組織成分的變化，其診斷評價椎間盤退變的能力強于形態(tài)學(xué)分級。另外，本研究顯示髓核組織中HtrA1的表達水平與Pfirrmann等級具有顯著相關(guān)性，如利用T2*成像獲得髓核區(qū)域的T2*值，那么，髓核組織HtrA1的表達水平是否與髓核區(qū)域的T2值相關(guān)性更強需要后期進一步研究證實。

綜上，髓核組織HtrA1的表達水平與Pfirrmann等級相關(guān)，提示HtrA1在椎間盤退變病理過程中發(fā)揮著重要作用。但是，本研究也存在一些不足，例如，Pfirrmann Ⅰ級椎間盤僅有3例，原因在于相對正常的椎間盤來源十分困難，僅能通過年輕的骨折患者或新鮮尸體獲取，Pfirrmann Ⅴ級椎間盤僅有5例，原因在于極度嚴重退變椎間盤患者數(shù)量較少，今后需加大樣本量，進一步深入研究HtrA1表達在椎間盤退變中的作用。

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CorrelationbetweentheExpressionofHighTemperatureRequirementSerineProteaseA1inNucleusPulposusTissueandtheDegreeofIntervertebralDiscDegeneration

LI Dapeng1，WU Yan2，YUE Jiawei2，SUN Jifu1，WANG Jialun2，HUANG Yonghui1

1Department of Orthopaedics，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu 212001，China2Department of Physiology，Medical College of Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu 212013，China

HUANG Yonghui Tel：0511- 85082239，F(xiàn)ax：0511- 85029089，E-mail：huangyh8855@163.com

ObjectiveTo investigate the correlation between the expression level of high temperature requirement serine protease A1 (HtrA1) in nucleus pulposus and the degree of intervertebral disc degeneration (Pfirrmann grade).MethodsThirty-six patients who underwent excision of nucleus pulposus were examined by magnetic resonance imaging (MRI) before operation，and the Pfirrmann grading of all patients was performed according to the sagittal T2 weighted MRI.The expression of HtrA1 in nucleus pulposus tissue was detected by reverse transcription polymerase chain reaction and Western blot.The correlation between the expression level of HtrA1 in nucleus pulposus tissue and Pfirrmann grade was analyzed.ResultsMRI in all 36 patients showed that there were 3 cases of Pfirrmann grade Ⅰ，10 cases of grade Ⅱ，11 cases of grade Ⅲ，7 cases of grade Ⅳ，and 5 cases of grade Ⅴ.The mRNA and protein expressions of HtrA1 in nucleus pulposus tissue increased with the increase of Pfirrmann grade.There were significant differences in the expression level of HtrA1 among different Pfirrmann grade groups (P<0.05) except for the difference between grade Ⅳ and Ⅴ (P>0.05).Spearman rank correlation analysis revealed that there was a rank correlation between expression level of HtrA1 and Pfirrmann grade (P<0.000 1).ConclusionThe mRNA and protein expressions of HtrA1 in nucleus pulposus tissue increase with the increase of Pfirrmann grade，indicating HtrA1 is correlated with the degree of intervertebral disc degeneration.

intervertebral disc degeneration；nucleus pulposus；magnetic resonance imaging；Pfirrmann grading

ActaAcadMedSin，2017,39(6)：737-742

國家自然科學(xué)基金(81601931)、江蘇省自然科學(xué)基金(BK20150475)和鎮(zhèn)江市重點研發(fā)計劃-社會發(fā)展(SH2015085) Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (81601931)，Natural Sciences Foundation of Jiangsu Province (BK20150475)，and Key Research and Development Programs of Zhenjiang City (SH2015085)

黃永輝 電話：0511- 85082239，傳真：0511- 85029089，電子郵件：huangyh8855@163.com

R681.5+3

A

1000- 503X(2017)06- 0737- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.06.001

2016- 10- 26)