HOXA5基因轉錄起始點上游區(qū)域高甲基化水平與神經(jīng)管缺陷的關系

張 繼，田 甜，易德青，王琳琳，任愛國

北京大學生育健康研究所 衛(wèi)生部生育健康重點實驗室 北京大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學系，北京 100191

·論著·

HOXA5基因轉錄起始點上游區(qū)域高甲基化水平與神經(jīng)管缺陷的關系

張 繼，田 甜，易德青，王琳琳，任愛國

北京大學生育健康研究所 衛(wèi)生部生育健康重點實驗室 北京大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學系，北京 100191

目的探討同源異形盒基因轉錄起始點(TSS)上游區(qū)域甲基化水平與神經(jīng)管缺陷(NTDs)的關系。方法采用兩階段病例對照研究設計。第一階段選擇NTDs病例10例和對照8例作為研究對象，運用全基因組甲基化芯片檢測其腦或脊髓DNA全基因組甲基化水平。針對HOXA5基因差異甲基化區(qū)域，在第二階段擴大樣本量(52例病例和23例對照)進行驗證。提取腦或脊髓組織DNA，使用MassARRAY系統(tǒng)的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術對HOXA5基因差異性甲基化區(qū)域進行驗證。結果第一階段在全基因組甲基化芯片結果中篩選出HOXA5基因TSS上游區(qū)27個CpG位點在病例組甲基化水平高于對照組(P<0.05)。第二階段利用MassARRAY系統(tǒng)針對上述發(fā)現(xiàn)的差異區(qū)域進行檢測，成功檢測到10個可用于分析CpG位點。NTDs病例組及其亞型脊柱裂組和無腦畸形組中甲基化水平高于對照組的CpG位點數(shù)各有7、6和2個(P<0.005)。HOXA5 基因TSS上游區(qū)域病例組平均甲基化水平高于對照組[NTDs病例組：(31.3±13.9)%，對照組：(21.4±9.7)%]，調整胎兒性別和孕周后OR值為1.09(1.03～ 1.16)。結論HOXA5基因TSS上游區(qū)域高甲基化與胎兒神經(jīng)管缺陷風險增加存在關聯(lián)性。

神經(jīng)管缺陷；甲基化；HOXA5基因；轉錄起始點

神經(jīng)管缺陷(neural tube defects，NTDs)是一種由于胚胎發(fā)育早期神經(jīng)管閉合不全導致的嚴重先天畸形，脊柱裂和無腦畸形是最常見的兩種亞型[1]。NTDs病因復雜且發(fā)病機制尚不清楚，表觀遺傳學是近來最受關注的病因機制[2]。DNA甲基化是表觀遺傳學調控主要機制之一，通過在CpG位點的胞嘧啶引入甲基基團起到影響基因表達的作用，可以在不改變DNA序列的情況下造成穩(wěn)定可遺傳的表型改變。DNA甲基化受環(huán)境因素如營養(yǎng)、酒精、藥物等的影響，被認為研究環(huán)境因素通過基因非核苷酸改變所致疾病之間關系的橋梁，有研究表明全基因組及某些關鍵基因甲基化水平的異常改變可能與NTDs的發(fā)生相關[3- 5]。同源異形盒基因(homeobox genes，HOX)是一組編碼具有DNA序列特異性的轉錄因子的基因家族，在胚胎發(fā)育過程中對體軸前-后發(fā)育模式具有重要的調節(jié)作用，不同HOX基因的功能異?？蓪е麦w軸不同體節(jié)及部位的畸形[6]。本研究通過對NTDs病例病變處和對照組腦和脊髓DNA甲基化水平定量檢測探討HOXA5基因甲基化與NTDs的關系，為NTDs發(fā)生的分子機制研究提供線索。

對象和方法

對象選取2011至2014年在山西省5個縣(太谷、平定、昔陽、壽陽和澤州)募集的引產NTDs胎兒作為病例，非先天畸形引產胎兒作為對照。病例的納入標準為：(1)病例母親為當?shù)爻Ｗ【用?，且本次妊娠期間在本地居??；(2)漢族；(3)引產時間為孕12～27周；(4)不合并其他系統(tǒng)缺陷。對照組納入標準為：(1)母親為當?shù)爻Ｗ【用瘢冶敬稳焉锲陂g在本地居?。?2)漢族；(3)12～29孕周引產；(4)無缺陷。病例及對照組的排除標準為：排除母親非漢族或當?shù)爻Ｗ【用瘢加新约膊?如糖尿病、癲癇等)；患有嚴重妊娠并發(fā)癥(如妊娠高血壓、先兆子癇等)；最近1個月內服用藥物(如抗癲癇藥物)及合并其他先天缺陷胎兒樣本。所有研究對象由經(jīng)過培訓的調查員使用結構式調查表，在引產前對病例和對照組胎兒母親進行面對面詢問調查。調查內容包括一般情況和胎兒產前診斷等信息。引產胎兒排出2 h內由病理醫(yī)師按照尸體解剖操作規(guī)范，對引產胎兒進行尸體解剖，無菌條件下取材。取無腦胎兒的殘存腦組織，脊柱裂胎兒病變處脊髓組織；對照胎兒的腦組織和脊髓組織。組織采集后，立即置-80℃冰箱保存。研究通過北京大學倫理委員會審查并獲得研究對象知情同意。

方法本研究采用兩階段病例對照研究設計。第一階段，采用小樣本病例對照(10例病例和8例對照)進行全基因組甲基化檢測，找出病例組和對照組差異的高甲基化CpG位點；然后，針對目標位點，采用更大的病例對照(取52例病例和23例對照)進行驗證。最終確定與NTDs發(fā)病相關的差異化甲基化位點。

組織DNA提取：取-80℃低溫保存的病例組和對照組腦和脊髓組織標本，使用DNA提取試劑盒(DNeasy Blood & Tissue Kit，QIGEN公司)，按照試劑盒標準流程提取病例組及對照組腦和脊髓組織DNA，由NanoDrop2000超分光光度計(ND2000，Thermo Scientific 公司) 測定濃度和純度后置于-80℃保存。

第一階段全基因組甲基化水平檢測：將研究對象按納入時間進行排序，選取最早納入的10例病例，然后按照孕周(病例對照孕周相差不超過3周)和性別(病例對照性別相同)匹配對照，由于符合條件的對照樣本不足，匹配比例為1∶ 1～2∶ 1，共匹配了8例對照樣本，采用Illumina Infinium 450 k全基因組甲基化芯片檢測其腦或脊髓組織全基因組DNA甲基化水平，具體方法參考文獻[7]，實驗由上海伯豪生物技術有限公司完成。

甲基化檢測位點的預測和引物設計：使用EpiDesigner網(wǎng)站(Sequenom，http：//www.epidesigner.com)在第一階段檢測結果中有差異的區(qū)域進行第二階段HOXA5基因CpG位點的預測以及PCR引物在線設計，綜合考慮PCR產物長度、所覆蓋CpG位點數(shù)及預實驗可檢測CpG位點數(shù)選擇MassARRAY系統(tǒng)進行檢測的PCR片段。正向引物：5’- aggaagagagGGGAAGGGGGAAA-GCCATTTAGCCA- 3’；反向引物：5’-cagtaatacgactcactatag-ggagaaggctAGCTGAGAGGCAAGTGGAGTCTCCC- 3’。

待測樣本上機檢測前的預處理：待測DNA使用亞硫酸鹽轉化試劑盒(EZ DNA Methylation kit，Zymo公司)進行重亞硫酸鹽處理，將未甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶，甲基化胞嘧啶保持不變。處理后的DNA采用5 μl體系進行PCR擴增，反應條件為95℃ 4 min；45個循環(huán)，95℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 3 min。然后使用蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)孵育37℃ 20 min，85℃ 5 min純化PCR產物，使用2.5%瓊脂糖電泳確認PCR產物。使用T切割轉錄酶(T Cleavage Mix)37℃孵育3 h進行堿基特異性酶切反應(MassCLEAVE)。轉錄切割產物使用384孔微孔板進行脫鹽處理。

HOXA5轉錄起始點上游CpG位點甲基化水平定量檢測：對第一階段發(fā)現(xiàn)的差異化CpG位點所在區(qū)域(共41個檢測位點)采用MassARRAY系統(tǒng)，對52例病例和23例對照相同區(qū)域進行檢測。使用Epi-Typer軟件進行峰值檢測，信號噪聲計算和CpG位點的甲基化水平定量計算。亞硫酸鹽轉化后的未甲基化位點由于胞嘧啶轉化為尿嘧啶，與未轉化為尿嘧啶的甲基化位點之間產生相對分子質量16的差異，每個片段的相對分子質量水平可被MassARRAY系統(tǒng)以基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術進行檢測，通過檢測PCR擴增和堿基特異性酶切后的大量DNA片段，Epi-Typer軟件可通過對每個CpG位點所有檢測片段的質量密度分析得到每個CpG位點甲基化片段的相對甲基化水平。

實驗質量控制：設置完全甲基化陽性對照和零甲基化陰性對照，所有樣本重復實驗至少1次。

統(tǒng)計學處理利用PASS 11.0軟件進行第二階段樣本量的計算，選擇兩樣本均值等效性檢驗(差值)模塊，參數(shù)設置為=0.05，1-=0.9，差異限值=±3.5，均數(shù)差值=0，標準差4.0，按照2∶ 1的病例對照匹配，所需最小樣本量為44/22，結合現(xiàn)場樣本募集情況，本研究實際檢測分析的樣本量為52/23。利用SPSS 20.0軟件進行相關資料的統(tǒng)計學分析。使用χ2檢驗分析胎兒性別和孕周在病例組和對照組間的分布情況；使用成組t檢驗逐一分析全基因組甲基化檢測和MassARRAY系統(tǒng)檢測結果中各CpG位點甲基化水平在病例組和對照組間的差異是否具有統(tǒng)計學意義，第一階段全基因組檢測數(shù)據(jù)采用陽性發(fā)現(xiàn)錯誤率(positive false discovery rate，F(xiàn)DR)法進行多重校正，校正后檢驗水準要求P<0.05，第二階段MassARRAY CpG位點檢測數(shù)據(jù)采用Bonferroni法進行多重校正，校正后檢驗水準要求P<0.005；計算第二階段研究MassARRAY系統(tǒng)檢測中每個樣本10個CpG位點平均甲基化水平作為該研究區(qū)域甲基化平均水平，使用非條件多因素Logistic回歸，P<0.05為入選標準，P>0.1為剔除標準，控制胎兒性別和孕周，以OR值及其95%CI作為關聯(lián)強度指標，計算檢測區(qū)域平均甲基化水平與神經(jīng)管缺陷之間關系。Bonferroni多重校正后P<0.005為差異有統(tǒng)計學意義，其余檢驗以P<0.05判斷為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

人口學特征兩階段分別分析，病例組和對照組在胎兒性別和孕周的分布差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。第二階段的相關信息見表1。

表 1 研究對象人口學特征[n(%)]Table 1 Demographic data of subjects [n(%)]

IlluminaInfinium450kDNA甲基化芯片檢測結果使用Illumina Infinium 450 k DNA全基因組甲基化芯片檢測最先納入隊列的10例神經(jīng)管缺陷病例及8例對照腦或脊髓組織DNA甲基化水平。HOXA5轉錄起始點(transcription starts site，TSS)上游區(qū)共檢測到41個CpG位點，其中95.1%(39/41)的CpG位點病例組甲基化水平高于對照組，經(jīng)檢驗，有27個(65.9%)CpG位點在兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；另外4.9%(2/41)的CpG位點病例組甲基化水平有低于對照組的趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義(表2)。

表 2 NTDs病例對照的HOXA5基因TSS上游區(qū)域第一階段全基因組甲基化差異Table 2 Genome-wide methylation difference of TSS upper stream region within HOXA5 gene between case and control groups in the first stage

NTDs：神經(jīng)管畸形；TSS：轉錄起始點；a：采用陽性發(fā)現(xiàn)錯誤率法進行多重校正，顯著性標準為P<0.05

NTDs：neural tube defects；TSS：transcription starts site；a：positive false discovery rate was used for multiple comparison test with a significance level ofP<0.05

MassARRAY系統(tǒng)甲基化定量檢測結果根據(jù)第一階段中甲基化芯片檢測出的病例對照有差異的區(qū)域，設計MassARRAY系統(tǒng)檢測位點，經(jīng)Epidesigner網(wǎng)站設計該片段上共19個可檢測位點，10個可分析CpG位點。由于兩種方法學差異，MassARRAY系統(tǒng)設計位點中只有4個位點與450 k甲基化芯片檢測位點完全相同，分別為CpG_3、CpG_6.7、CpG_10.11 和CpG_12(圖1)。使用Bonferroni法進行多重校正，顯著性標準為0.005(0.05/10)。結果顯示，在總病例組中除CpG_8、CpG_9、CpG_10.11外，各位點甲基化水平均高于對照組，脊柱裂組中除CpG_4、CpG_5、CpG_9、CpG_13.14位點，其余各位點甲基化水平均高于對照組，無腦畸形組中CpG_4和CpG_13.14甲基化水平高于對照組(表3)。

HOXA5TSS上游區(qū)域第二階段甲基化水平與NTDs的關系所有NTDs病例組、脊柱裂組、無腦畸形組平均甲基化水平高于對照組，平均甲基化水平分別為(31.27±13.85)%、(34.00±15.88)%、(27.84±10.08)%、(21.35±9.74)%，以是否為NTDs，是否為脊柱裂，是否為無腦畸形為因變量，平均甲基化水平作為自變量探究甲基化與NTDs及其亞型的危險度的關系，在調整了胎兒性別和孕周后，總病例組及其各亞型組中HOXA5 TSS上游區(qū)域的高甲基化均與胎兒NTDs的發(fā)生相關，平均甲基化水平每增加1%(OR=1.092，95%CI=1.028～ 1.160)，NTDs風險增加9%(OR=1.105，95%CI=1.035～ 1.181)，脊柱裂風險增加11%(OR=1.083，95%CI=1.009～ 1.162)，無腦畸形風險增加8%。

討 論

NTDs的發(fā)生機制尚未研究清楚，本研究在表觀遺傳學領域探討與神經(jīng)管缺陷的發(fā)生風險相關的因素。本研究運用候選位點篩選及擴大樣本量驗證兩階段病例對照設計，通過對NTDs病例組和對照組腦/脊髓HOXA5基因TSS上游區(qū)域甲基化水平檢測，發(fā)現(xiàn)HOXA5 TSS 上游區(qū)域平均甲基化水平每增加1%，NTDs發(fā)生風險增加9%(OR=1.092，95%CI=1.028～ 1.160)。

HOX基因是一組編碼具有DNA序列特異性的轉錄因子的基因家族，其表達可調控胚胎發(fā)育和細胞的生長及分化，在哺乳動物中分為HOX A、B、C、D 4個基因簇，分別位于7、17、12、2號染色體上[8- 9]。其中橫向同源基因組1- 4表達于腦組織，基因組5- 13表達于脊柱[10]。不同HOX基因的功能缺失可以造成不同位置脊柱變形、缺失及神經(jīng)及其支配組織功能異常。

HOXA5基因位于7號染色體上A基因簇上。小鼠模型研究表明HOXA5基因表達于起源于中胚層的組織結構中，包括脊柱、自主神經(jīng)節(jié)、肺、胃、腸和腎，是細胞分化和組織特異性發(fā)育的重要調控因子，對頸椎和胸椎上段的發(fā)育尤為重要[11- 12]。HOXA5基因是一種重要的腫瘤抑制因子，其表達水平降低與非小細胞性肺癌、乳腺癌、結腸直腸癌的發(fā)生及其預后和腫瘤細胞的侵襲性相關[13- 15]，但是關于HOXA5基因在人類胚胎發(fā)育過程中的調控機制還少有研究。

UTR：非翻譯區(qū)

UTR：untranslated region

圖1甲基化芯片及MassARRAY系統(tǒng)檢測CpG位點在HOXA5基因上的分布情況

Fig1Distribution of CpG sites on HOXA5 gene detected by methylation bead chip and MassARRAY platform

表 3 NTDs各組與對照組各CpG位點病例對照甲基化水平Table 3 Methylation level on CpG sites in NTDs groups and control group(±s，%)

t1、P1：所有NTDs組與對照組比較；t2、P2：脊柱裂組與對照組比較；t3、P3：無腦畸形組與對照組比較

t1，P1：total NTDs groupvs. control group；t2，P2：spinal bifida groupvs. control group；t3，P3：anencephaly groupvs. control group

本研究通過Illumina Infinium 450 k全基因組甲基化芯片檢測和MassARRAY系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)神經(jīng)管缺陷病例組的HOXA5基因TSS上游區(qū)域甲基化水平高于對照組，脊柱裂亞型和無腦亞型組甲基化水平也高于對照組，HOXA5基因轉錄起始點上游80%～90% CpG位點也表現(xiàn)出病例組甲基化水平升高現(xiàn)象。提示HOXA5基因TSS上游區(qū)域的高甲基化可能與NTDs的發(fā)生相關。研究表明印記基因、轉座子基因、平面細胞極化通路和細胞連接通路基因的異常甲基化與NTDs的發(fā)生相關[5，7，15- 16]，目前國內外尚無HOXA5基因甲基化改變與NTDs關系的報道，僅有1篇HOX甲基化與NTDs關系的研究，此研究表明HOXB7基因低甲基化與脊髓脊膜膨出畸形的發(fā)生相關[17]，然而此篇報道的樣本來源于血液淋巴細胞，而非病變組織。

DNA甲基化會在胞嘧啶上引入一個甲基，這種改變會妨礙轉錄因子與DNA結合，同時會聚集轉錄抑制因子或組蛋白修飾復合物，促進異染色質形成，從而抑制基因的轉錄和表達[18- 19]。TSS附近區(qū)域的甲基化對基因表達的調控有重要作用[20]。小鼠模型研究表明HOXA5基因表達于神經(jīng)管和上肢發(fā)生區(qū)域，其甲基化狀態(tài)具有組織特異性且甲基化水平高的組織其表達水平顯著降低[21- 22]。提示本研究中的HOXA5基因TSS上游區(qū)域的高甲基化可能通過抑制基因的轉錄和翻譯，降低蛋白表達水平導致胎兒NTDs的發(fā)生。

本研究為探究NTDs的發(fā)生機制提供了可能的研究思路。HOXA5基因TSS上游區(qū)域高甲基化可能與NTDs的發(fā)生相關，通過對基因的表觀遺傳學干預可能有助于降低神經(jīng)管缺陷的發(fā)生?；虻谋碛^遺傳學改變是一種復雜的調控過程，受到機體內外多種因素的影響，下一步需要針對HOXA5基因甲基化的功能研究進行進一步深入探討。

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RelationshipofMethylationwithinUpperStreamRegionofTranscriptionStartsSiteofHOXA5GenewithNeuralTubeDefects

ZHANG Ji，TIAN Tian，YI Deqing，WANG Linlin，REN Aiguo

Institute of Reproductive & Child Health，Ministry of Health Key Laboratory of Reproductive Health，Department of Epidemiology and Biostatistics，School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China

WANG Linlin Tel：010- 82802976，E-mail：linlinwang@bjmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the relationship between the methylation level of transcription starts site (TSS) upper stream of homeobox gene and the neural tube defects (NTDs).MethodsA case-control study of two stages was designed. In the first stage，10 cases and 8 controls were extracted，in whom Illumina Infinium Human Methylation 450 k genome-wide beadchip was used for the quantification of DNA methylation levels of brain and spinal tissue. In the second stage，differentially methylated region within HOXA5 gene was detected with a larger numbers of samples (52 cases and 23 controls). DNA of brain or spinal tissue was extracted，and Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry technique of MassARRAY platform was employed for the validation of differentially methylated region of HOXA5 gene.ResultsIn the first stage，27 CpG sites within TSS region of HOXA5 gene were found to be significantly hyper-methylated in case group compared to control group (P<0.05). In the second stage，a total of 10 CpG sites were analyzable within the differentially methylated region in the first stage. In the NTD case group，spinal bifida subgroup，and anencephaly subgroup，there were 7，6，and 2 sites with significantly higher methylation levels than that of control group (P<0.05). The average methylation level of TSS upper stream region within HOXA5 gene was higher in case group than control group [case group：(31.3±13.9)%，control group：(21.4±9.7)%]，and the odds ratio after adjusting gender of fetus and pregnant week was 1.09 (1.03- 1.16).ConclusionHypermethylation within TSS upper stream region of HOXA5 gene in fetus is associated with a higher risk of NTDs.

neural tube defects；methylation；HOXA5 gene；transcription starts site

ActaAcadMedSin，2017,39(6)：785-791

王琳琳 電話：010- 82802976，電子郵件：linlinwang@bjmu.edu.cn

國家自然科學基金(81472987)和北京自然科學基金(7162094)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (81472987)and the Beijing Natural Sciences Foundation (7162094)

R714.7

A

1000- 503X(2017)06- 0785- 07

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.06.009

2017- 03- 27)